本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方法及其專(zhuān)用表達(dá)盒。

背景技術(shù)：

植物的種子中含有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪，且有便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。油菜種子中蛋白質(zhì)含量高，是進(jìn)行外源重組蛋白表達(dá)的理想植物材料。利用轉(zhuǎn)基因油菜來(lái)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)具有生產(chǎn)成本低,純化過(guò)程簡(jiǎn)單、技術(shù)含量低,規(guī)?；菀?蛋白質(zhì)含量高、產(chǎn)品質(zhì)量高,安全無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn),并且可以在溫室條件下,各方面均優(yōu)于細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生產(chǎn)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了表達(dá)盒Ⅰ。

本發(fā)明所提供的表達(dá)盒Ⅰ自上游至下游依次可包括如下元件：植物種子特異表達(dá)蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因Ⅰ和終止序列；

所述融合基因Ⅰ中可含有區(qū)段乙；所述區(qū)段乙編碼目的物或目的物的前體；所述目的物可為蛋白質(zhì)或多肽。

所述融合基因Ⅰ中，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子，中間為連續(xù)的編碼區(qū)。

所述目的物的前體在生物體中可自發(fā)形成目的物。

所述融合基因Ⅰ還可包括區(qū)段甲；所述區(qū)段甲編碼篩選標(biāo)記蛋白。

所述融合基因Ⅰ還可包括一個(gè)以上區(qū)段丙；所述區(qū)段丙編碼蛋白標(biāo)簽。

當(dāng)融合基因Ⅰ中包括2個(gè)以上區(qū)段丙時(shí)，每個(gè)區(qū)段丙可以編碼不同的蛋白標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅰ還可包括區(qū)段?。凰鰠^(qū)段丁可為切割物質(zhì)的識(shí)別序列。

所述融合基因Ⅰ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、所述區(qū)段丁和所述區(qū)段乙。所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。

所述目的物可為鮭魚(yú)降鈣素。所述目的物的前體可為鮭魚(yú)降鈣素的前體。

所述區(qū)段乙可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列4自5′末端起第34至132位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列4自5′末端起第34至132位所示的DNA分子；

b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且編碼所述鮭魚(yú)降鈣素的前體的DNA分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述鮭魚(yú)降鈣素的前體的DNA分子。

所述表達(dá)盒Ⅰ的核苷酸序列具體可如序列表中序列5所示。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了表達(dá)盒Ⅱ。

本發(fā)明所提供的表達(dá)盒Ⅱ自上游至下游依次可包括如下元件：植物種子特異表達(dá)蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因Ⅱ和終止序列；所述融合基因Ⅱ中可含有區(qū)段戊；所述區(qū)段戊為供編碼目的物或目的物的前體的基因插入的插入位點(diǎn)；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽。

所述融合基因Ⅱ中，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子，中間為連續(xù)的編碼區(qū)。

所述融合基因Ⅱ還可包括區(qū)段甲；所述區(qū)段甲編碼篩選標(biāo)記蛋白。

所述融合基因Ⅱ還可包括一個(gè)以上區(qū)段丙；所述區(qū)段丙編碼蛋白標(biāo)簽。

當(dāng)融合基因Ⅱ中包括2個(gè)以上區(qū)段丙時(shí)，每個(gè)區(qū)段丙可以編碼不同的蛋白標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅱ還可包括區(qū)段??；所述區(qū)段丁可為切割物質(zhì)的識(shí)別序列。

所述融合基因Ⅱ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、所述區(qū)段丁和所述區(qū)段戊。所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。

所述目的物可為鮭魚(yú)降鈣素。所述目的物的前體可為鮭魚(yú)降鈣素的前體。

含有上述任一所述表達(dá)盒Ⅰ的重組載體Ⅰ，或，含有上述任一所述表達(dá)盒Ⅱ的重組載體Ⅱ也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體Ⅰ可為重組質(zhì)粒丙。所述重組質(zhì)粒丙和所述重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的唯一不同在于：將重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300中鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(序列表中序列4自5′末端起第34至132位)替換為編碼目的物或目的物的前體的基因。

所述重組載體Ⅰ具體可為重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300為將載體pCAMBIA2300的限制性內(nèi)切酶SacⅠ和HindⅢ識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列5所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300表達(dá)序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)。

所述重組載體Ⅰ具體可為重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300和重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ的唯一不同在于：重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(即sCT基因)為序列表中序列4自5′末端起第34至132位所示，重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ的鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(即sCT-DZ基因)為序列表中序列8自5′末端起第34至132位所示。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ表達(dá)序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)。

上述任一所述植物種子特異表達(dá)蛋白基因的啟動(dòng)子可為菜豆儲(chǔ)存蛋白(GenBank號(hào)為X52626.1)基因的啟動(dòng)子。所述菜豆儲(chǔ)存蛋白(GenBank號(hào)為X52626.1)基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可如序列表中序列5自5′末端起第1至1619位所示。

上述任一所述篩選標(biāo)記蛋白可為GUS蛋白。所述GUS蛋白的核苷酸序列如序列表中序列3自5′末端起第34至1839位所示。

上述任一所述終止序列可為植物種子特異表達(dá)蛋白基因的終止子。所述植物種子特異表達(dá)蛋白基因的終止子可為菜豆儲(chǔ)存蛋白(GenBank號(hào)為X52626.1)基因的終止子。所述菜豆儲(chǔ)存蛋白(GenBank號(hào)為X52626.1)基因的終止子的核苷酸序列具體可如序列表中序列5自5′末端起第3609至4213位所示。

上述任一所述切割物質(zhì)可為滿足如下條件的切割物質(zhì)：所述切割物質(zhì)對(duì)于所述融合基因Ⅰ或融合基因Ⅱ的表達(dá)產(chǎn)物的酶切位置為特定氨基酸殘基與其前一位氨基酸殘基之間；所述特定氨基酸殘基為目的物的第一個(gè)氨基酸殘基。

上述任一所述切割物質(zhì)具體可為甲酸。

上述任一所述區(qū)段丁的核苷酸序列可為序列表中序列5自5′末端起第3465至3491位所示。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了表達(dá)目的物的方法。

本發(fā)明所提供的表達(dá)目的物的方法，具體可為方法一，依次可包括如下步驟：

(1)在上述任一所述重組載體Ⅱ中的所述區(qū)段戊插入目的基因，得到含有目的基因的重組載體；所述目的基因?yàn)榫幋a所述目的物或所述目的物的前體的基因；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽；

(2)將含有目的基因的重組載體導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；

(3)通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到所述目的物。

上述步驟(1)中，“在上述任一所述重組載體Ⅱ中的所述區(qū)段戊插入目的基因”是在不影響基因的編碼框的前提下進(jìn)行的。

本發(fā)明所提供的表達(dá)目的物的方法，具體可為方法二，依次可包括如下步驟：

(1)將上述任一所述重組載體Ⅰ導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；

(2)通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到目的物；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽。

上述方法中，所述受體植物具體可為油菜品種中雙4號(hào)。

上述方法中，所述目的物存在或主要存在于轉(zhuǎn)基因植物的種子中。

上述方法中，所述“培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到目的物”還依次可包括如下步驟：

(4)取轉(zhuǎn)基因植物的種子，脫脂后提取粗蛋白；

(5)利用所述蛋白標(biāo)簽從所述粗蛋白中純化所述融合蛋白；

(6)取步驟(5)得到的融合蛋白，用切割物質(zhì)進(jìn)行切割；

(7)從步驟(6)的產(chǎn)物中分離目的物；

(8)醋酸化；

(9)脫鹽。

上述方法中，所述步驟(4)中，所述“脫脂”的步驟可為：先粉碎轉(zhuǎn)基因植物的種子，然后用正己烷脫脂。所述粉碎的程度可為200目。

上述方法中，所述步驟(4)中，所述“提取粗蛋白”可為用含8-12mg/mL蔗糖和1.5-2.5mg/mL SDS的pH6.5-7.0、0.1-0.3M Tris-Hcl緩沖液進(jìn)行提取。

上述方法中，所述步驟(4)中，所述“提取粗蛋白”具體可為用含10mg/mL蔗糖和2.0mg/mL SDS的pH6.8、0.2M Tris-Hcl緩沖液進(jìn)行提取。

上述方法中，所述步驟(5)中，所述蛋白標(biāo)簽可為6×His標(biāo)簽。

上述方法中，所述步驟(6)中，所述切割物質(zhì)可為甲酸。

上述方法中，所述步驟(7)中，所述“分離目的物”可采用陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行分離。

上述方法中，所述步驟(8)中，所述醋酸化的步驟可為：調(diào)節(jié)步驟(7)分離的目的物的pH值至1.0-3.0，然后加入醋酸鈉處理40-80min。

上述方法中，所述步驟(8)中，所述醋酸化的步驟具體可為：取步驟(7)分離的目的物，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，得到溶液1；取1體積份溶液1，加入3體積份濃度為333mM的醋酸鈉水溶液，得到溶液2；取所述溶液2，室溫放置60min。

上述方法中，所述步驟(9)中，所述脫鹽可為反相色譜脫鹽。

上述方法中，完成步驟(9)后，還可包括凍干的步驟。

上述方法中，所述目的物可為鮭魚(yú)降鈣素。

上述任一所述鮭魚(yú)降鈣素的前體可為氨基酸序列如序列表中序列6自N末端起第623至655位所示的蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)證明，將重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300或重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ導(dǎo)入油菜品種中雙4號(hào)，得到轉(zhuǎn)基因植物，然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步得到鮭魚(yú)降鈣素。因此，利用本發(fā)明所提供的方法可以表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1步驟二8中(1)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例1步驟二8中(2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例1中步驟三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4為實(shí)施例1中步驟四的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

油菜品種中雙4號(hào)記載于如下文獻(xiàn)中：羅曉輝，葉明海.“中雙4號(hào)”育苗移栽高產(chǎn)栽培[J].上海農(nóng)業(yè)科技，1999年05期.在下文中，油菜品種中雙4號(hào)簡(jiǎn)稱中雙4號(hào)。

下述實(shí)施例中的光暗交替培養(yǎng)(即光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)交替)的條件為：25℃。光照培養(yǎng)時(shí)的光照強(qiáng)度為15000Lx。光暗交替培養(yǎng)的周期具體為：14h光照培養(yǎng)/10h黑暗培養(yǎng)。

MS₀培養(yǎng)基：將NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄ 170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、Fe SO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA 37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、K I 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、煙酸0.5mg、甘氨酸2.0mg和瓊脂7g溶于1L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至5.8。

載體pUC57為百奧邁科生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為BK0033。λDNA/EcoRI+HindⅢMarker為北京康潤(rùn)生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為M125-01。粉碎機(jī)為紹興市科宏儀器有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為EW-100。鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品為北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成。密鈣息為Novartis Pharma Stein AG公司的產(chǎn)品。載體pCAMBIA2301為華越洋生物(北京)科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為VECT0310。

菜豆儲(chǔ)存蛋白的GenBank號(hào)為X52626.1。

實(shí)施例1、利用轉(zhuǎn)基因油菜種子表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鮭魚(yú)降鈣素

一、重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的構(gòu)建

1、人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列1中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶SacⅠ的識(shí)別序列，第7至1625位為菜豆儲(chǔ)存蛋白的啟動(dòng)子的核苷酸序列，第1626至1631位為限制性內(nèi)切酶KpnⅠ的識(shí)別序列。

2、用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切步驟1合成的雙鏈DNA分子，回收1631bp的DNA片段甲。

3、用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切載體pCAMBIA2301，回收約11.6bp的載體骨架甲。

4、將DNA片段甲和載體骨架甲進(jìn)行連接，得到中間載體甲。

5、人工合成序列表中序列2所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列2中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列，第7至611位為菜豆儲(chǔ)存蛋白的終止子的核苷酸序列，第612至617位為限制性內(nèi)切酶HindⅢ的識(shí)別序列。

6、用限制性內(nèi)切酶PstI和HindⅢ雙酶切步驟5合成的雙鏈DNA分子，回收617bp的DNA片段乙。

7、用限制性內(nèi)切酶PstI和HindⅢ雙酶切中間載體甲，回收約13.2Kb的載體骨架乙。

8、將DNA片段乙和載體骨架乙進(jìn)行連接，得到中間載體乙。

9、人工合成序列表中序列3所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列3中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶KpnⅠ的識(shí)別序列，第7至9位為起始密碼子ATG(編碼甲硫氨酸)，第10至33位為編碼8×His標(biāo)簽的核苷酸序列，第34至1839位為編碼GUS蛋白的核苷酸序列(已按油菜偏愛(ài)密碼子對(duì)GUS蛋白的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化)，第1840至1845位為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列。

10、用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHI雙酶切步驟9合成的雙鏈DNA分子，回收1845bp的DNA片段丙。

11、用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHI雙酶切中間載體乙，回收約13.8kb的載體骨架丙。

12、將DNA片段丙和載體骨架丙進(jìn)行連接，得到中間載體丙。

13、人工合成序列表中序列4所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列4中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識(shí)別序列，第7至33位為甲酸切割的識(shí)別序列，第34至132位為鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱sCT基因)，第133至144位為四個(gè)終止密碼子，第145至150位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列。

14、將步驟13合成的雙鏈DNA分子連接至載體pUC57，得到重組質(zhì)粒psCT。

15、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstI雙酶切重組質(zhì)粒psCT，回收150bp的DNA片段丁。

16、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstI雙酶切中間載體丙，回收約15.6kb的載體骨架丁。

17、將DNA片段丁和載體骨架丁進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pCAMBIA2300的限制性內(nèi)切酶SacⅠ和HindⅢ識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列5所示的DNA分子。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300表達(dá)序列表中序列6所示的融合蛋白甲。

序列表中序列5中，自5′末端起第1至1619位菜豆儲(chǔ)存蛋白的啟動(dòng)子的核苷酸序列，第1620至1625位為限制性內(nèi)切酶KpnⅠ的識(shí)別序列，第1626至1628位為起始密碼子ATG(編碼甲硫氨酸)，第1629至1652位為編碼8×His標(biāo)簽的核苷酸序列，第1653至3458位為編碼GUS蛋白的核苷酸序列，第3459至3464位為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列，第3465至3491位為甲酸的識(shí)別序列，第3492至3590位為鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱sCT基因)，第3591至3602位為四個(gè)終止密碼子，第3603至3608位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列，第3609至4213位為菜豆儲(chǔ)存蛋白的終止子的核苷酸序列。

序列表中序列6中，自N末端起第1位為甲硫氨酸，第2至9位為8×His標(biāo)簽，第10至611位為GUS蛋白，第614至622位為甲酸的識(shí)別位點(diǎn)，第623至655位為鮭魚(yú)降鈣素的前體。

二、油菜遺傳轉(zhuǎn)化

1、農(nóng)桿菌侵染液的制備

(1)采用電擊法將重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pPha(p/gc/t)2300。

(2)將LBA4404/pPha(p/gc/t)2300的單克隆接種至5mL含100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)和50mg/L利福平(Rifampicin，Rif)的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)菌液1。

(3)將1mL培養(yǎng)菌液1接種至50mL含100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD_600nm值為0.3～0.4，得到培養(yǎng)菌液2。

(4)取步驟(3)得到的培養(yǎng)菌液2，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體1。

(5)取步驟(4)收集的菌體1，用含1.0mg/L 6-BA的MS₀培養(yǎng)基重懸，然后4℃、5000rpm離心5min，收集菌體2。

(6)取步驟(5)收集的菌體2，用含100mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)的MS₀培養(yǎng)基重懸，得到農(nóng)桿菌侵染液。以含100mg/L As的MS₀培養(yǎng)基為參照，調(diào)整農(nóng)桿菌侵染液的OD_600nm值至0.15～0.25。

2、中雙4號(hào)的子葉的獲得

取中雙4號(hào)的種子，先用75％(v/v)的乙醇水溶液浸泡2min，然后用次氯酸鈉水溶液(由1體積份次氯酸鈉溶液(有效氯≥10.0)和4體積份水混合而成)浸泡10min，最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，瀝干后接種于MS₀培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)5d，得到中雙4號(hào)的材料。

取中雙4號(hào)的材料，剪取子葉(盡量靠近生長(zhǎng)點(diǎn))，得到中雙4號(hào)的子葉。

3、侵染

取步驟2獲得的中雙4號(hào)的子葉，置于離心管，然后加入農(nóng)桿菌侵染液(OD_600nm值為0.2)浸泡10min。

4、共培養(yǎng)

完成步驟3后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)共培養(yǎng)4d。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：含1.25mg/L NAA、5.0mg/L 6-BA和5.0mg/L AgNO₃的MS₀培養(yǎng)基。

共培養(yǎng)條件：25℃，暗培養(yǎng)。

5、選擇培養(yǎng)

完成步驟4后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4d。

選擇培養(yǎng)基：含1.0mg/L NAA、3.0mg/L 6-BA和100mg/L頭孢噻吩(cefalotin，Cf)的MS₀培養(yǎng)基。

6、分化培養(yǎng)

完成步驟5后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4周，得到長(zhǎng)約1cm的分化芽。

分化培養(yǎng)基：含0.2mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、40mg/L Kan、100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

7、生根培養(yǎng)

完成步驟6后，將所述分化芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)2周，獲得擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜。

生根培養(yǎng)基：含100mg/L Kan和100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

隨機(jī)選擇7株擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜，依次命名為GCt1至GCt7。

8、分子檢測(cè)

(1)PCR檢測(cè)

分別提取步驟7獲得的7株擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜葉片的基因組DNA并作為模板，以GC5：5'-ACCGATACCATCAGCGATC-3'和GC3：5'-GTTCCAGATCCGGTGTTAG-3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用等體積超純水代替擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。用等體積重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的DNA代替擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(泳道1為λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2為GCt1，泳道3為GCt2，泳道4為GCt3，泳道5為GCt4，泳道6為GCt5，泳道7為GCt6，泳道8為GCt7)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA為模板，能夠擴(kuò)增出約570bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜即為轉(zhuǎn)sCT基因油菜；陰性對(duì)照不能獲得570bp的條帶；陽(yáng)性對(duì)照可以獲得570bp的條帶。

(2)RT-PCR檢測(cè)

菜豆儲(chǔ)存蛋白是種子中特異表達(dá)的蛋白，一般在開(kāi)花后4-6周的種子中開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，9-11周的種子中mRNA的含量達(dá)到最高水平，種子的成熟后期的mRNA含量急劇降低。

(a)提取待測(cè)油菜(GCt1、GCt2、GCt3、GCt4、GCt5、GCt6或GCt7)開(kāi)花后9-11周的種子的總RNA，然后該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到待測(cè)油菜的cDNA。待測(cè)油菜的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。

(b)以步驟(a)得到的待測(cè)油菜的cDNA為模板，以GC5：5'-ACCGATACCATCAGCGATC-3'和GC3：5'-GTTCCAGATCCGGTGTTAG-3'為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用等體積超純水代替待測(cè)油菜的cDNA，作為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2(泳道1為λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2為GCt1，泳道3為GCt2，泳道4為GCt3，泳道5為GCt4，泳道6為GCt5，泳道7為GCt6)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的cDNA為模板，能夠擴(kuò)增出約570bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜即為轉(zhuǎn)sCT基因油菜，說(shuō)明sCT基因已經(jīng)整合到中雙4號(hào)的基因組，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)；陰性對(duì)照不能獲得570bp的條帶。

PCR檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果完全一致。因此，GCt1、GCt2、GCt3、GCt4、GCt5、GCt6和GCt7均為轉(zhuǎn)sCT基因油菜。

待GCt1成熟后收集種子，然后進(jìn)行繁育和PCR檢測(cè)，直至獲得純合種子。將該純合種子命名為GCt1種子，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、鮭魚(yú)降鈣素的提取和純化

1、脫脂

(1)取步驟二收集的GCt1種子，用粉碎機(jī)(粉碎程度200目)粉碎，得到油菜籽粉。

(2)將油菜籽粉和正己烷按照1:10(1g/10mL)的比例混勻，得到混合物甲；將混合物甲置于密封玻璃的容器中室溫?cái)嚢?h，然后棄上清，收集殘?jiān)住?/p>

(3)將殘?jiān)缀驼和榘凑?:10(1g/10mL)的比例混勻，得到混合物乙；將混合物乙置于密封玻璃的容器中室溫?cái)嚢?h，然后棄上清，收集殘?jiān)摇?/p>

(4)將殘?jiān)液驼和榘凑?:10(1g/10mL)的比例混勻，得到混合物丙；將混合物丙置于密封玻璃的容器中室溫?cái)嚢?h，然后棄上清，收集殘?jiān)?/p>

(5)將殘?jiān)鋬鲲L(fēng)干，即為脫脂的油菜籽粉。

2、提取

(1)取離心管(規(guī)格為50mL)，加入100mg脫脂的油菜籽粉和20mL含10％(10mg/mL)蔗糖和2％(2mg/mL)SDS的pH6.8、0.2M Tris-Hcl緩沖液，充分混勻，4℃攪拌9h。

(2)完成步驟(1)后，取所述離心管，4℃、20000rpm離心60min。收集上清液。上清液即為GCt1種子蛋白的粗提物。

3、His-tag初步純化

鎳離子螯合磁珠的商品名稱為BeaverBeads^TM IDA-Ni cke l，具體為蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為70501-5。

Buffer A為含500mM NaCl和10mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

Buffer B為含500mM NaCl和50mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

Buffer C為含500mM NaCl和500mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

(1)取10mL步驟2收集的上清液和10mL Buffer A，充分混勻；然后加入2mL磁珠懸浮液，充分懸浮后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上溫育30min；最后通過(guò)磁性分離，將鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

磁珠懸浮液的制備方法為：取2mL鎳離子螯合磁珠，加入5mL Buffer A，用移液器輕輕吹打數(shù)次得到的懸浮液。

(2)完成步驟(1)后，取裝有鎳離子螯合磁珠的離心管，加入10mL Buffer B，用移液器輕輕吹打數(shù)次，然后通過(guò)磁性分離，將鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次。

(4)完成步驟(3)后，取裝有鎳離子螯合磁珠的離心管，加入5mL Buffer C，用移液器輕輕吹打數(shù)次，然后通過(guò)磁性分離，收集上清液。

(5)將步驟(4)收集的上清液利用分子量為10kD MW的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，獲得融合蛋白乙的濃縮液。

鮭魚(yú)降鈣素主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。通過(guò)基因工程法生產(chǎn)鮭魚(yú)降鈣素，主要是在大腸桿菌或酵母中表達(dá)鮭魚(yú)降鈣素，但由于鮭魚(yú)降鈣素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表達(dá)出的鮭魚(yú)降鈣素的生物學(xué)活性僅為100-200U/mg；而天然的鮭魚(yú)降鈣素的生物學(xué)活性為4500U/mg。已有研究結(jié)果表明，鮭魚(yú)降鈣素的前體(氨基酸序列如序列表中序列6自N末端起第623至655位所示)通過(guò)植物自身的酰胺化系統(tǒng)，可轉(zhuǎn)化為鮭魚(yú)降鈣素。

融合蛋白乙氨基酸序列如序列表中序列7所示，且其C末端酰胺化。融合蛋白乙在轉(zhuǎn)sCT基因油菜體內(nèi)經(jīng)過(guò)如下轉(zhuǎn)化得到：轉(zhuǎn)sCT基因油菜中首先表達(dá)融合蛋白甲，之后通過(guò)自身的酰胺化系統(tǒng)，將融合蛋白甲轉(zhuǎn)化為C末端酰胺化的融合蛋白乙。

4、甲酸切割

(1)取融合蛋白乙的濃縮液，加入無(wú)菌水和甲酸，得到反應(yīng)體系；反應(yīng)體系中，融合蛋白乙的濃度為1mg/mL，甲酸的濃度為37％(v/v)。

(2)完成步驟(1)后，取所述反應(yīng)體系，45℃切割2.5h。

5、陽(yáng)離子交換純化

將完成步驟4的體系在AKTA蛋白純化系統(tǒng)上經(jīng)陽(yáng)離子交換層析純化，得到鮭魚(yú)降鈣素溶液。具體步驟如下：

(1)將1體積份完成步驟4的體系和3體積份pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液混合，得到混合液(電導(dǎo)率為7mS/cm)；然后將混合液用0.22μM的濾膜過(guò)濾，得到上樣液。

(2)取SP-Sepharose fast flow(5×1mL)(美國(guó)GE公司的產(chǎn)品)，先用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液預(yù)平衡(流速為1mL/min)。

(3)完成步驟(2)后，取步驟(1)得到的上樣液，進(jìn)行上樣(流速為0.5mL/min)。

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液洗脫(流速為1mL/min)至紫外檢測(cè)基線平穩(wěn)(檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm)。

(5)完成步驟(4)后，用含400mM NaCl的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫(流速為0.5mL/min)，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

6、醋酸化

(1)取步驟5收集的洗脫溶液，先加入磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，得到溶液1。

(2)取1體積份溶液1，加入3體積份濃度為333mM的醋酸鈉水溶液，混合均勻，得到溶液2。

(3)取所述溶液2，室溫放置60min，得到溶液3。

7、反相色譜脫鹽及凍干

Amberchrom CG300md resin為北京慧德易科技有限責(zé)任公司的產(chǎn)品。

(1)取Amberchrom CG300md resin，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫(流速為5mL/min)至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

(2)完成步驟(1)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫(流速為5mL/min)至pH值基線平穩(wěn)。

(3)完成步驟(2)后，取步驟6得到的溶液3，進(jìn)行上樣(流速2mL/min)。

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫(流速為5mL/min)至pH值基線平穩(wěn)。

(5)完成步驟(4)后，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫(流速為5mL/min)至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

(6)完成步驟(5)后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脫(流速為2mL/min)，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

(7)用冷凍干燥機(jī)將步驟(6)收集的洗脫溶液凍干至粉末，即鮭魚(yú)降鈣素粉末。-20℃?zhèn)溆谩?/p>

取1mg鮭魚(yú)降鈣素粉末，加入1mL超純水溶解，得到鮭魚(yú)降鈣素溶液。

將鮭魚(yú)降鈣素溶液和濃度為1mg/mL鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液進(jìn)行SDS-PAGE。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(1為蛋白Marker，2為鮭魚(yú)降鈣素溶液，3為鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液)。結(jié)果表明，鮭魚(yú)降鈣素溶液中含有鮭魚(yú)降鈣素，純度約90％。每10g步驟二收集的GCt1種子產(chǎn)生0.2mg鮭魚(yú)降鈣素(以100％純度計(jì))。

四、鮭魚(yú)降鈣素的HPLC檢測(cè)

使用配有Agilent Zorbax SB C18柱(5.0μm，150mm×2.1mm)的Agilent 1200液相色譜儀分析步驟三中的鮭魚(yú)降鈣素溶液和濃度為1mg/mL的鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液。進(jìn)樣量20μL。流動(dòng)相由0.1％(v/v)三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)水溶液(A液)和0.1％(v/v)TFA乙腈溶液(B液)組成，流速為0.2mL/min，使用流動(dòng)相中B液遞增、A液遞減的梯度洗脫條件進(jìn)行梯度洗脫，具體如下(％均為體積百分比)：0-8min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由10％勻速升至30％；8-50min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由30％勻速升至55％；50-55min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由55％勻速升至100％。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4(A為鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，B為步驟三中的鮭魚(yú)降鈣素溶液)：步驟三中的鮭魚(yú)降鈣素溶液與鮭魚(yú)降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的目的峰出峰時(shí)間基本一致(見(jiàn)圖4中箭頭標(biāo)注，出峰時(shí)間為5.8min)。結(jié)果表明，步驟三中的鮭魚(yú)降鈣素溶液中含有鮭魚(yú)降鈣素。

五、檢測(cè)鮭魚(yú)降鈣素的生物學(xué)活性

Vr:CD1(ICR)小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。鈣測(cè)定試劑盒為北京中生北控生物科技股份有限公司的產(chǎn)品。

1、取30只體重為24-26g的健康Vr:CD1(ICR)小鼠，隨機(jī)分成鮭魚(yú)降鈣素組、密鈣息組和生理鹽水組(每組10只，雌雄各半)，禁食10-12h(僅給蒸餾水)后，分別進(jìn)行如下處理：

鮭魚(yú)降鈣素組：尾靜脈注射步驟三中的鮭魚(yú)降鈣素溶液(注射劑量為0.1mL/只)；

密鈣息組：尾靜脈注射密鈣息(注射劑量為0.5IU/只)；

生理鹽水組：尾靜脈注射0.9％(0.9mg/100mL)生理鹽水(注射劑量為0.1mL/只)。

2、完成步驟1 60min后，每只小鼠先腹腔注射10％(10mg/100mL)水合氯醛水溶液(注射劑量為0.15mL/只)，再分別從眼眶取血，室溫靜置2h；最后3000g離心15min，上清液即為血清。

3、完成步驟2后，取血清，按照鈣測(cè)定試劑盒的操作步驟，用全自動(dòng)生化分析測(cè)定每只小鼠的血鈣濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，密鈣息組小鼠的血鈣濃度比生理鹽水組降低26.09％，鮭魚(yú)降鈣素組小鼠的血鈣濃度比生理鹽水組降低25.45％，方差分析差異極顯著。因此，使用步驟一至步驟三的方法獲得的鮭魚(yú)降鈣素溶液具有降低血鈣的生物學(xué)活性。

表1

實(shí)施例2、利用轉(zhuǎn)基因油菜種子表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鮭魚(yú)降鈣素

按照實(shí)施例1步驟一至步驟三的方法，將步驟一中的重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300替換為重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ，其它步驟均不變，得到鮭魚(yú)降鈣素溶液；每10g油菜種子產(chǎn)生0.15mg鮭魚(yú)降鈣素(以100％純度計(jì))。

重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ的構(gòu)建方法為：按照實(shí)施例1步驟一的方法，將步驟13中“人工合成序列表中序列4所示的雙鏈DNA分子”替換為“人工合成序列表中序列8所示的雙鏈DNA分子”，其它步驟均不變，得到重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ也表達(dá)序列表中序列6所示的融合蛋白甲。

序列表中序列8中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識(shí)別序列，第7至33位為甲酸的識(shí)別序列，第34至132位為鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱sCT-DZ基因)，第133至144位為四個(gè)終止密碼子，第145至150位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列。重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ和重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的唯一不同在于：重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300的鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(即sCT基因)為序列表中序列4自5′末端起第34至132位所示，重組質(zhì)粒pPha(p/gc/t)2300-DZ的鮭魚(yú)降鈣素的前體的編碼基因(即sCT-DZ基因)為序列表中序列8自5′末端起第34至132位所示。

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120> 一種表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方法及其專(zhuān)用表達(dá)盒

<160> 8

<170> PatentInversion3.5

<210>1

<211>1631

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagctcgaat tcattgtact cccagtatca ttatagtgaa agttttggct ctctcgccgg 60

tggtttttta cctctattta aaggggtttt ccacctaaaa attctggtat cattctcact 120

ttacttgtta ctttaatttc tcataatctt tggttgaaat tatcacgctt ccgcacacga 180

tatccctaca aatttattat ttgttaaaca ttttcaaacc gcataaaatt ttatgaagtc 240

ccgtctatct ttaatgtagt ctaacatttt catattgaaa tatataattt acttaatttt 300

agcgttggta gaaagcataa agatttattc ttattcttct tcatataaat gtttaatata 360

caatataaac aaattcttta ccttaagaag gatttcccat tttatatttt aaaaatatat 420

ttatcaaata tttttcaacc acgtaaatct cataataata agttgtttca aaagtaataa 480

aatttaactc cataattttt ttattcgact gatcttaaag caacacccag tgacacaact 540

agccattttt ttctttgaat aaaaaaatcc aattatcatt gtattttttt tatacaatga 600

aaatttcacc aaacaatcat ttgtggtatt tctgaagcaa gtcatgttat gcaaaattct 660

ataattccca tttgacacta cggaagtaac tgaagatctg cttttacatg cgagacacat 720

cttctaaagt aattttaata atagttacta tattcaagat ttcatatatc aaatactcaa 780

tattacttct aaaaaattaa ttagatataa ttaaaatatt acttttttaa ttttaagttt 840

aattgttgaa tttgtgacta ttgatttatt attctactat gtttaaattg ttttatagat 900

agtttaaagt aaatataagt aatgtagtag agtgttagag tgttacccta aaccataaac 960

tataacattt atggtggact aattttcata tatttcttat tgcttttacc ttttcttggt 1020

atgtaagtcc gtaactagaa ttacagtggg ttgccatggc actctgtggt cttttggttc 1080

atgcatgggt cttgcgcaag aaaaagacaa agaacaaaga aaaaagacaa aacagagaga 1140

caaaacgcaa tcacacaacc aactcaaatt agtcactggc tgatcaagat cgccgcgtcc 1200

atgtatgtct aaatgccatg caaagcaaca cgtgcttaac atgcacttta aatggctcac 1260

ccatctcaac ccacacacaa acacattgcc tttttcttca tcatcaccac aaccacctgt 1320

atatattcat tctcttccgc cacctcaatt tcttcacttc aacacacgtc aacctgcata 1380

tgcgtgtcat cccatgccca aatctccatg catgttccaa ccaccttctc tcttatataa 1440

tacctataaa tacctctaat atcactcact tctttcatca tccatccatc cagagtacta 1500

ctactctact actataatac cccaacccaa ctcatattca atactactct actatgatga 1560

gagcaagggt tccactcctg ttgctgggaa ttcttttcct ggcatcactt tctgcctcat 1620

ttgccggtac c 1631

<210>2

<211>617

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctgcagataa gtatgaacta aaatgcatgt atggtgtaag agcacatgga gagcatggaa 60

atatgtatcc gaccatgtaa cactataata actgtgctcc atctcacttc ttctatgaat 120

aaacaaagga tgttatgata tattaacact atatgcacct tcacaagtaa tacattaata 180

tttaatactt tttattttaa ctttttagtt taaaatatta ttatattatt aactttttag 240

tttaaaatat ttatattatt ataaagagaa ataaacaaag gatgttatga tatattaaca 300

ctatatgtac cttacatagt aatatattaa tatttaatac tttttatttt aactttttaa 360

tttaaaatat tattataaat gacgcttgtg ttttatgtgt tggcatgctt gtattttatg 420

tgttgacttt ctgtgtgaag gtaatgtgat atggtgagct ggtggtaaca attgtgtttt 480

atgtgttggc tttctgtgaa gctaatttga tatggttagc tgatgtgaac aaaatattaa 540

aggaagctaa tttgatatgg ttagccgata gtaacaaaat atcaaaataa atttcttctt 600

actttaataa aaagctt 617

<210>3

<211>1845

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggtaccatgc atcatcacca ccatcaccat cacttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt 60

gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt 120

gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt 180

tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag 240

cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg 300

gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat aatcaggaag tgatcgagca tcagggcggc 360

tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc 420

accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg cagactatcc cgccgggagc tgtgattacc 480

gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc 540

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<212>DNA

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<223>

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