本發(fā)明屬于芥藍(lán)育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種創(chuàng)制耐熱芥藍(lán)種質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

芥藍(lán)(Brassica oleracea var.alboglabra Bailey)為十字花科蕓薹屬蔬菜作物，起源于中國(guó)(瓦維洛夫,1935),原產(chǎn)中國(guó)南部(中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所,1956)，最早對(duì)芥藍(lán)進(jìn)行分類研究的Bailey (1922)所用的研究材料就來(lái)自廣州。芥藍(lán)為華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜之一，具有色澤翠綠、質(zhì)地脆嫩和營(yíng)養(yǎng)豐富的特征。近年來(lái)，已經(jīng)被我國(guó)北方很多地區(qū)引種，并取得了成功，是中國(guó)優(yōu)質(zhì)創(chuàng)匯蔬菜之一。但芥藍(lán)耐高溫的能力比較差，一般都是在秋冬季栽培，早春可以栽培，初夏之際由于溫度比較高，雖然在高溫下也能生長(zhǎng)，但產(chǎn)量低、品質(zhì)變差。如果通過(guò)基因工程方法，創(chuàng)制耐熱芥藍(lán)種質(zhì)，進(jìn)而選育出耐高溫的芥藍(lán)新品種，則在高溫條件下也能種植，可大大提高芥藍(lán)栽培的經(jīng)濟(jì)效益。

高溫脅迫是一種常見的非生物脅迫，植物在適應(yīng)高溫的過(guò)程中，進(jìn)化出了一套嚴(yán)密的耐高溫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。多蛋白橋接因子1（Multi-protein Bridging Factor 1, MBF1）是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄共激活子，該基因家族中的MBF1c是一個(gè)關(guān)鍵的耐熱性調(diào)節(jié)因子，它在提高植物抗高溫脅迫方面的能力尤為突出，在該基因的控制之下存在著一個(gè)緊密協(xié)調(diào)的熱應(yīng)激反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，包括海藻糖，水楊酸和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因此，可以通過(guò)超表達(dá)芥藍(lán)BaMBF1c，創(chuàng)制耐熱的芥藍(lán)種質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種創(chuàng)制耐熱芥藍(lán)的方法，該方法通過(guò)構(gòu)建含有BaMBF1c的重組載體，以及芥藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化，可以獲得耐熱性增強(qiáng)的芥藍(lán)種質(zhì)，對(duì)芥藍(lán)新品種的選育有重要價(jià)值。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。

一種創(chuàng)制耐熱芥藍(lán)種質(zhì)的方法，包括如下步驟：

S1. 構(gòu)建含有如SEQ ID NO:1所示MBF1c基因的重組超表達(dá)載體；

S2. 將S1得到的重組超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；

S3. 用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染芥藍(lán)外植體，經(jīng)培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選得到耐熱芥藍(lán)。

S1所述MBF1c基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，開放閱讀框長(zhǎng)(ORF)447bp。

進(jìn)一步地，所述超表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：

S11. 利用超表達(dá)引物擴(kuò)增得到MBF1c基因的ORF全長(zhǎng)；

S12. 將S11克隆的片段連接到pBE-GFP載體，制得MBF1c基因的重組超表達(dá)載體。

進(jìn)一步地，所述引物如SEQ ID NO:3~4所示，分別為：

MBF1-yxb –F: CGCGGGCCCGGGATCCATGCCGAGCAGAT；

MBF1-yxb –R: GGCGACCGGTGGATCCTTGACATGTTT。

進(jìn)一步地，所述連接方法采用infusion技術(shù)。

進(jìn)一步地，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染芥藍(lán)外植體前，將所述芥藍(lán)外植體放入分化培養(yǎng)基中，于25℃黑暗預(yù)培養(yǎng)2d。

進(jìn)一步地，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染芥藍(lán)外植體后培養(yǎng)步驟如下：

S31. 外植體侵染后接種至分化培養(yǎng)基中，在25±1℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)2d；

S32. 抑菌培養(yǎng)：接種于抑菌培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)3～5d；

S33. 篩選培養(yǎng)：接種于卡那霉素篩選培養(yǎng)基上，每?jī)芍芾^代一次，繼代2～3次，直到只有少許外植體能在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出抗性芽，而大部分外植體在含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上褪綠，變黃白化為止；

S34. 生根培養(yǎng)：當(dāng)分化的不定芽伸長(zhǎng)至1.5～2.5 cm時(shí)，將其自基部切下，接種于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，煉苗2～3 d，移栽獲得抗性芥藍(lán)苗。

上述分化培養(yǎng)基、抑菌培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基采用芥藍(lán)組培領(lǐng)域常見的培養(yǎng)基即可。

進(jìn)一步地，所述重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染芥藍(lán)外植體時(shí)的OD₆₀₀為0.4~0.8，轉(zhuǎn)染時(shí)間為9min。

進(jìn)一步地，所述卡那霉素濃度為10mg/L。

進(jìn)一步地，所述芥藍(lán)外植體為無(wú)菌帶柄子葉和下胚軸。

進(jìn)一步地，所述無(wú)菌帶柄子葉和下胚軸獲得方法為：將芥藍(lán)種子經(jīng)75%酒精、2%次氯酸鈉消毒后，用無(wú)菌水浸泡，倒去無(wú)菌水，吸去種子表面的水分，在25～28℃黑暗條件下培養(yǎng)2d，然后把種子取出放到25℃、光照2000 lx 14 h/d培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待芥藍(lán)小苗子葉展平時(shí)切下子葉和下胚軸即可。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果在于：提供了一種創(chuàng)制耐熱芥藍(lán)種質(zhì)的方法，該方法通過(guò)構(gòu)建含有耐熱相關(guān)轉(zhuǎn)錄輔激活因子MBF1c的重組載體，創(chuàng)制出耐熱性增強(qiáng)的材料，對(duì)芥藍(lán)新品種的選育有重要價(jià)值。本發(fā)明經(jīng)過(guò)2~3代篩選，獲得抗性芥藍(lán)，T₀代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率達(dá)47.1%。

附圖說(shuō)明

圖1為BaMBF1c組織特異性分析。

圖2為熱脅迫后BaMBF1c的表達(dá)分析。

圖3為重組質(zhì)粒酶切檢測(cè)圖。

圖4為BaMBF1c-pBE轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌桿菌EHA105后菌落PCR檢測(cè)。

圖5為BaMBF1c的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖6為T0代轉(zhuǎn)化苗PCR檢測(cè)。

圖7為T0代轉(zhuǎn)化苗RT-PCR檢測(cè)。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1 矮腳香菇芥藍(lán)DNA的提取及BaMBF1c克隆

以25號(hào)矮腳香菇芥藍(lán)葉片為材料，用改良的CTAB法提取DNA，步驟如下：

(1)取0.2~0.5g材料，加液氮磨成粉，將磨好的材料轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，加1mL含0.1%巰基乙醇(V/V)預(yù)熱的2% CTAB提取液，充分混勻，置于65℃水浴45 min，期間不斷搖動(dòng)；

(2)10000rpm離心5min；

(3)冷卻至室溫，取上清液，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕搖動(dòng)至溶液成乳化狀，10000rpm離心5min；

(4)取上清液，重復(fù)步聚(3)1次；

(5)取上清液，加入2/3體積的異丙醇，-20℃放置30 min；

(6)10000 rpm離心5 min，棄上清液，70%乙醇清洗沉淀2~3次；

(7)加入200 μLTE溶解沉淀，加入1/10體積NaAC(3mol/L)和2倍體積無(wú)水乙醇，-30℃放1 h；

(8)12000 rpm 離心5 min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2~3次，室溫干燥沉淀；

(9)用60 μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，得到所需的DNA樣品，-30℃保存；

(10)取1 μLDNA樣品稀釋至50倍，在Biophotometer核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD_260/OD₂₃₀值，記錄結(jié)果，判斷DNA的濃度和純度；

(11)取2 μL所提的DNA樣品，用1.0％的凝膠，電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。

BaMBF1c DNA全長(zhǎng)克隆

已知擬南芥AtMBF1c基因序列，甘藍(lán)基因組測(cè)序已經(jīng)完成，且與芥藍(lán)基因組相似性很高，可以通過(guò)同源比對(duì)，在甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)中調(diào)取MBF1c基因序列，并在在其開放閱讀框兩端設(shè)計(jì)特異PCR引物，以芥藍(lán)DNA為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)片段，連T載體后，挑取單克隆測(cè)序，獲得BaMBF1c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

MBF1c全長(zhǎng)擴(kuò)增引物：

MBF1c全長(zhǎng)(711bp)-up TCGAACTCTCCAGAAACTCGT

MBF1c全長(zhǎng)(711bp)-dw CGTTTGCCAGATACGATGT

擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

DNA 模板1 μL，10×cDNA PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 m mol /L）2 μL，上游引物 1 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH₂O 17.25 μL，總體積25.0 μL。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40min，35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5 min。

實(shí)施例2 BaMBF1c表達(dá)分析

采用半定量PCR和qRT-PCR的方法進(jìn)行表達(dá)分析。

芥藍(lán)熒光內(nèi)參引物

Tublin-F： CTTCTTTCGTGCTCATTTTGCC

Tublin-R： CCATTCCCTCGTCTCCACTTCT

MBF1c熒光特異引物

MBF1c YG1-UP ：GTTAACGCGGCTCTCAGAAG

MBF1c YG1-DW ：TCCTCCAGCTTCTTCGTGTT

1.BaMBF1c組織特異性表達(dá)分析

田間取樣，抽薹后，未開花前，分別取38號(hào)芥藍(lán)（中花芥藍(lán)）的老葉、成熟葉、嫩葉、葉脈、葉柄、第一二節(jié)薹、第三四節(jié)薹、花薹外皮、花蕾、老根、嫩根，提RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后做qRT-PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，以tublin為內(nèi)參，取三個(gè)生物重復(fù)。結(jié)果（圖1）表明，老根的BaMBF1c表達(dá)量最大，其次是葉脈，嫩根中表達(dá)量相對(duì)較低，其他組織表達(dá)量相差不大。

2.熱脅迫對(duì)BaMBF1c表達(dá)的影響

用25號(hào)矮腳香菇芥藍(lán)作材料，苗期4-6片真葉時(shí)，37℃分別處理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h后，取葉片提RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后做qRT-PCR和半定量PCR，取三個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，以tublin為內(nèi)參。結(jié)果見圖2，結(jié)果表明BaMBF1c在熱脅迫后表達(dá)量急劇上升，隨后呈下降趨勢(shì)，隨著處理時(shí)間的增加又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明與耐熱密切相關(guān)。

qRT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板 1.0 μL、10 μL 2×SYBR GreenI MIX、10 μmol L^-1正向引物0.2 μL、10 μmol L^-1反向引物 0.2 μL，加水至總體積達(dá)到20 μL。

PCR程序：94℃ 2 min；94℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物用融解曲線分析， BIO-RAD 公司的IQ5軟件收集數(shù)據(jù)。各基因在不同材料之間的相對(duì)表達(dá)量用CT值的2^-△△CT法處理獲得（Livak et al,2001）。

半定量PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板 1.0 μL、2×Taq Mix（Vazyme）10 μL，10 μmol L^-1正向引物0.2 μL、10 μmol L^-1反向引物 0.2 μL，加水至總體積達(dá)到20 μL。

PCR程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，Tublin 26個(gè)循環(huán)；MBF1c 28個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例3 構(gòu)建BaMBF1c超表達(dá)載體

1.BaMBF1c超表達(dá)片段的克隆

根據(jù)實(shí)施例1中BaMBF1c基因全長(zhǎng)的測(cè)序結(jié)果，在其ORF區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物，上游引物從起始密碼子開始，下游引物5’端除去終止密碼子及其前一個(gè)堿基，并在兩端添加16個(gè)堿基的pBE-GFP載體的同源臂，pBE-GFP載體通過(guò)BamH I單酶切線性化，擴(kuò)增的目的片段為475bp。

（1）特異引物：

MBF1-yxb –F CGCGGGCCCGGGATCCATGCCGAGCAGAT

MBF1-yxb -R GGCGACCGGTGGATCCTTGACATGTTT

（2）擴(kuò)增體系：

質(zhì)粒DNA模板 1.0 μL、2×Taq Mix（Vazyme）10 μL，10 μmol L^-1正向引物0.5 μL、10 μmol L^-1反向引物 0.5μL，加水至總體積達(dá)到50 μL。

（3）反應(yīng)條件

94℃，3 min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.pBE-GFP載體的線性化

采用堿裂解法提取大腸桿菌中的pBE-GFP空質(zhì)粒，然后用BamH I單酶切pBE-GFP空質(zhì)粒，37℃酶切過(guò)夜。酶切體系如下：10×buffer（K）2μL，質(zhì)粒DNA 10 μL，BamH I1μL，加ddH₂O至20 μL，混勻。

3.pBE-GFP空質(zhì)粒和目的片段的連接

取酶切好的質(zhì)粒和目的片段，利用Takara的in-Fusion酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系如下：in-Fusion酶2 μL，目的片段2μL，質(zhì)粒載體1μL，加ddH₂O 至10μL，混勻。50℃連接15min，在PCR儀中進(jìn)行。

4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌

創(chuàng)制DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，Km 100mg/L LB平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天挑取單菌落用含Km 100 mg/L LB液體37℃搖菌過(guò)夜，菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用BamH I酶切檢測(cè)(圖3)，酶切條帶正確的送公司測(cè)序。插入正確片段的載體命名為pBE-GFP-BaMBF1c。

5.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

（1）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞

1）取新鮮創(chuàng)制的或-70℃保存的200μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞懸?。?/p>

2）加入5μL CaMS1 pFGC5941-B質(zhì)?；靹蚝蟊戏胖?0 min；

3）將離心管放入液氮中速凍5 min，37℃水浴中熱激1 min，迅速將轉(zhuǎn)至冰上，冰浴2 min；

4）加入1 mL YEP液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)1 h；

5）4000 rpm離心5 min，留100 μL YEP培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；

6）將菌液涂布于含有Km 100 mg/L＋Str 100 mg/L 的YEP平板上，28 ℃培養(yǎng)24-48 h。

（2）重組子鑒定

挑取長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出目的片段（圖4），說(shuō)明植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，-80℃保存?zhèn)溆糜诮嫠{(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pBE-GFP-BaMBF1c轉(zhuǎn)化芥藍(lán)

（1）無(wú)菌芥蘭外植體的獲得

首先挑選飽滿、粒大的芥藍(lán)種子用無(wú)菌水沖洗2-3次，去除雜質(zhì)，然后用75%酒精消毒90s，無(wú)菌水沖洗2～3遍，然后用2%次氯酸鈉溶液消毒9 min（期間不斷搖動(dòng)），用無(wú)菌水洗3次，再用無(wú)菌水浸泡5 min，最后倒去無(wú)菌水，用滅菌濾紙吸去種子表面殘留水分，播種在1/2 MS培養(yǎng)基中，置于人工培養(yǎng)室培養(yǎng)。25～28℃黑暗條件下培養(yǎng)， 2d即可以觀察到下胚軸冒出，然后把種子取出放到溫度27℃左右、光照2000 lx 14 h/d培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待芥藍(lán)小苗子葉展平時(shí)即可制取外植體，從種子播種到可以創(chuàng)制外植體大約需要5d左右。

（2）預(yù)培養(yǎng)

培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 mg/L 硝酸銀+30%蔗糖+0.6%瓊脂（PH5.8）；外植體分別為下胚軸（約1cm）和帶柄子葉；暗培養(yǎng)2d。

（3）農(nóng)桿菌侵染及共培養(yǎng)

侵染前4d取出保存于-80℃的超低溫冰箱中的含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，于YEP固體培養(yǎng)基上（Str 100 mg/L，Km 100 mg/L）劃平板，28℃恒溫培養(yǎng)24～48h。挑取單菌落置于10mL含Str 100mg/L、Km 100mg/L和AS 200mg/L的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃下200rpm振蕩過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)至50mL YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4~0.8。

芥藍(lán)外植體預(yù)培養(yǎng)2d后，在超凈工作臺(tái)上用準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液浸染9min，期間不時(shí)搖動(dòng)，然后放于經(jīng)高溫高壓滅菌的濾紙上吹至半干，再接種到芥藍(lán)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 mg/L 硝酸銀+30%蔗糖+0.6%瓊脂+ 100um/L AS（PH5.8）每瓶接種30個(gè)左右的外植體，并在(25±1)℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)2~d。

（4）抑菌培養(yǎng)

將共培養(yǎng)2d芥藍(lán)外植體接種于抑菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 mg/L 硝酸銀+30%蔗糖+0.6%瓊脂+ 300mg/L cef（PH5.8），光下培養(yǎng)，下胚軸抑菌培養(yǎng)5d，子葉抑菌培養(yǎng)3d（光照14h/d）；

（5）篩選培養(yǎng)

外植體抑菌培養(yǎng)之后，接種于篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+7.0 mg/L 硝酸銀+30%蔗糖+ 0.6%瓊脂+ 300mg/L cef +10mg/L Ka（PH5.8），光下培養(yǎng)15d（光照14h/d），每?jī)芍芾^代一次，繼代2～3次。直到只有少許外植體能在篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出抗性芽，而大部分外植體在含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上褪綠，變黃白化為止。

（6）生根培養(yǎng)

當(dāng)分化的不定芽伸長(zhǎng)至1.5左右cm時(shí)，將其自基部切下，接種于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根，培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.2 mg/L NAA +30%蔗糖+0.6%瓊脂（PH5.8）。

（7）煉苗：當(dāng)根的條數(shù)大于5條，長(zhǎng)度大于1.5cm，且幼苗高度大于4cm時(shí)，打開瓶蓋，注意在瓶口罩上一次性塑料手套，25度恒溫箱中煉苗。

（8）移栽：煉苗2-3d后，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽或者花盆中，注意將根上的培養(yǎng)基充分洗凈，剛移出的苗子注意覆蓋塑料薄膜，每天掀開透氣2h，至長(zhǎng)出新葉后即可置于室外培養(yǎng)，如圖5所示。

實(shí)施例5 BaMBF1c超表達(dá)芥藍(lán)的分子生物學(xué)鑒定

1. T₀代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

（1）引物序列

根據(jù)目的基因和GFP基因設(shè)計(jì)引物序列：

PBE-GFP-F：TCCTAACCAGGCCGTACTTG；

PBE-GFP-R：TCACTTGATGCCGTCTTCTG。

（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

DNA 模板1 μL，10×DNA PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10μmol/L）1 μL，下游引物（10μmol/L）1 μL，rTaq酶 0.25 μL，ddH₂O 17.25 μL，總體積25.0 μL。

（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。

（4）PCR陽(yáng)性率及轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

提取實(shí)施例4轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，用Pbe-GFP基因的特異引物對(duì)51株轉(zhuǎn)BaMBF1c基因的抗性芥藍(lán)苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性植株能夠擴(kuò)增出約為570bp的目的條帶（圖6），陽(yáng)性苗一共24株，PCR陽(yáng)性率為47.1%，初步證明超表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入芥藍(lán)。

2. T₀代轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測(cè)

（1）引物序列

根據(jù)GFP基因設(shè)計(jì)引物序列：

GFP-F：TAAACGGCCACAAGTTCAGC；

GFP-R：CTGGGTGCTCAGTAGTGGTT 。

（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

cDNA 模板1 μL，10×DNA PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10μmol/L）1 μL，下游引物（10μmol/L）1 μL，rTaq酶 0.25 μL，ddH₂O 17.25 μL，總體積25.0 μL。

（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。

選取3株P(guān)CR檢測(cè)陽(yáng)性苗提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA做模板，用GFP基因的特異引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性植株能夠擴(kuò)增出約為550bp的目的條帶（圖7），三株陽(yáng)性苗都能檢測(cè)到GFP基因的表達(dá)，說(shuō)明MBF1c-GFP融合基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入芥藍(lán)植株內(nèi)，并且能夠正常表達(dá)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種制備耐熱芥藍(lán)品種的方法

<130> 1613341ZBTX037-D

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 707

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgaactctc cagaaactcg tctccttata taaagacctc tcctcccagc gacgccttca 60

tcgttctcaa tttcagaaac ttatcattat tatcatctct ctgagacatc aagttttaaa 120

caacagcgac gatgccgagc agatacccag gagccgtgac gcaagactgg gagccagtgg 180

tgctccacaa aactaagcca aagagccaag acctccgtaa tcccaaggcg gttaacgcgg 240

ctctcagaag cggcttagcg gttcagacgg tgaagaaatt cgacgccggt tcgaacaaga 300

aggggaaatc gacggctgtg ccggtgatca acacgaagaa gctggaggaa gagacggagc 360

cgtcggcgat ggatagggtg aaagcggagg tgaggctagc gatacagaaa gctcggttgg 420

agaagaagat gtcacaagcg gatctagcga aacagatcaa cgagcggaca caggtggttc 480

aagaatacga aaacgggaaa gctgttccta accaggccgt acttgccaag attgagaagg 540

ttctaggtgt taaactcagg ggtaaacatg tcaaataatt caaaacgatg ccgtctctgg 600

tttcgttctt ccttcttttg ggtgcacatc ttcctattct caatcttatg aatataaata 660

ataacgcttt tggcttcgta ttcaaacgac atcgtatctg gcaaacg 707

<210> 2

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Ser Arg Tyr Pro Gly Ala Val Thr Gln Asp Trp Glu Pro Val

1 5 10 15

Val Leu His Lys Thr Lys Pro Lys Ser Gln Asp Leu Arg Asn Pro Lys

20 25 30

Ala Val Asn Ala Ala Leu Arg Ser Gly Leu Ala Val Gln Thr Val Lys

35 40 45

Lys Phe Asp Ala Gly Ser Asn Lys Lys Gly Lys Ser Thr Ala Val Pro

50 55 60

Val Ile Asn Thr Lys Lys Leu Glu Glu Glu Thr Glu Pro Ser Ala Met

65 70 75 80

Asp Arg Val Lys Ala Glu Val Arg Leu Ala Ile Gln Lys Ala Arg Leu

85 90 95

Glu Lys Lys Met Ser Gln Ala Asp Leu Ala Lys Gln Ile Asn Glu Arg

100 105 110

Thr Gln Val Val Gln Glu Tyr Glu Asn Gly Lys Ala Val Pro Asn Gln

115 120 125

Ala Val Leu Ala Lys Ile Glu Lys Val Leu Gly Val Lys Leu Arg Gly

130 135 140

Lys His Val Lys

145

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgaactctc cagaaactcg t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtttgccag atacgatgt 19

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcgggcccg ggatccatgc cgagcagat 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcgaccggt ggatccttga catgttt 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gttaacgcgg ctctcagaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcctccagct tcttcgtgtt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttctttcgt gctcattttg cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccattccctc gtctccactt ct 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcctaaccag gccgtacttg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcacttgatg ccgtcttctg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taaacggcca caagttcagc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgggtgctc agtagtggtt 20