本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種采用兩個(gè)關(guān)鍵酶基因FPS和DBR2共轉(zhuǎn)化的青蒿及其制備方法，該青蒿具有提高的青蒿素含量。

背景技術(shù)：

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯化合物——青蒿素，是目前應(yīng)用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對(duì)腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)是世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量很低，尚無法完全滿足全球的市場(chǎng)需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(non-glandular trichomes)。在青蒿葉片的近軸面和遠(yuǎn)軸面、莖稈、花上都大量存在分泌型腺毛，這里是大量次生代謝物的合成和累積場(chǎng)所，青蒿素也被認(rèn)為合成和儲(chǔ)存于此處。

目前，青蒿素的主要來源是從植物青蒿中提取獲得，作為青蒿中重要的一種植物次生代謝產(chǎn)物，其在青蒿中的含量非常低，大約為青蒿葉片干重的0.1％-1％，且青蒿素含量與青蒿品種、季節(jié)、生長環(huán)境、生長時(shí)期等密切相關(guān)。極低的生物含量與極大的市場(chǎng)需求，導(dǎo)致青蒿素價(jià)格居高不下。

雖然目前通過合成生物學(xué)化學(xué)半合成青蒿素獲得較大突破，將青蒿素生物合成途徑中的多步關(guān)鍵酶基因?qū)虢湍富蚪M，成功在酵母中獲得高產(chǎn)量的青蒿酸，青蒿酸再在體外經(jīng)過化學(xué)方法合成獲得青蒿素，該方法在實(shí)驗(yàn)室階段獲得成功，但是通過酵母發(fā)酵半合成前期設(shè)備成本較大，維護(hù)較難，且產(chǎn)量有限，不能完全滿足市場(chǎng)需求。因此通過雜交育種，分子育種，基因工程育種等生物技術(shù)手段提高植物青蒿中青蒿素含量的方法仍然具有很大的競(jìng)爭(zhēng)力和應(yīng)用價(jià)值。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種基因工程方法，打破青蒿素生物合成限速瓶頸，從而獲得青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高青蒿中青蒿素含量的方法及青蒿植株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，在一個(gè)具體實(shí)施方式中，該方法將法尼基焦磷酸合酶FPS基因和青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶DBR2基因共轉(zhuǎn)化青蒿。

進(jìn)一步地，F(xiàn)PS基因的序列如SEQ ID No.1所示，DBR2基因的序列如SEQ ID No.2所示。

進(jìn)一步地，該方法包括步驟：

1)采用基因克隆方法獲得FPS基因和DBR2基因；

2)將所述FPS基因和DBR2基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體；

3)將所述含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；

4)將含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

進(jìn)一步地，步驟2)中，含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建包括如下步驟：分別將FPS基因和DBR2基因連接到中間載體上，經(jīng)過雙酶切后將FPS基因和DBR2基因分別連入表達(dá)載體上，獲得CaMV 35S-FPS-nos和CaMV 35S-DBR2-nos表達(dá)盒；通過無縫克隆技術(shù)將CaMV 35S-FPS-nos和CaMV 35S-DBR2-nos表達(dá)盒連入另一表達(dá)載體中，獲得所述植物雙元表達(dá)載體。

優(yōu)選地，中間載體為pMD18T，表達(dá)載體為pCAMBIA1304，另一表達(dá)載體為pCAMBIA2300。

進(jìn)一步地，步驟3)中，采用凍融法將上述植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。

進(jìn)一步地，步驟4)中，根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，包括外植體培養(yǎng)；根癌農(nóng)桿菌菌株與外植體的共培養(yǎng)；抗性再生植株的篩選。其中外植體培養(yǎng)中，當(dāng)青蒿無菌苗長至1.8-2.2cm時(shí)，剪取無菌苗葉片外植體。

進(jìn)一步地，該方法還包括步驟5)，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中的青蒿素含量進(jìn)行高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定，獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

優(yōu)選地，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定包括：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為甲醇：水，其中，甲醇：水的體積比為60：40，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40℃，載氣壓力5bar。

本發(fā)明的另一方面提供了一種青蒿素含量提高的青蒿，該青蒿中共轉(zhuǎn)化有FPS基因和DBR2基因。

本發(fā)明采用基因工程手段，將FPS基因和DBR2基因共轉(zhuǎn)化青蒿，增強(qiáng)了青蒿的代謝途徑，打破青蒿素生物合成限速瓶頸，從而獲得青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施中的雙元表達(dá)載體p2300：FPS+DBR2的載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施中的獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因青蒿株系中目的基因PCR檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M為DL 2000DNA marker，C為空白對(duì)照；P為質(zhì)粒；1-8或1-7為樣品；

圖3本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施的青蒿中青蒿素含量檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、青蒿FPS和DBR2基因的克隆

法尼基焦磷酸合酶(FPS)是催化IPP，DMAPP縮合生成FPP的關(guān)鍵酶，F(xiàn)PP是植物中各類萜類物質(zhì)的共同前體，也是青蒿素的前體物質(zhì)。DBR2酶將青蒿醛催化成二氫青蒿醛。

1.青蒿基因組總RNA的提取

取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA濃度與純度。

2.青蒿FPS和DBR2基因的克隆

以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA；根據(jù)所述青蒿FPS基因的編碼序列(SEQ ID No.1所示)，和DBR2基因的編碼序列(SEQ ID No.2所示)，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整的編碼框的上下游引物(FPS-SpeI-FP:GGACTAGTATGAGTAGTACCGATCTGAAATC,FPS-BstEII-RP:GGGTTACCCTACTTTTGCCTCTTGTAAATT,DBR2-SpeI-FP:GGACTAGTATGTCTGAAAAACCAACCTTG,DBR2-BstEII-RP:GGGTTACCCTAGAGGAGTGACCCTTTG)，并在上游和下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SpeI和BstEII，以便構(gòu)建表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，擴(kuò)增引物可以根據(jù)情況有所變化，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)也可以根據(jù)后續(xù)適用載體的不同而有所變化。

通過PCR從總cDNA中擴(kuò)增FPS和DBR2基因并測(cè)序。DNA測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的青蒿FPS基因的編碼序列(SEQ ID No.1所示)和DBR2基因的編碼序列(SEQ ID No.2所示)的編碼序列一致。

實(shí)施例2、含F(xiàn)PS和DBR2基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建

1、中間載體pMD18T-FPS、pMD18T-DBR2的構(gòu)建

選用pMD18T載體(Takara,Dalian)作為克隆載體，構(gòu)建中間載體pMD18T-FPS、pMD18T-DBR2。具體地，通過使用高保真酶分別擴(kuò)增FPS、DBR2基因全長，引物序列如表1所示。同時(shí)在FPS、DBR2基因兩側(cè)分別引入SpeI和BstEII酶切位點(diǎn)。將帶有酶切位點(diǎn)的全長基因通過T4連接酶連接到pMD18T載體上，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2、植物基因表達(dá)盒CaMV 35S-FPS-nos、CaMV 35S-DBR2-nos的構(gòu)建

以pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將FPS、DBR2分別連入其對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)位置。具體地，分別用SpeI和BstEII雙酶切中間載體pMD18T-FPS、pMD18T-DBR2以及表達(dá)載體pCAMBIA1304，純化FPS、DBR2片段以及pCAMBIA1304大片段。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取單克隆，做PCR菌液檢測(cè)單克隆，陽性單克隆送測(cè)序。測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。此方法可獲得FPS、DBR2的基因表達(dá)盒：CaMV 35S-FPS-nos、CaMV 35S-DBR2-nos。

3、植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300+FPS+DBR2的構(gòu)建

將以上構(gòu)建的CaMV 35S-FPS-nos、CaMV 35S-DBR2-nos表達(dá)盒依次連接于表達(dá)載體pCAMBIA2300中即可得到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300+FPS+DBR2。具體地，應(yīng)用無縫克隆技術(shù)將CaMV 35S-FPS-nos、CaMV 35S-DBR2-nos表達(dá)盒連入pCAMBIA2300的EcoRI和PstI酶切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，測(cè)序。引物序列如表1所示，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。構(gòu)建的雙元表達(dá)載體示意圖如圖1所示。

表1 PCR引物

表2 PCR的反應(yīng)體系

本實(shí)施例將青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因FPS和DBR2可操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成FPS和DBR2基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。

實(shí)施例3、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)FPS和DBR2基因遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)基因植株

1.含F(xiàn)PS和DBR2基因植物表達(dá)載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得

將實(shí)施例2中含F(xiàn)PS和DBR2的植物表達(dá)載體采用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambar 1)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，含F(xiàn)PS和DBR2的植物表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌菌株中。

在采用凍融法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中時(shí)，在冰浴融化的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入植物表達(dá)載體后，先在42℃水浴30秒，然后轉(zhuǎn)到37℃水浴5分鐘，能更將轉(zhuǎn)化率提高大約25％。

2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)FPS和DBR2基因轉(zhuǎn)化青蒿

2.1.外植體的預(yù)培養(yǎng)

青蒿種子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡10min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養(yǎng)基中，25℃、16h/8h(光/暗)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至2cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。

2.2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)

將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含F(xiàn)PS和DBR2的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28℃暗培養(yǎng)3天。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。

2.3.抗性再生植株的篩選

將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。

在2.2步驟農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)中，意外的發(fā)現(xiàn)當(dāng)在活化好的含F(xiàn)PS和DBR2的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液中加入2％的PEG2000，再與外植體充分接觸共培養(yǎng)時(shí)，能得到更多的Kan抗性再生青蒿植株，相對(duì)于不添加PEG2000的共培養(yǎng)獲得的Kan抗性再生青蒿植株多約20％。

3.轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測(cè)

根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒上游的35S啟動(dòng)子區(qū)域和FPS、DBR2分別設(shè)計(jì)正向引物設(shè)計(jì)(35SF：GACGTAAGGGATGACGCACAATCCC)和反向引物(FPSR：CAGGGTTGCCCTCTGCGTGTATG，DBR2R：AGCTAGTCTTGACCCTAATTTAAATTG)對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。

本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含F(xiàn)PS和DBR2植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

實(shí)施例4、利用HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系統(tǒng)，使用Waters C18柱，青蒿素測(cè)定流動(dòng)相使用甲醇：水體積比60％：40％；柱溫為30℃，流速為1.0mL/min；ELSD檢測(cè)系統(tǒng)為water alliance 2420，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為40℃，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar；青蒿素出峰時(shí)間為7min左右。青蒿素進(jìn)樣體積為20uL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積計(jì)算出樣品中的青蒿素含量，再除以青蒿粉末干重，從而計(jì)算出青蒿素占樣品干重的含量。精密稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.樣品的制備

選取4株青蒿植株，在青蒿植株的上、中和下部共取新鮮的青蒿葉片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后從烘干的枝條上敲下葉片，磨成粉末。稱取約0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL甲醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心10min，取上清用0.22μm濾膜過濾，即可用于HPLC測(cè)定。

本發(fā)明中共轉(zhuǎn)化FPS和DBR2基因顯著提高了青蒿中青蒿素的含量，結(jié)果如圖3所示。共轉(zhuǎn)化FPS和DBR2基因青蒿中青蒿素的含量最高可達(dá)到26.8mg/g DW，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿(mg/g DW)的3.36倍。

本實(shí)施例采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器HPLC-ELSA法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量，采用共轉(zhuǎn)化FPS和DBR2基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)模化生產(chǎn)青蒿素提供了一種理想方法。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 上海交通大學(xué)

<120> 共轉(zhuǎn)FPS和DBR2基因提高青蒿素含量的方法及制備的青蒿

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 1

atgagtagca tcgatctgaa atccaagttt ttaaaagtgt atgatacact taaatcagag 60

cttattaacg atcccgcctt cgaattcgac gatgattccc gtcaatggat tgaaaagatg 120

cttgactaca acatacctgg aggaaagctg aaccggggat tatctgttgt cgacagttat 180

cagcttctta aaggaggaga actgtctgat gacgagattt ttctttcatc tgcccttggt 240

tggtgtattg aatggcttca agcatacttt cttgtgcttg atgatataat ggacgagtct 300

catacacgca gagggcaacc ctgttggttt agattactca aggttggtat gattgctgcg 360

aacgatggaa ttcttcttcg caaccatgtc ccaagaattc ttaagaaaca tttccgtgga 420

aagccttact atgaggatct tgtggacctg ttcaacgagg ttgaattcca aacagcctct 480

ggtcagatga ttgatttgat cactacactt gttggagaga aagatctctc gaagtattca 540

ttgtctattc accgccgaat tgttcaatac aaaacagctt actactcatt ttaccttcca 600

gttgcctgtg cactccttat gtttggagag gatcttgaca agcacgttga agtgaagaac 660

atgctcgttg aaatgggtac ctattttcaa gttcaggacg attatctaga ctgttttggt 720

gctcccgagg tgattggaaa gattggaact gatattgaag actttaagtg ctcctggtta 780

gttgtcaagg cattggaact cgccaatgag gaacaaaaga aagtcctaca tgagaactat 840

gggaaaaagg accccgcgtc tgttgctaaa gtgaaggaag tataccacac tctcaatctt 900

caggctgtat tcgaagatta cgaggccaca agttacaaga agcttatcac atcgattgaa 960

aatcgcccaa gcaaagcagt ccaagcggtg ctgaaatctt tcttgggtaa aatctacaag 1020

aggcaaaagt ag 1032

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 青蒿（Artemisia annua L.）

<400> 2

atgtctgaaa aaccaacctt gttttctgcc tacaagatgg gcaagttcaa tctttctcac 60

agggtggtgt tagctcctat gactcggtgt cgggcaataa acgctatacc gaacgaagcg 120

cttgtcgaat attatcggca aagatcaact gctggtggct ttcttattac cgaggggact 180

atgatctctc cttcttctgc cgggtttccg cacgtaccgg gtatttttac taaggaacaa 240

gtcgagggtt ggaaaaaagt ggttgatgca gctcacaaag aaggggctgt gatattttgt 300

caattgtggc atgttggtag agcatcccat caagtgtacc aacccggtgg tgctgcgcca 360

atatcatcaa caagcaagcc catttcaaag aagtgggaaa tattattgcc agatgcaacc 420

tatggcacgt atcctgagcc ccgtccattg gcagccaatg aaatactaga ggtggttgaa 480

gactatcgcg ttgcagctat taatgctatt gaagcaggtt ttgatggcat tgaaatacat 540

ggagcacatg gttatctact tgaccagttc atgaaagatg gcataaatga cagaacggac 600

gaatatggtg ggtcattaga aaaccgctgc aaattcatac tgcaagtagt gcaagcggta 660

tctgcagcca ttggtacaga ccgagttggt attagaatct cccctgcaat cgatcacaca 720

gatgctatgg actctgatcc acgaagccta ggccttgcag taattgaaag actcaacaaa 780

ctacaattta aattagggtc aagactagct tatcttcatg taactcaacc acgttacacg 840

gctgatggtc atggtcaaac agaagcggga gccaatggaa gtgaggagga agtagctcag 900

ttgatgaaaa catggagagg agcttatgtg ggaactttta tatgctgcgg tggttacact 960

agagaacttg ggttacaagc tgtggctcaa ggggatgctg atttggtcgc ttttggtcgt 1020

tattttgtct cgaatcctga ccttgtttta agacttaagc tcaacgcacc tttaaatagg 1080

tatgacagag ctacttttta tacccatgat cctgtcgttg ggtacacgga ttacccttct 1140

cttgacaaag ggtcactcct ctag 1164

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPS-SpeI-FP

<400> 3

ggactagtat gagtagtacc gatctgaaat c 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPS-BstEII-RP

<400> 4

gggttaccct acttttgcct cttgtaaatt 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DBR2-SpeI-FP

<400> 5

ggactagtat gtctgaaaaa ccaaccttg 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DBR2-BstEII-RP

<400> 6

gggttaccct agaggagtga ccctttg 27

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPS-cassette-FP

<400> 7

tatgaccatg attacgaatt catgagtagt accgatctg 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPS-cassette-RP

<400> 8

ccgggtaccg agctcgaatt cctacttttg cctcttgta 39

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DBR2-cassette-FP

<400> 9

gatcctctag agtcgacctg cagatgtctg aaaaaccaac c 41

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DBR2-cassette-RP

<400> 10

gtgccaagct tgcatgcctg cagctagagg agtgaccctt 40

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35SF

<400> 11

gacgtaaggg atgacgcaca atccc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FPSR

<400> 12

cagggttgcc ctctgcgtgt atg 23

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DBR2R

<400> 13

agctagtctt gaccctaatt taaattg 27