本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種用于植物基因打靶的基因工程載體及在水稻基因改造中的應用。

背景技術：

水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的產量和品質與國民經(jīng)濟及生活密切相關，持續(xù)不斷的培育具有更加優(yōu)良農藝性狀的品種對于水稻生產至關重要。與傳統(tǒng)育種方法相比，隨著生物技術的不斷發(fā)展，近些年逐漸成熟的基因打靶技術為水稻產量和品質等關鍵性狀的優(yōu)化提供了便捷和高效的手段。傳統(tǒng)的基因打靶方法包括同源重組技術、鋅指核酸酶技術(ZFN)、類轉錄因子激活物技術(TALEN)和CRISPR/Cas9技術，其中同源重組技術在植物中打靶效率極低，而ZFN和TALEN技術都存在基因工程載體構建復雜，周期長，成本高，不適于瞬時轉化等技術問題，極大的限制了基因打靶技術在水稻育種改良過程中的實用性。而CRISPR/Cas9技術由于其在靶位點選擇上具有一定的局限性，并且其剪切后修復易形成單堿基的缺失或插入，在一定程度上影響了突變體的獲得。

近2年發(fā)展出的CRISPR/Cpf1技術為基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cpf1系統(tǒng)是存在于細菌中的一種先天性免疫系統(tǒng)。Cpf1能夠獨自地對crRNA前體進行加工，然后利用成熟的crRNA特異性的識別和剪切DNA。利用這一原理，在真核生物細胞中，通過人工合成帶有與Cpf1結合和特異識別靶位點的crRNA，同樣可以引導Cpf1切割基因組中的靶點序列，在細胞啟動DNA修復機制后，切割位點會出現(xiàn)隨機的堿基插入或缺失，從而實現(xiàn)了位點特異性的基因打靶。目前，在大鼠中已成功實現(xiàn)了基因組的CRISPR/Cpf1定向基因打靶。在植物中還沒有利用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)實現(xiàn)基因打靶的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種用于水稻基因打靶的基因工程骨干載體。

具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種用于基因工程的骨干質粒載體，其特征在于，

包含crRNA表達框和Cpf1核酸酶表達框，所述crRNA表達框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表達框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。

優(yōu)選地，在所述骨干質粒載體中，a、所述crRNA表達框包括：水稻U3啟動子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第107至487位所示；壯觀霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如Seq ID No.1第495至1701位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1709至1716位所示，

b、所述Cpf1核酸酶表達框包括：玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至3777位所示；水稻偏好密碼子改造后的Cpf1編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第3786至7607位所示和35s終止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第7614至7878位所示。

優(yōu)選地，所述骨干質粒載體還包括：c、T-DNA的左、右邊界序列，其中，所述左邊界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第10127至10150位所示，所述右邊界序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示，所述crRNA表達框和所述Cpf1表達框位于所述左邊界序列和所述右邊界序列之間。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于基因工程的骨干質粒載體，其特征在于，所述骨干質粒載體的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，文中稱為pHUN611。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于水稻目的基因打靶的重組載體的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：

按照目的基因的編碼序列，選擇雙鏈靶標片段，其中所述靶標片段位于所述目的基因上，所述雙鏈靶標片段的一條鏈具有以下5’TTTN-(N)_X-3’結構，(N)_X表示數(shù)目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個表示堿基A、G、C、T中的任意一個，TTTN中的N也代表堿基A、G、C、T中的任意一個(優(yōu)選地，X為25)；

將所述靶標片段整合到上述的骨干質粒載體中，形成帶有所述標靶片段的crRNA。

優(yōu)選地，所述載體構建包括，

按照靶標序列的核酸排列順序，分別合成具有5’-GGCA-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸鏈和具有5’-AAAA-(N’)_X-3’特征的反向寡核苷酸鏈，其中正向寡核苷酸鏈中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N’)_X具有反向互補特征；用BsaI內切酶切開所述骨干質粒載體，將所述正向寡核苷酸鏈和所述反向寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈核苷酸替換壯觀霉素抗性基因，通過卡那霉素正向選擇和壯觀霉素負向選擇，篩選形成用于水稻目的基因打靶的重組載體。

另一方面，本發(fā)明提供一種上述重組載體在水稻基因打靶中的應用，其特征在于，包括步驟如下，

將所述重組載體轉入水稻細胞，使所述水稻細胞同時含有針對靶標基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的雙鏈靶標片段，誘發(fā)所述水稻細胞自身的DNA修復功能，實現(xiàn)目的基因中靶標片段的隨機插入和/或隨機缺失。

優(yōu)選地，所述轉入水稻細胞是指將所述重組載體經(jīng)原生質體瞬時轉化或農桿菌介導穩(wěn)定轉化到水稻細胞或組織中。

優(yōu)選地，所述應用用于獲得在靶標片段上具有隨機插入和/或隨機缺失的水稻植株。

另一方面，本發(fā)明提供一種獲得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求6所述的重組載體導入目標菌落。

本發(fā)明所述的基因工程骨干載體是包含T-DNA邊界序列的雙元載體，在T-DNA左右兩個邊界內，包含2個表達框：Cpf1基因表達框和crRNA表達框，還可以包括潮霉素抗性基因表達框。在T-DNA邊界外的載體骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等結構(圖1)。

在本發(fā)明中，SpR基因兩端分別存在反向排列的BsaI內切酶識別位點(剪切位點如Seq ID No.1第495位和1701位所示)，用于插入靶標片段。

本發(fā)明還提供包含攜帶所述重組載體的轉化子，其中，所用宿主為微生物，具體的為大腸桿菌和農桿菌。

本發(fā)明的一個目的是應用所述重組載體，實現(xiàn)目的基因靶標片段的隨機插入和/或隨機缺失。具體而言，是通過重組載體轉入水稻細胞，使細胞同時含有針對靶標基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，目的基因的雙鏈靶標片段被剪切，誘導水稻細胞自身的DNA修復功能，最終實現(xiàn)目的基因中靶標片段的隨機插入和/或隨機缺失。

所述應用中，crRNA由能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段和與cpf1結合的骨架片段連接而成。所述crRNA中能與所述靶標片段互補結合的RNA片段為能與所述5’TTTN-(N)_X-3’中(N)_X互補結合的RNA片段。

所述Cpf1核酸酶由SEQ ID No.1中第3786至7607位核苷酸所示DNA轉錄的RNA片段翻譯而成的蛋白質。

所述重組載體轉入水稻細胞的方法為：向植物細胞直接導入重組載體的DNA序列，具體如PEG介導的原生質體瞬時轉化或農桿菌介導的愈傷組織穩(wěn)定轉化。

所述再生植株，由轉化的水稻細胞或組織，如原生質體或愈傷組織分化再生而來。所述應用可獲得帶有目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失的水稻植株。

為了實現(xiàn)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在水稻基因組中的打靶，在本發(fā)明中，采用了水稻U3啟動子表達crRNA和ZmUBI啟動子驅動水稻偏好密碼子化改造的Cpf1基因的組合，并且成功的實現(xiàn)了在水稻中的基因打靶，獲得對應的水稻突變體植株。同時，本發(fā)明預先將crRNA表達框和Cpf1表達框預置與同一質粒骨架上，簡化了針對某一基因構建重組打靶載體的流程。

在一種實現(xiàn)方式中，本發(fā)明的骨干質粒載體的核苷酸序列如下(與序列表中SEQ ID No.1相同)：

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技術效果

本發(fā)明的骨干載體將crRNA表達框和Cpf1核酸酶表達框整合在一個雙元載體上。簡化了載體構建步驟；2、在載體上整合了SPR基因，為載體鑒定提供了抗生素篩選條件，從而簡化鑒定步驟。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一個實施例中的骨干質粒載體pHUN611的載體示意圖；

圖2為應用pHUN611-BEL重組載體轉入原生質體對水稻內源BEL基因定點突變測序檢測的部分結果圖，其中WT表示野生型基因，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸數(shù)量；

圖3為應用PHUN611-BEL重組載體通過PEG介導轉入原生質體后再生植株中對水稻內源BEL基因定點突變測序檢測的部分結果圖，其中WT表示野生型基因，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸數(shù)量；

圖4為應用pHUN4c16-BEL重組載體通過農桿菌介導的穩(wěn)定轉化獲得的轉基因植株中對水稻內源BEL基因定點突變測序檢測的部分結果圖，其中WT表示野生型基因，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸數(shù)量；

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。

實施例

骨干質粒載體的設計

具體而言，本發(fā)明設計了這樣的骨干質粒載體，其包括crRNA表達框和Cpf1核酸酶表達框，crRNA表達框包括：水稻U3啟動子、壯觀霉素抗性基因以及Poly-T終止子。Cpf1核酸酶表達框包括：玉米ZmUBI啟動子、水稻偏好密碼子化改造的Cpf1編碼序列和35s終止子。上述序列是該骨干質粒載體的特有部分，其還可以包括一些常規(guī)載體所具有的一般結構，這里不再累述。Seq ID NO.1中示出了本發(fā)明所設計的骨干質粒載體的一種實現(xiàn)方式。該載體可以采用現(xiàn)有技術中的常規(guī)方式來構建。

用于水稻BEL基因打靶的重組載體的制備。

1.1，選擇水稻BEL基因(LOC_Os03g55240)中第2463-2487位的核苷酸序列TTTGGAAGAGAGTGACTGCGCTAGCAATC，(下劃線部分為所述5’TTTN-(N)_X-3’結構中TTTG部分)，作為打靶位點。

1.2，按所選擇靶位點合成(華大基因公司)正向寡核苷酸鏈(BEL KO1 P1)和可與之互補的反向寡核苷酸鏈(BEL KO1P2)，

具體序列為：

其中未被下劃線標注的部分為上述靶位點中去除TTTN的序列或互補序列，下劃線部分為用于連接載體的粘性末端。

1.3,經(jīng)過退火程序，將BEL KO1P1和BEL KO1P2兩條鏈退火形成具有粘性末端的雙鏈DNA，作為構建重組載體的插入片段。

1.4，用BsaI內切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN611載體2小時，65℃失活酶切體系20分鐘，作為構建重組載體的骨架片段。

1.5，用T4連接酶(NEB公司)將重組載體骨架片段和插入片段相連，轉入大腸桿菌中。通過選擇具有卡那霉素抗性且不具壯觀霉素抗性的菌斑，獲得陽性轉化子。經(jīng)測序驗證后，提取陽性質粒，構成用于水稻BEL基因CRISPR/Cpf1打靶的重組載體質粒，命名為pHUN611-BEL。

實施例2、原生質體瞬時轉化介導的水稻BEL基因打靶。

2.1,利用PEG法將pHUN611-BEL質粒轉化至水稻日本晴原生質體，水稻原生質體轉化具體過程參考了文獻Zhang等A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.Plant Method(2011).中公開的實驗方法。

2.2，利用植物基因組小量提取試劑盒(天根生化公司)，在水稻原生質體轉化后48小時提取其基因組DNA。以該DNA為模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR擴增包含靶標區(qū)域的序列，其中PCR擴增所用的引物為：

Bel KO1 genome check FP:GTGGAGGTCGACATGACTGAAG

BelKO1 genome check RP:TTGCACATTCATACAAATTGGT

2.3，所獲PCR擴增片段經(jīng)電泳回收后，將其克隆至pEASY-T載體(全式金公司)，用M13F引物測序，分析靶標位點的突變。測序結果表明，在所測120個克隆中，40個克隆攜帶BEL基因靶標序列上的突變，突變效率為33.3％；突變的形式包括堿基的插入和/或缺失。部分結果如圖2所示。

2.4，利用PEG法將pHUN611-BEL質粒轉化至水稻日本晴原生質體，并獲得再生水稻植株。水稻原生質體轉化和植株再生具體過程參考了文獻Hayashimoto等A Polyethylene Glycol-Mediated Protoplast Transformation System for Production of Fertile Transgenic Rice Plants.Plant Physiology(1990).中公開的實驗方法。

2.5，利用植物基因組小量提取試劑盒(天根生化公司)，提取所獲60棵再生植株的基因組DNA。以該DNA為模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR擴增包含靶標區(qū)域的序列，其中PCR擴增所用的引物為上述Bel KO1 genome check FP和Bel KO1 genome check RP。

2.6，以Bel KO1 genome check FP為引物對所獲PCR擴增片段直接測序，分析靶標位點的突變。測序結果表明，在所測60棵植株中，9棵植株帶有BEL基因靶標序列上的突變，突變效率為15.0％；突變的形式包括堿基的插入和/或缺失。部分結果如圖3所示。

實施例3、農桿菌穩(wěn)定轉基因介導的水稻BEL基因打靶。

3.1，利用凍融法將pHUN611-BEL重組載體轉入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省農業(yè)科學院農業(yè)部轉基因生物產品成分監(jiān)督檢驗測試中心水稻組保存)，獲得陽性克隆。

3.2、成熟種子去掉穎殼后，用70％酒精浸泡種子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4％)溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養(yǎng)基上。30℃下暗培養(yǎng)11天后將愈傷與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養(yǎng)3～5天后用于農桿菌轉化。

3.3、采用上述轉入了重組表達載體的根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。共獲得34株pHUN611-BEL植株(pHUN611-BEL轉基因水稻植株)。

3.4，利用植物基因組小量提取試劑盒(天根生化公司)，提取所獲34株pHUN611-BEL轉基因水稻植株的基因組DNA。以該DNA為模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR擴增包含靶標區(qū)域的序列，其中PCR擴增所用的引物為上述Bel KO1 genome check FP和Bel KO1 genome check RP。

3.5，以Bel KO1 genome check FP為引物對所獲PCR擴增片段直接測序，分析靶標位點的突變。測序結果表明，在所測34株植株中，14株帶有BEL基因靶標序列上的突變，突變效率為41.2％；突變的形式包括堿基的插入和/或缺失。部分結果如圖4所示。

從圖4中可以明顯看出，利用本發(fā)明的載體進行基因打靶可以實現(xiàn)水稻特異位點的基因打靶。

序列表

<110> 安徽省農業(yè)科學院水稻研究所

<120> 一種用于基因工程的骨干質粒載體及應用

<130> HCI20160266

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13069

<212> DNA

<213> 骨干質粒載體

<400> 1:

gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60

aatctgatcc aagctcaagc taagctcacg tgacggaatt aagcttaagg gatctttaaa 120

catacgaaca gatcacttaa agttcttctg aagcaactta aagttatcag gcatgcatgg 180

atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg accatagcac aagacaggcg tcttctactg 240

gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa cactgggtac gttggaaacc acgtgatgtg 300

aagaagtaag ataaactgta ggagaaaagc atttcgtagt gggccatgaa gcctttcagg 360

acatgtattg cagtatgggc cggcccatta cgcaattgga cgacaacaaa gactagtatt 420

agtaccacct cggctatcca catagatcaa agctgattta aaagagttgt gcagatgatc 480

cgtggcaaga gaccaaccca gtggacataa gcctgttcgg ttcgtaagct gtaatgcaag 540

tagcgtatgc gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc 600

gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg 660

gcatccaagc agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac 720

gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa acaaagttaa acatcatggg ggaagcggtg 780

atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa 840

ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac 900

agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct 960

ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct 1020

gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc 1080

gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc 1140

acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg 1200

gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg 1260

ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat 1320

gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag 1380

gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt 1440

gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 1500

ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt 1560

ctagctagaa attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 1620

atgcactaag cacataattg ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt 1680

tttaagcgtg cataataagc cggtctcatt ttttttagta gtagcatctg acggtgggga 1740

agcttgatat cgaattcctg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa 1800

tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt 1860

gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat 1920

ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg 1980

gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg 2040

catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat 2100

tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat 2160

ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt 2220

atttaataat ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc 2280

ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc 2340

ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc 2400

gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag 2460

ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaatgcgtg gcggagcggc 2520

agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg 2580

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc 2640

ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga 2700

tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 2760

ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc 2820

tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc 2880

gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc 2940

tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt 3000

tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca 3060

cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg 3120

gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt 3180

aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga 3240

tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca 3300

gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg 3360

ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact 3420

gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct 3480

aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag 3540

catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta 3600

taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt 3660

ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc 3720

accctgttgt ttggtgttac ttctgcagcc cgggggatcc ccaatacttg tatggccgcg 3780

gccgcatgtc caagctggag aagtttacaa actgttacag cctctccaaa accctcaggt 3840

ttaaagcgat cccggtgggc aagacccagg agaacatcga caacaagagg ctcctggtgg 3900

aagacgagaa gcgcgccgaa gactacaagg gcgtgaagaa gctgctcgat aggtactacc 3960

tcagctttat taacgacgtg ctgcacagca tcaaactcaa gaatctcaac aactacatct 4020

ccctcttccg caaaaagacc cgcaccgaga aggagaacaa ggagctggag aacctggaga 4080

tcaacctccg caaggaaatc gccaaagcgt tcaagggcaa tgaagggtac aagagcctct 4140

tcaagaaaga catcatcgaa actatcctcc cagagtttct cgatgacaag gacgagatcg 4200

cgctggtgaa ctcctttaac gggttcacaa ccgcgtttac cggcttcttt gataacaggg 4260

aaaatatgtt ctccgaggag gccaagtcca ccagcatcgc cttcaggtgt atcaacgaga 4320

acctcacccg ctacatttcc aatatggaca ttttcgagaa ggtggatgcg atcttcgata 4380

agcacgaggt gcaggagatc aaagagaaga ttctcaattc cgattatgac gtcgaggatt 4440

tcttcgaagg ggagttcttt aattttgtgc tcacacaaga gggcattgac gtgtacaacg 4500

cgattatcgg gggcttcgtc acagagtccg gggagaagat taaggggctg aatgagtaca 4560

tcaatctgta caatcagaag accaagcaga aactgccgaa attcaagccg ctctacaagc 4620

aagtcctgtc cgatagggaa agcctctcct tctacggcga gggctatacc agcgacgagg 4680

aggtgctgga agtcttccgc aacacactga ataagaatag cgagattttc tcctccatca 4740

agaagctcga gaagctcttt aagaactttg acgagtacag ctccgccggg attttcgtga 4800

agaacgggcc ggcgatcagc accatctcca aggacatctt tggcgagtgg aacgtcatca 4860

gggacaagtg gaacgccgag tacgacgaca tccacctgaa gaagaaggcg gtggtgaccg 4920

agaagtatga ggacgatcgc aggaagtcct tcaaaaaaat cggctccttc agcctcgaac 4980

agctccagga gtatgccgat gcggatctgt ccgtcgtcga gaagctgaag gaaatcatca 5040

ttcagaaggt cgacgagatc tataaagtgt acgggtccag cgagaagctg ttcgacgccg 5100

actttgtgct cgagaagtcc ctcaaaaaga atgacgccgt ggtggccatt atgaaagacc 5160

tgctcgactc cgtgaagtcc ttcgaaaatt acattaaagc gttctttggg gaggggaagg 5220

aaactaacag ggatgagtcc ttctatggcg actttgtcct cgcgtacgac atcctgctga 5280

aggtcgacca catttacgac gcgatccgca actacgtgac acagaagccg tactccaaag 5340

acaagttcaa gctgtacttc cagaacccgc aatttatggg gggctgggac aaggataaag 5400

agacagacta ccgcgcgaca attctccgct atggctccaa atactatctg gccatcatgg 5460

acaagaagta cgcgaagtgc ctgcagaaga tcgacaaaga cgacgtcaat ggcaactatg 5520

aaaagatcaa ctacaagctg ctgccgggcc cgaacaagat gctcccgaag gtgttcttca 5580

gcaagaagtg gatggcctac tacaatccaa gcgaggatat tcagaaaatc tataaaaacg 5640

ggaccttcaa gaagggggac atgtttaacc tcaacgactg ccacaagctc attgatttct 5700

tcaaggatag catttcccgc tacccgaaat ggtccaatgc gtacgatttt aacttctccg 5760

agacagaaaa gtacaaagac atcgcgggct tttacaggga ggtggaggag caagggtata 5820

aagtttcttt tgaatccgcg agcaagaagg aagtcgacaa gctcgtcgag gagggcaagc 5880

tctacatgtt ccaaatttat aacaaggact tttccgacaa gagccatggg accccaaacc 5940

tccacaccat gtacttcaaa ctgctctttg acgagaacaa ccacgggcaa atcaggctga 6000

gcggcggcgc cgaattattc atgcgcaggg cctccctcaa gaaggaagag ctggtcgtcc 6060

atccagccaa ttccccgatc gcgaacaaga acccggacaa tccgaaaaag accaccaccc 6120

tgtcctacga cgtctacaag gacaaacgct tcagcgaaga ccagtacgaa ttacacatcc 6180

caattgcgat taataagtgc ccaaagaata tcttcaaaat taatacagag gtcagggtgc 6240

tgctcaaaca cgacgacaat ccgtatgtca tcggcattga caggggcgag cgcaatctgc 6300

tctatatcgt ggtcgtggat gggaagggca atattgtgga gcagtactcc ctgaacgaga 6360

ttatcaacaa cttcaatggg attaggatta agaccgacta tcacagcctg ctcgacaaga 6420

aagaaaaaga gaggtttgag gcccgccaaa actggacctc cattgagaat atcaaagaat 6480

taaaggccgg ctatatttcc caagtcgtcc acaagatctg cgagctggtg gagaaatatg 6540

acgccgtgat tgcgctcgaa gacttaaatt ctgggttcaa gaactcccgc gtgaaggtgg 6600

aaaaacaggt gtatcagaaa ttcgagaaaa tgctgatcga caaactcaat tatatggtgg 6660

ataagaagtc caacccgtgt gccacagggg gcgcgctgaa gggctatcag atcaccaaca 6720

agttcgagag cttcaagagc atgagcaccc agaacgggtt tattttctac atcccggcgt 6780

ggctcacctc caagattgac ccgagcaccg gcttcgtgaa cctcctgaag acaaagtata 6840

cctccattgc cgacagcaag aagtttatct cctccttcga ccgcattatg tatgtgccgg 6900

aggaggacct cttcgagttc gccctcgact acaaaaactt cagccgcaca gatgcggatt 6960

acatcaagaa gtggaagctg tactcctacg ggaacaggat ccgcatcttc aggaatccaa 7020

aaaaaaataa cgtctttgac tgggaggaag tgtgcctgac atccgcctac aaggaactgt 7080

tcaataaata cggcatcaat taccagcagg gcgacattcg cgccctcctc tgtgagcagt 7140

ccgacaaagc gttttactcc agcttcatgg ccctcatgtc cctgatgctc caaatgagga 7200

atagcatcac agggcgcacc gacgtcgact tcctcatcag cccggtgaag aactccgacg 7260

ggatctttta cgactcccgc aactatgagg cgcaagagaa tgcgatcctc ccgaagaacg 7320

ccgatgcgaa cggggcctat aatatcgcca ggaaagtgct ctgggccatc gggcagttca 7380

aaaaggcgga ggatgagaag ctcgacaagg tgaaaattgc catttccaac aaggagtggc 7440

tggagtacgc gcagacctcc gtgaagcaca aaaggccggc ggccacgaaa aaggccggcc 7500

aggcaaaaaa gaaaaaggga tcctacccat acgatgttcc agattacgct tatccctacg 7560

acgtgcctga ttatgcatac ccatatgatg tccccgacta tgcctaagag ctccggccgg 7620

gagcatgcga cgtcgatcta actgactagc cgcggccatg ctagagtccg caaaaatcac 7680

cagtctctct ctacaaatct atctctctct atttttctcc agaataatgt gtgagtagtt 7740

cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 7800

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 7860

accaaaatcc agtgacctga attcgaggcg gtttgcgtat tggctagagc agcttgccaa 7920

catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga 7980

ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca 8040

ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa 8100

atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc 8160

caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 8220

ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa 8280

gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt 8340

aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac 8400

agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt 8460

tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 8520

ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 8580

tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gaccttcctc tatataagga 8640

agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 8700

ctctcgagct ttcgcagatc ccggggggca atgagatatg aaaaagcctg aactcaccgc 8760

gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct 8820

ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct 8880

gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc 8940

atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gagtttagcg agagcctgac 9000

ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact 9060

gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag 9120

ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg 9180

tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga 9240

caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg 9300

ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa 9360

tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga 9420

ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta 9480

cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccacga ctccgggcgt atatgctccg 9540

cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg 9600

ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca 9660

aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag 9720

tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaagaaa tagagtagat gccgaccgga 9780

tctgtcgatc gacaagctcg agtttctcca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg 9840

gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg 9900

tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca 9960

gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt cggcgttaat tcagtacatt aaaaacgtcc 10020

gcaatgtgtt attaagttgt cactagtcag gttaactcaa ttcggcgtta attcagtaca 10080

ttaaaaacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat 10140

atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac 10200

tcgatacagg cagcccatca gtccgggacg gcgtcagcgg gagagccgtt gtaaggcggc 10260

agactttgct catgttaccg atgctattcg gaagaacggc aactaagctg ccgggtttga 10320

aacacggatg atctcgcgga gggtagcatg ttgattgtaa cgatgacaga gcgttgctgc 10380

ctgtgatcac ttaagtaact aactaacagg aagagtttgt agaaacgcaa aaaggccatc 10440

cgtcaggatg gccttctgct tagtttgatg cctggcagtt tatggcgggc gtcctgcccg 10500

ccaccctccg ggccgttgct tcacaacgtt caaatccgct cccggcggat ttgtcctact 10560

caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt ccgactgagc 10620

ctttcgtttt atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc ttagtagtta gacgtccccg 10680

agatccatgc tagaccatga atccagaagc ccgagaggtt gccgcctttc gggctttttc 10740

tttttcaaaa aaaaaaattt ataaaacgat ctgttgcggc cggccgccgg gttgtgggca 10800

aaggcgctcg acggtgggca accgcttgcg gttgtccacg ggcggagccg gtgcgcgtag 10860

cgcattgtcc acaagccaag ggcgaccaat aattgatata tatattcata attgaaaagc 10920

taattgaaca tactacttgc tgtaactact tgccggagcg aggggtgttt gcaagctgtt 10980

gatctgaaag ggctattagc gttctcacgt gcctttttga ttagcgattt cacgtgacct 11040

tattagcgat ttcacgtact ccgattagcg atttcacgta ccctgattag cgatttcacg 11100

tggatagttt ttggagcggg ccggaaagcc ccgtgaatca aggctttgcg gggcattagc 11160

ggtttcacgt ggataactac cctctatcca caggcttccg gggataaaaa agcccgctcg 11220

acggcgggct gttggatggg gatctagcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 11280

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 11340

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 11400

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 11460

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 11520

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 11580

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 11640

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 11700

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 11760

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 11820

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 11880

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 11940

aagaagatcc tttgatcttt tctaccgggt ctgacgctca gtggaacggg gcccaatctg 12000

aataatgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 12060

actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 12120

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tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat 12300

gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 12360

catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 12420

tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcagggac actgccagcg 12480

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgtttttc 12540

cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 12600

tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 12660

tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 12720

agcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 12780

aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgacgt ttcccgttga atatggctca 12840

taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 12900

ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac gggccagagc tgcagtttga 12960

tcccgagggg aaccctgtgg ttgacatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt 13020

cacgcccttt taaatatccg ttattctaat aaacgctctt ttctcttag 13069

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> BEL KO1 P1

<400> 2:

ggcagtcaaa agaccttttt aatttctact cttgtagatg aagagagtga ctgcgctagc 60

aatcgctc 68

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> BEL KO1 P2

<400> 3:

aaaagagcga ttgctagcgc agtcactctc ttcatctaca agagtagaaa ttaaaaaggt 60

cttttgac 68

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Bel KO1 genome check FP

<400> 4:

gtggaggtcg acatgactga ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Bel KO1 genome check RP

<400> 5:

ttgcacattc atacaaattg gt 22