技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsANT1在水稻選育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來獲得氮素；氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠銨根運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋMT）、硝酸根運(yùn)輸?shù)鞍祝∟RT）、氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋAT）、肽運(yùn)輸?shù)鞍祝≒TR）等運(yùn)輸?shù)鞍讈硗瓿桑╓illiams L, Miller A. Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annu Rev Plant Biol and Plant Mol Biol, 2001, 52: 659-688.）。銨通過植物AMT吸收后再通過谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進(jìn)一步形成其它氨基酸（Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation of the ammonium transporter gene family AMT1 by glutamine in rice. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通過高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HATS）的NRT2和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LATS）的NRT1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）還原形成銨，再進(jìn)一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D, et al. Plants can use protein as a nitrogen source without assistance from other organisms. PNAS, 2008, 105: 4524-4529.）。

在高等植物中，AAT是一類跨膜蛋白，將氨基酸從胞外運(yùn)至胞內(nèi)，同時(shí)還在氨基酸遠(yuǎn)距離運(yùn)輸、病原反應(yīng)和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用（Tegeder M. Transporters for amino acids in plant cells: some functions and many unknowns. Curr Opin Plant Biol, 2012, 15: 1-7.）。AAT基因被分為兩個(gè)超家族：APC（氨基酸、多胺和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)）超家族和AAAP（氨基酸/生長素透性酶）超家族。APC超家族分為三個(gè)亞家族：CATs（陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、ACTs（氨基酸/膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族和PHSs（多胺、H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族。AAAP超家族分為六個(gè)亞家族：AAPs（氨基酸透性酶）家族、LHTs（賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、ProTs（脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、GATs（γ-氨基酸丁酸，GABA）家族、AUXs（生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族和ANTs（芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族（Fischer WN, Andre B, Rentsch D, et al. Amino acid transport in plants. Trends Plant Sci, 1998, 3: 188-195.）。

水稻基因組中共找到85個(gè)AAT家族成員（Zhao H, Ma H, Yu L, et al. Genome-wide survey and expression analysis of amino acid transporter gene family in rice (Oryza sativa L.). PLoS ONE, 2012, 7: e49210.）。研究發(fā)現(xiàn)OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突變體的稻米產(chǎn)量及植物體干重均下降，證明AAT對水稻的氮素積累及碳氮分配有著重要作用（Lu Y, Song Z, Lu K, et al. Molecular characterization, expression and functional analysis of the amino acid transporter gene family (OsAATs) in rice. Acta physiol Plant, 2012, 34: 1943-1962.）。研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)OsAAP6會增加水稻籽粒中儲藏性蛋白和氨基酸含量，從而改善稻米營養(yǎng)和風(fēng)味（Peng B, Kong H, Li Y, et al. OsAAP6 functions as an important regulator of grain protein content and nutritional quality in rice. Nat Commun, 2014, 5: doi:10.1038.）。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對水稻等各種植物體的氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲藏具有重要的作用。目前關(guān)于水稻AAT家族成員研究的報(bào)道很少，ANT基因表達(dá)的蛋白主要運(yùn)輸中性氨基酸，目前水稻氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族OsANT1基因的蛋白對水稻的生長發(fā)育目前未有任何研究。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)OsANT1基因?qū)λ旧锪坑绊懹休^為重要的作用，可應(yīng)用于植物株型改良。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsANT1在水稻選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsANT1為對象，從水稻中花11中克隆了OsANT1的cDNA序列。通過構(gòu)建OsANT1基因的超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中，得到OsANT1基因表達(dá)量上升的超表達(dá)植株，超表達(dá)植株的根長、根數(shù)、株高和鮮重與對照野生型中花11相比顯著提高。同時(shí)構(gòu)建了OsANT1基因的干擾載體，將干擾載體導(dǎo)入中花11中，得到OsANT1基因的干擾植株，其根長、根數(shù)和鮮重與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過提高OsANT1基因表達(dá)，可以促進(jìn)水稻生長，增加生物量；OsANT1基因在闡述氨基酸運(yùn)輸影響植物生長及發(fā)育過程方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的OsANT1基因的功能，其可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻根長、根數(shù)、株高和鮮重，從而促進(jìn)水稻生長，提高水稻物量。具體可通過超表達(dá)提高OsANT1基因的表達(dá)，使水稻根長、根數(shù)、株高和鮮重增加，達(dá)到提高水稻生物量的目的。所述的OsANT1基因編碼的OsANT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsANT1基因的cDNA序列優(yōu)選如SEQ ID NO.2所示。

應(yīng)該理解為，在不影響OsANT1蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsANT1蛋白還包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

（1）本發(fā)明克隆的OsANT1基因提高表達(dá)后使水稻根長、根數(shù)、株高和鮮重增強(qiáng)，說明OsANT1基因?qū)μ岣咚旧锪枯^明顯，因此，通過基因工程技術(shù)提高OsANT1基因的表達(dá)能夠提高植物生物量。這不僅有助于通過正常施氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過結(jié)合分子育種進(jìn)行植物的品種改良。

（2）OsANT1基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族在氮吸收過程中的重要作用，對闡明氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些氮營養(yǎng)途徑中影響植物生長的基因，但對植物生長發(fā)育的分子機(jī)制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的OsANT1基因能夠提高水稻的生物量，對確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動作用。

附圖說明

圖1是對照中花11、OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系的整株表型圖。

圖2是對照中花11、OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系OsANT1基因表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a，b，c）表示之間具有差異顯著。

圖3是對照中花11和OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系根長的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a，b，c）表示之間具有差異顯著。

圖4是對照中花11、OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系根數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a，b，c）表示之間具有差異顯著。

圖5是對照中花11、OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系株高的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a，b）表示之間具有差異顯著。

圖6是對照中花11、OsANT1基因超表達(dá)植株2個(gè)株系和OsANT1基因干擾植株2個(gè)株系鮮重的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a，b，c）表示之間具有差異顯著。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)（參見分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1 OsANT1基因超表達(dá)植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對：

F1：5'-AGATCTATGGAGGGGGCGGCGCCGCTTCT-3'（BglII），

R1：5'-CTTAAGCTGCAGTTGAATCCTGCATTGTGG-3'（AflII）；

通過PCR擴(kuò)增OsANT1基因的cDNA后，通過BglII和AflII酶切后連入pCAMBIA-1301載體（pCAMBIA-1301載體購自Cambia公司），構(gòu)建出OsANT1基因的超表達(dá)載體OsANT1-p1301。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時(shí)，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于蒸餾水制備的含濃度為50mg/L的500mL潮霉素溶液中48小時(shí)，之后葉子為綠色并舒張、生長狀態(tài)良好的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽性植株單株種植并收種，直至T2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsANT1基因超表達(dá)植株。OsANT1基因超表達(dá)植株比對照中花11植株根長、根數(shù)、株高和鮮重增加，并達(dá)到差異顯著，如圖1、圖3-6中所示。

取OsANT1基因超表達(dá)植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測OsANT1基因在超表達(dá)植株的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖2）超表達(dá)植株中OsANT1基因的表達(dá)量顯著高于對照中花11。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物對為：

F2：5'-GGATGCGCCACGCTCTACTG-3'，

R2：5'-GCTACAGATCCACCTGCTTGGGAA-3'。

上述結(jié)果表明，OsANT1基因可以通過表達(dá)量的提高，增加水稻的根長、根數(shù)、株高和鮮重，最終提高水稻生物量。

實(shí)施例2 OsANT1基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對：

F3：5'-GGTACCGAGTGACTCCGGAAGCCAAGC-3'（KpnI），

R3：5'-GGATCCCAGTAGAGCGTGGCGCATCC-3'（BamH I）；

F4：5'-ACTAGTGAGTGACTCCGGAAGCCAAGC-3'（SpeI），

R4：5'-GAGCTCCAGTAGAGCGTGGCGCATCC-3'（Sac I）；

各自PCR擴(kuò)增出OsANT1基因的cDNA片段，通過上述相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后連入pTCK303載體，構(gòu)建出OsANT1基因的干擾表達(dá)載體OsANT1-pTCK303。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長高約10cm時(shí)，將50株水稻轉(zhuǎn)基因小苗浸泡于蒸餾水制備的含濃度為50mg/L的500mL潮霉素溶液中48小時(shí)，之后葉子為綠色并舒張、生長狀態(tài)良好的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；而葉子枯黃并卷曲的植株為陰性植株，隨即死亡。陽性植株單株種植并收種，直至T2代鑒定出在上述潮霉素溶液中無任何葉子枯黃并卷曲的為純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsANT1基因干擾植株。OsANT1基因干擾植株比對照中花11植株根長、根數(shù)和鮮重顯著減少，如圖1、圖3-6中所示。

取OsANT1基因干擾植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測OsANT1基因在干擾植株的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖2）干擾植株中OsANT1基因的表達(dá)量比對照中花11降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物對同超表達(dá)植株的檢測。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢生物工程學(xué)院

<120> 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsANT1在水稻選育中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Glu Gly Ala Ala Pro Leu Leu Ala Ala Arg Gly Glu Glu Glu Val

1 5 10 15

Val Glu Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Ser Ala Gln

20 25 30

Thr Leu Gly Asn Val Val Val Ser Ile Val Gly Thr Gly Val Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Tyr Ala Phe Arg Thr Ala Gly Trp Val Ala Gly Ser Leu Gly

50 55 60

Val Ala Ala Ala Gly Cys Ala Thr Leu Tyr Cys Met Leu Leu Leu Val

65 70 75 80

Asp Cys Arg Asp Lys Leu Glu Glu Lys Glu Ser Glu Glu Thr Tyr His

85 90 95

Gly His Tyr Thr Tyr Gly Asp Leu Gly Glu Lys Cys Phe Gly Thr Ile

100 105 110

Gly Arg Cys Leu Thr Glu Ile Leu Ile Leu Val Ser Gln Ala Gly Gly

115 120 125

Ser Val Ala Tyr Leu Ile Phe Ile Gly Gln Asn Leu His Ser Val Phe

130 135 140

Ser Gln Leu Met Ser Pro Ala Ala Phe Ile Phe Ala Ile Leu Leu Pro

145 150 155 160

Met Gln Ile Ala Leu Ser Phe Ile Arg Ser Leu Ser Ser Leu Ser Pro

165 170 175

Phe Ser Ile Phe Ala Asp Val Cys Asn Val Leu Ala Met Ala Ile Val

180 185 190

Ile Lys Glu Asp Leu Gln Leu Phe Asp His Pro Phe Ala Asn Arg Ser

195 200 205

Ala Phe Asn Gly Leu Trp Ala Ile Pro Phe Thr Phe Gly Val Ala Val

210 215 220

Phe Cys Phe Glu Gly Phe Ser Met Thr Leu Ala Leu Glu Ser Ser Met

225 230 235 240

Ala Glu Arg Arg Lys Phe Arg Trp Val Leu Ser Gln Ala Val Val Gly

245 250 255

Ile Ile Ile Val Tyr Ala Cys Phe Gly Val Cys Gly Tyr Leu Ala Tyr

260 265 270

Gly Glu Ala Thr Lys Asp Ile Ile Thr Leu Asn Leu Pro Asn Ser Trp

275 280 285

Ser Ser Ala Ala Val Lys Val Gly Leu Cys Ile Ala Leu Val Phe Thr

290 295 300

Phe Pro Val Met Met His Pro Ile His Glu Ile Val Glu Glu Arg Phe

305 310 315 320

Gln Ser Ser Gly Cys Phe Pro Lys Leu Ser His Lys Val Arg Gly Ala

325 330 335

Glu Trp Val Gly Leu His Ser Ser Arg Ile Val Met Val Thr Ile Leu

340 345 350

Ser Val Val Ala Ser Phe Ile Pro Ala Phe Gly Ser Phe Ile Ser Phe

355 360 365

Val Gly Ser Thr Val Cys Ala Leu Leu Ser Phe Val Leu Pro Thr Ile

370 375 380

Phe His Leu Ser Ile Val Gly Ser Ser Met Ser Pro Trp Arg Arg Trp

385 390 395 400

Gly Asp Tyr Gly Phe Leu Leu Phe Gly Leu Gly Phe Ala Gly Tyr Gly

405 410 415

Leu Ile Arg Ala Leu Phe Ser His

420

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggaggggg cggcgccgct tctggcggcg cgtggggagg aggaggtggt ggaggggagg 60

cggcgcgggg gagggggcgg ggcgacgtcg gcgcagacgc tggggaacgt ggtggtgtcc 120

atcgtgggga ccggggtgct cggcctcccc tacgcgttcc gcaccgccgg ctgggtcgcc 180

ggctcgctcg gcgtcgccgc cgccggatgc gccacgctct actgcatgct cctcctcgtt 240

gactgcagag ataaattgga agagaaagaa tctgaagaaa cctaccatgg tcactataca 300

tatggtgatt tgggtgaaaa gtgttttggc actataggtc gatgcttgac agaaatcctc 360

atccttgttt cccaagcagg tggatctgta gcttatctaa tattcattgg ccaaaatctt 420

cattctgtct tcagccagtt gatgtcacca gctgccttca tctttgccat tctcctgcct 480

atgcaaatcg ctctatcatt catccgttca ctatcttctc tctccccatt cagcatattt 540

gcagacgtct gcaatgttct tgctatggca attgttatca aagaggatct tcagcttttt 600

gatcacccat ttgcgaatag aagtgctttc aatggacttt gggcgatacc attcactttt 660

ggagttgcgg tcttctgctt cgaaggattc agtatgactt tggcactaga atcatcaatg 720

gcagaacgga gaaaattccg ctgggtactt tctcaagcag ttgtcggtat cataattgtc 780

tatgcatgtt ttggagtttg tggttactta gcctatgggg aggccactaa agacatcata 840

acacttaatc ttcccaatag ttggtcttct gctgccgtta aggttggtct ttgcatagca 900

ctggtattca catttccagt catgatgcac ccaatccacg agattgtcga ggaaagattc 960

caatcaagtg gatgtttccc gaagctctcg cacaaggttc gcggggctga atgggtgggc 1020

ctgcactcaa gccgcatcgt catggtaact atcctgtctg tggtggcatc cttcatacct 1080

gcgttcgggt ccttcatctc ctttgtcggg agcacggttt gcgcgctgct ctccttcgtg 1140

ctgcctacga tcttccatct gagcattgtg ggttcctcga tgagtccgtg gcgacgctgg 1200

ggggactacg gtttccttct cttcggcctt ggttttgcgg gctacgggct cattagggct 1260

ctcttctcac attga 1275

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

agatctatgg agggggcggc gccgcttct 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

cttaagctgc agttgaatcc tgcattgtgg 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

ggatgcgcca cgctctactg 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

gctacagatc cacctgcttg ggaa 24

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

ggtaccgagt gactccggaa gccaagc 27

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

ggatcccagt agagcgtggc gcatcc 26

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F4

<400> 9

actagtgagt gactccggaa gccaagc 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R4

<400> 10

gagctccagt agagcgtggc gcatcc 26