專利名稱：蝴蝶蘭FT基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于分子生物學中的基因領域，具體涉及蝴蝶蘭/T {Flowering locus Τ) 基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
遺傳分析表明，小麥和大麥在春化過程中，有3個基因控制著其對春化的需求，這 3 個基因分別是 K7&V/，嘆擬和/T {Flowering locus Λ 簡稱/T) ( VRN3) (Trevaskis et al.，2007)。近年來，/T基因已在多種植物中被克隆鑒定，然而在蘭科(Orchidaceae)植物中，尤其在蝴蝶蘭中鮮有報道。蝴蝶蘭屬于蘭科蝴蝶蘭屬{phalaenopsis)植物，其體態(tài)輕盈，花色艷麗，色澤豐富，具有極高的觀賞和經(jīng)濟價值。由于大部分蝴蝶蘭品種的花期在3-5月份，為提高商品價值，必須調(diào)節(jié)蝴蝶蘭的花期，使其達到全年開花，特別是應中國傳統(tǒng)節(jié)日春節(jié)開花。研究表明，蝴蝶蘭的花芽分化和發(fā)育主要受溫度的調(diào)節(jié)，成熟植株經(jīng)夜溫15-20°C，日溫20-25°C 處理，才能進行花芽分化和發(fā)育(小西國義等，1996)。蝴蝶蘭的花期調(diào)節(jié)方法主要采用空調(diào)和高山低溫處理等，其中高山低溫處理催花效果好，已廣泛應用于生產(chǎn)。因此，弄清蝴蝶蘭如何對低溫的響應，特別是生理生化方面的響應已經(jīng)引起科學界的普遍關(guān)注。然而，低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化與發(fā)育的基因調(diào)控機制的研究尚無報道。本研究以在低溫環(huán)境下誘導的蝴蝶蘭花芽為檢測方(tester)，以在常溫條件下生長的蝴蝶蘭的頂端生長組織為驅(qū)動方(driver)，先構(gòu)建正向抑制消減雜交文庫，然后隨機挑取克隆進行測序，根據(jù)測序結(jié)果并在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，獲得了蝴蝶蘭的 FT {Flowering locus Π的基因序列，希望為低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化與發(fā)育的基因調(diào)控機制提供一定的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列編碼的氨基酸序列。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種獲取蝴蝶蘭/T基因克隆的方法。為了解決上述技術(shù)問題，一方面，本發(fā)明提供了一種分離出的蝴蝶蘭/T基因的 cDNA序列，其具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。所述的蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列，該cDNA序列包含5，端非編碼區(qū)lbp-5m3p、蛋白編碼區(qū)59bp-589bp和3，端非編碼區(qū)590bp_809bp，編碼包含176個氨基酸的多肽。另一方面，本發(fā)明還提供了蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列編碼的多肽，其特征在于， 具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種獲取蝴蝶蘭/T基因克隆的方法。具體而言，本發(fā)明以蝴蝶蘭雜交種/^ahez7OASi1S Aj必rii/a cv. Fortune saltman的成熟植株為材料，分別置
3于常溫溫棚(白天沘士 3 V，濕度70-95% ；夜晚25 士 1. 5 V，濕度100%)和低溫溫棚(白天 28 士 3 V，濕度70-95% ；夜晚21 士 1. 5 °C，濕度100%)中種植，其栽培和施肥管理都一樣。低溫溫棚中的植株在40-60天內(nèi)，分化出0-40 mm大小不等的花芽，而常溫溫棚中的植株仍然處于營養(yǎng)生長階段。因此，以40 mm蝴蝶蘭花芽為檢測方(tester)，以常溫溫棚下生長的蝴蝶蘭頂端生長組織為驅(qū)動方(driver)，分別提取總RNA，再根據(jù)SMART PCR cDNASynthesis Kit和PCR-klect cDNA Subtraction Kit(Clontech，USA)的操作步驟構(gòu)建低溫誘導蝴蝶蘭花芽的正向抑制削減文庫，如圖1-圖5，然后隨機挑取陽性克隆進行測序，這些表達序列標簽(EST)編碼各種不同功能的蛋白，其中之一在NCBI數(shù)據(jù)庫中匹配到/^orerizw locus T (.FT)基因。該cDNA序列全長為809bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，其開放閱讀框為從 5’端第59位至第589位堿基，共531bp，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有176個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示。將蝴蝶蘭的/T基因的cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行搜索，如表1所示的同源性比較結(jié)果表明該/T基因與文心蘭(fl^ii/i腫Gower Ramsey)的/T基因同源性高達89%，以及與著蘭QCymbidiwn卯基因同源性高達87%，同時，將蝴蝶蘭的/T基因編碼的蛋白在NCBI進行比對，結(jié)果顯示如圖6，具有FT類蛋白的PEBP_euk保守結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了一種用于檢測蝴蝶蘭/T基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量的方法，包括如下述步驟
分別提取了不同發(fā)育階段的蝴蝶蘭花芽的總RNA，再將不同花芽的RNA分別反轉(zhuǎn)錄為 cDNA第一鏈；
根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO. 1，設計如下引物作為Real-time PCR的引物來擴增目的片段長為120bp的特異區(qū)段
FT-Y 5' - ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3，<SEQ ID NO. 3>， FT-R 5' - CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’ <SEQ ID NO. 4>， 以蝴蝶蘭的Μ (ΑΥ134752. 1)作為內(nèi)參基因，設計特異引物 actin-F 5' - CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO. 5>， actin-R 5' - TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO. 6>， 擴增長為139 bp目的片段；
根據(jù)Real-time PCR試驗結(jié)果，獲得/T基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量。在本發(fā)明的實施例中，是通過分別提取了 0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm 大小的蝴蝶蘭花芽的總RNA，再將不同花芽的RNA (1 u g)分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；
根據(jù)核苷酸序列SEQ ID N0. 1，設計如下引物作為Real-time PCR的引物來擴增目的片段長為120bp的特異區(qū)段
FT-F 5' - ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3，<SEQ ID NO. 3>， FT-R 5‘ - CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’ <SEQ ID NO. 4>， 以蝴蝶蘭的Μ (ΑΥ134752. 1)作為內(nèi)參基因，設計特異引物 actin-F 5' - CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO. 5>， actin-R 5' - TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO. 6>,
擴增長為139 bp目的片段，其中，蝴蝶蘭的acii/7(AY134752. 1)作為內(nèi)參基因是通過登錄GenBank而獲??；
根據(jù)Real-time PCR試驗結(jié)果，如圖7所示，判斷/T基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量。從圖7可以看出，與在常溫的頂端生長組織(STM)的表達量相比，蝴蝶蘭/T基因在0-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-35 mm花芽中的表達量都升高，其中在0-3、3-5、5-10、10-15和15-20 mm的花芽中表達量都極顯著上升，在20-35 mm的花芽中表達量顯著上升；在0-3 mm的花芽中表達量最高，為在常溫STM表達量的33. 92倍。這些結(jié)果表明，蝴蝶蘭/T基因與低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化與發(fā)育的過程有著密切的關(guān)系。從上述結(jié)果分析表明，本發(fā)明的蝴蝶蘭/T基因是一個新的與低溫誘導花芽分化與發(fā)育的相關(guān)基因，該基因既參與植物的營養(yǎng)生長，又參與低溫誘導的生殖生長，可使植物提前開花。因此，本發(fā)明提供的蝴蝶蘭/T基因，不僅有利于揭示低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化與發(fā)育的分子機制，還可為基因工程改良植物的生命進程，尤其是植物的花期進行調(diào)控提供了一定的依據(jù)。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
進一步詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護的范圍。


圖1 RNA電泳檢測。圖1泳道1，Tester的總RNA ；泳道2，Driver的總RNA。圖 2 ds cDNA 的合成和柱純化。M，Ikb 的 DNA Marker ；圖 2A 泳道 1，Tester ds cDNA，泳道 2，Driver ds cDNA ；圖 2B，泳道 1，2，3 為 iTester 的 dscDNA 柱純化，泳道 4，5，6 為 Driver ds cDNA 柱純化。圖3 Rsa I酶解和純化。泳道M，Ikb的DNA Marker ；圖3A，泳道1和2分別為 Tester ds cDNA Rsa I酶解前和酶解后，泳道3和4分別為Driver的ds cDNA Rsa I酶解前和酶解后；圖3B，泳道1和2分別為Tester ds cDNA Rsa I酶解純化前和純化后，泳道3和4分別為Driver的ds cDNA Rsa I酶解純化前和純化后。圖4正向抑制消減產(chǎn)物兩次PCR結(jié)果。圖4A泳道M，Ikb的DNA Marker ；泳道1， 正向抑制消減文庫的第一次PCR產(chǎn)物；圖4B泳道M，DL2000的DNA Marker ；泳道1，正向抑制消減文庫的第二次PCR產(chǎn)物。圖5向抑制消減文庫的PCR鑒定。圖5泳道M，DL2000的DNA Marker ；泳道1-17， 為隨機挑取的17個陽性克隆的PCR電泳結(jié)果，插入片段長度在300-1100 bp左右。圖6蝴蝶蘭/T基因編碼的蛋白通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果。其中， PEBP_euk 是 Phosphatidyl Ethanolamine-Binding Protein (PEBP) domain present in eukaryotes 的簡寫。圖7 Real-time PCR分析蝴蝶蘭/T基因在不同組織的表達量。圖中橫坐標STM 代表常溫條件下蝴蝶蘭的頂端生長組織，0-3 mm,3-5 mm、5-10 mm、10-15 mm、15-20 mm和 20-35 mm分別代表低溫條件下誘導的不同大小的花芽。圖中縱坐標表示蝴蝶蘭/T與acii/7 的相對表達量。
具體實施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。實施例1蝴蝶蘭/T基因的獲得及其生物信息學分析
(1)以蝴蝶蘭雜交種/^ahez7OASi1S Aj必rii/a cv. Fortune saltman的成熟植株為試驗材料，分別進行常溫溫棚(白天沘士3 °C,濕度70-95% ；夜晚25士 1. 5 °C,濕度100%)和低溫溫棚(白天沘士3 °C，濕度70-95%;夜晚21 士 1.5 °C，濕度100%)中種植。兩棚中的光照強度150 300 Mmol · m_2 · s-1 (光照時間8:00 1800)，其栽培和施肥管理都一樣。低溫溫棚中的植株在40-60天內(nèi)，分化出0-40 mm大小不等的花芽，而常溫溫棚中的植株仍然處于營養(yǎng)生長階段。(2)以低溫溫棚中分化出的40 mm大小的蝴蝶蘭花芽為檢測方(tester)，以常溫溫棚中生長的蝴蝶蘭頂端生長組織為驅(qū)動方(driver)，分別提取其總RNA。RNA的提取步驟具體如下
將樣品于液氮中研成粉末，按適當樣品的量迅速加入Solution D 500 μ 1，水飽和酚 500 “1，3 11醋酸鈉(？!1 5.2)200 μ 1,4 M β-巰基乙醇50 μ 1，充分振蕩混勻，室溫放置 1 min;加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩1 min ；4 °C，12 000 g離心10 min，小心吸取上清液至另一無RNase的離心管中；加入二氧化硅懸浮液100 μ 1，無水乙醇200 4 1，3 11醋酸鈉(？!1 5.2)200 μ 1，用微量移液器緩慢混勻，室溫，12 000 g離心1 min，棄上清；加入70%乙醇1 ml，用移液器吸打混勻，室溫，12 000 g離心1 min，棄上清，重復2次；室溫干燥8-10 min, 加入20-50 μ 1滅菌雙蒸水，室溫孵育5-10 min,室溫，12 000 g離心5-10 min ；將RNA上清液吸取至另一無RNase的離心管中。測定RNA的濃度和電泳檢測RNA的質(zhì)量。最后將RNA置于一 80 ！冰箱保存?zhèn)溆谩?3)構(gòu)建低溫誘導的花芽的正向抑制削減文庫根據(jù)SMARTtmPCR cDNASynthesis Kit 和 PCR-klect cDNA Subtraction Kit (Clontech，USA)的操作步驟構(gòu)建低溫誘導的花芽的正向抑制削減文庫，實驗結(jié)果如圖1-圖5所示。然后隨機挑取陽性克隆進行測序， 這些表達序列標簽(EST)編碼各種不同功能的蛋白，其中一個EST在NCBI數(shù)據(jù)庫中匹配到 Flowering locus T (/Τ)基因。該/T基因與文心蘭(fl^cit/i腫 Gower Ramsey)的/T基因同源性高達89%，以及與春蘭(Cymbidium goeringii)的/T基因同源性高達87%。(4)蝴蝶蘭/T基因的生物信息學分析該cDNA序列全長為809bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，其開放閱讀框為從5，端第59位至第589位堿基，共531bp，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有176個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID N0. 2所示。將蝴蝶蘭/T基因編碼的蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫進行搜索，如圖6所示，結(jié)果表明具有FT類蛋白的PEBP_euk保守結(jié)構(gòu)域；同時，該蝴蝶蘭的FT蛋白與春蘭(C goeringiOm FT蛋白有93%的同源性、與文心蘭 (O. Gower Ramsey)的 FT 蛋白有 90% 的同源性和水稻(Mryza rufipogon)的 Hd3a (FT 蛋白)有80%的同源性。比對結(jié)果如表1所示
表1不同植物來源FT蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離出的蝴蝶蘭/T基因的CDNA序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列，其特征在于，該cDNA序列包含5’ 端非編碼區(qū)lbp-58bp、蛋白編碼區(qū)59bp-589bp和3，端非編碼區(qū)590bp_809bp，編碼包含 176個氨基酸的多肽。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述蝴蝶蘭/T基因的cDNA序列編碼的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.一種用于檢測蝴蝶蘭/T基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量的方法，其特征在于包括如下步驟分別提取了不同發(fā)育階段的蝴蝶蘭花芽的總RNA，再將不同花芽的RNA分別反轉(zhuǎn)錄為 cDNA第一鏈；根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO. 1，設計如下引物作為Real-time PCR的引物來擴增目的片段長為120bp的特異區(qū)段FT-F 5' - ACCGCTTTGTCTTCGTGCTG-3，<SEQ ID NO. 3>， FT-R 5' - CGACTGGCGAACCGAGATTA-3’ <SEQ ID NO. 4>， 以蝴蝶蘭的Μ (ΑΥ134752. 1)作為內(nèi)參基因，設計特異引物 actin-F 5' - CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ <SEQ ID NO. 5>， actin-R 5' - TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ <SEQ ID NO. 6>， 擴增長為139 bp目的片段；根據(jù)Real-time PCR試驗結(jié)果，獲得/T基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蝴蝶蘭FT基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。另外，本發(fā)明還公開了獲取蝴蝶蘭FT基因基因克隆的方法。同時，本發(fā)明提供了一種用于檢測蝴蝶蘭FT基因在低溫誘導出的蝴蝶蘭花芽的不同發(fā)育階段的表達量的方法。本發(fā)明提供的蝴蝶蘭FT基因，不僅有利于揭示低溫誘導蝴蝶蘭花芽分化與發(fā)育的分子機制，還可為基因工程改良植物的生命進程，尤其是植物的花期調(diào)控提供了一定的依據(jù)。
文檔編號C12N15/29GK102250922SQ201110158978
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者呂復兵, 孫映波, 操君喜, 朱根發(fā), 李冬梅 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所