專利名稱：用于控制致病體的核酸序列和氨基酸序列的制作方法
用于控制致病體的核酸序列和氨基酸序列發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及農(nóng)牧業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及抗病原體性蛋白質(zhì) (anti-pathogenic protein)在控制致病體(pathogenic agent)中的用途。當(dāng)應(yīng)用該抗病 原體性蛋白質(zhì)(要么通過其在經(jīng)遺傳修飾的植物中的表達(dá)，要么通過生物制品)時(shí)，獲得高 水平的對于由植物的致病體所產(chǎn)生的疾病的控制。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)從作物例如蘿卜、洋蔥、苜蓿、辣椒、馬鈴薯和大豆的葉、葉鞘、根、塊莖、莖、 果實(shí)和花中分離出了植物抗病原體性蛋白質(zhì)。已經(jīng)在生物化學(xué)以及結(jié)構(gòu)水平上研究了這 些抗病原體性蛋白質(zhì)，因此知曉，它們是大約5KDa、由45至M個(gè)氨基酸組成、富含半胱氨 酸、高度堿性的小肽，并且它們帶正電荷。植物抗病原體性蛋白質(zhì)的家族在氨基酸組成方 面是不同的，因?yàn)橹挥蟹€(wěn)定結(jié)構(gòu)的八個(gè)半胱氨酸看起來是保守的。該特征反映了由不同的 植物抗病原體性蛋白質(zhì)所展示出的多種多樣的生物學(xué)活性(Broekaert等人，(199 Plant Physiol. 108 :1353-8)。根據(jù)前體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可以將植物抗病原體性蛋白質(zhì)分為兩組；在第一組中，前 體蛋白質(zhì)由來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽和成熟蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。該蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑并且不 具有關(guān)于轉(zhuǎn)錄后加工的明顯信號。在第二組中，抗病原體性蛋白質(zhì)由長的前體形成，其除了 包含信號肽和成熟結(jié)構(gòu)域以外，還包含大約33個(gè)氨基酸的C-末端前結(jié)構(gòu)域。迄今為止，僅 在茄科物種中發(fā)現(xiàn)了此類抗病原體性蛋白質(zhì)(Lay和Anderson000 Curr Protein Pept ki. 6 :85-101)。不是所有的植物抗病原體性蛋白質(zhì)都具有相同的作用模式，有些展示出 有效的針對廣泛多樣的絲狀真菌的體外活性，即使以μ M的濃度；其他則不抑制真菌生長， 但卻抑制α-淀粉酶和合成過程的蛋白質(zhì)的活性(Colilla等人，(1990) FEBS Lett. 270 191-194)。解釋了大多數(shù)抗病原體性蛋白質(zhì)的活性的模型為Siai-Matsuzaki-Huang模型， 其解釋了肽與質(zhì)膜相互作用，隨后為由于該帶正電荷的蛋白質(zhì)在其與靶細(xì)胞表面的帶負(fù) 電荷的磷脂發(fā)生相互作用后插入到細(xì)胞膜中而引起的脂質(zhì)移位，這造成在質(zhì)膜內(nèi)形成多 聚體孔，這些多聚體孔構(gòu)成電壓依賴性離子滲透通道(Thomma等人.OO(^)Planta 216 193-202)。另一個(gè)模型基于這樣的理論許多抗病原體性蛋白質(zhì)不僅通過細(xì)胞質(zhì)膜的滲透 化而且還通過細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)來發(fā)揮其作用，這些蛋白質(zhì)一旦在靶細(xì)胞內(nèi)就會影響脫氧核糖核 酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)的合成。這暗示，這些陽離子蛋白質(zhì)引起細(xì)胞質(zhì)膜滲透 化的能力可能并不是作用模式的主要原因，而只是尋找細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的途徑(Thomma等人， (2003)Curr Drug Targets Infect Disord· 3 :1_8)。迄今為止，已鑒定和表征了許多類型的抗微生物蛋白質(zhì)，它們的可能的應(yīng)用是 多種多樣的，因?yàn)檫z傳工程通過細(xì)胞和分子工具而提供了針對植物中的疾病的抵抗策略 (Thomma 等人，Q003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 :1-8)。已顯示，蘿卜的抗病原體性蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)增加了煙草植物對于葉的病原真菌長柄鏈格孢(Alternaria longipes)的抗性(Terra等人，(1995) Plant Cell 7 :573-588)，這與在具有馬鈴薯早疫 病鏈格孢(Alternaria solani)的番茄中所出現(xiàn)的相同。此外，苜蓿的抗病原體性蛋白質(zhì) 的組成型表達(dá)還在馬鈴薯的栽培中提供了高的對于在農(nóng)藝學(xué)上具有重大重要性的真菌大 麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)的抗性，即使在田間條件下(Gao等人，(2000)Nat. Biotechnol. 18 :1307-1310)。此外，對組成性地表達(dá)甘藍(lán)(Brassica oleracea)和蕓苔油菜(B. campestris) 這些物種的抗病原體性蛋白質(zhì)基因的水稻植物進(jìn)行修飾以置換不同位置處的氨基酸，并且 獨(dú)個(gè)地引入到水稻植物中以尋找對于真菌灰色大角間座殼(Magnapothe grisea)和細(xì)菌 水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryza e)(在亞熱帶和熱帶國家中具有重大重要性的疾病) 的抗性。這些抗病原體性蛋白質(zhì)在這兩種疾病中都賦予了有效的抗性，并且這些抗病原體 性蛋白質(zhì)的基因的修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻中廣譜抗性的增加(Kawata等人，^00 JARQ 37 71-76)。作為用于減少由于病原真菌的攻擊而引起的收成損失的備選方案而施用植物抗 病原體性蛋白質(zhì)，相對于使用化學(xué)殺真菌劑而言具有優(yōu)點(diǎn)。第一植物抗病原體性蛋白質(zhì)來 自種子、根和塊莖，因此是對于宿主植物以及對于消費(fèi)這些植物的產(chǎn)品的人來說都沒有毒 性的天然產(chǎn)物。第二 像任何其他蛋白質(zhì)一樣，作為天然產(chǎn)物的抗病原體性蛋白質(zhì)迅速地降 解，從而在其功效消逝后不留下任何殘留(Thomma等人，(2003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。還可以將植物抗病原體性蛋白質(zhì)用于開發(fā)抗真菌藥物，因?yàn)檎婧瞬≡w的控制一 直是醫(yī)學(xué)中的主要問題之一，其在最近幾十年中因?yàn)橛捎诩膊±鏏IDS、癌癥和器官移植 而引起的免疫抑制患者增多，以及因?yàn)槎嗫顾幮跃甑某霈F(xiàn)及絲狀真菌和酵母(其被認(rèn)為 是機(jī)會病原體)的新物種的出現(xiàn)而增加(Thomma等人，^00 Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。由于哺乳動物細(xì)胞和病原體細(xì)胞之間的相似性，抗真菌化合物應(yīng)當(dāng)瞄準(zhǔn)在哺乳 動物細(xì)胞中不存在或很少存在的分子，例如細(xì)胞壁的組分和毒力因子，并且它們還應(yīng)當(dāng)是 盡可能天然的、具有廣譜作用的、易于生產(chǎn)的且不誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)物(Walsh等人.Q000) Medical Mycology，38 :335-347)。此外，真菌細(xì)胞膜是用于開發(fā)這些試劑的有吸引力的 靶標(biāo)，因?yàn)檎婢さ慕M分例如鞘脂在哺乳動物細(xì)胞中在結(jié)構(gòu)上是不同的。植物抗病原體性 蛋白質(zhì)并不以鞘脂的生物合成作為靶標(biāo)，而是完全相反地起作用，因?yàn)槠浒袠?biāo)是自身鞘脂， 從而通過其作用于自身鞘脂而引起真菌膜的滲透化。這提供了高的選擇性，并從而提供了 對于治療真菌感染而言令人感興趣的視角。已發(fā)現(xiàn)了一些植物抗病原體性蛋白質(zhì)，例如 Dm-AMPl、Hs-AFPl禾口 Rs-AFP2，它們在μ M濃度下對于白色假絲酵母(Candida albicans) (其是在人中具有重大臨床關(guān)注度的病原體)是有活性的，這是該類型的植物蛋白質(zhì)用于 療法開發(fā)的潛力的一個(gè)實(shí)例(Thomma 等人.Q003)Curr Drug Targets Infect Disord. 3 1-8)。一個(gè)待解決的重要問題是獲得能夠有效地控制廣泛范圍的病原真菌和病原細(xì)菌 的具有蛋白質(zhì)特征的抗病原體性產(chǎn)物，這是在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)中非常重要的方面。發(fā)明詳述
本發(fā)明通過提供分離自大管煙草(Nicotiana megalosiphon)的新的抗病原體性 蛋白質(zhì)的編碼核苷酸序列(SEQ ID No. 1的核酸)以及氨基酸序列(SEQ ID No. 6)而促成 了解決上面提及的問題。本發(fā)明的核苷酸序列編碼小的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其對于各 種致病體具有顯著的效應(yīng)。本發(fā)明的目標(biāo)還為編碼多肽的核酸，所述多肽包含a)標(biāo)識為SEQ ID No. 6的氨基 酸序列，或b)這樣的氨基酸序列，其中在標(biāo)識為SEQ ID No. 6的氨基酸序列之中刪除、置換 和添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，并且其保持其控制由致病體引起的感染的特性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼本發(fā)明的抗病原體性蛋白質(zhì)的基因用于改善 植物針對各種致病體的抗性和防御水平。因此，本發(fā)明包括通過用包含SEQ ID No. 1的核酸 序列的核酸序列對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化來提高針對由致病體產(chǎn)生的植物疾病的抗性的方法， 所述遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)致包含SEQ ID No. 6的抗病原體性蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)。作為本發(fā)明的目標(biāo)的核酸分子可以用于植物轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 編碼抗病原體性蛋白質(zhì)的DNA序列可以用于下列植物物種的轉(zhuǎn)化玉蜀黍(Zea mays)、 蕓苔屬物種(Brassica sp·)、紫苜猜(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、兩色高 梁(Sorghum bicolor)、高梁(Sorghum vulgare)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)、向日 葵(Helianthus annuus)、普通小麥(Triticum arstivum)、大豆(Glycine max)、普通 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、甘薯(Ipomoea batatas)、 木薯(Manihot esculenta)、咖啡屬物種(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿 (Ananas comosus)、柑桔屬物禾中(Citrus spp·)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、色蕉屬物種(Musa spp.)、魚萼梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、(Psidium guajava) 、 芒果 (Mangifera indica) 、番木瓜(Carica papaya) 、 甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗屬物種(Saccharum spp. )、番茄(Lycopersicon esculentum)(Lactuca sativa)、黃瓜 (Phaseolus vulgaris) 、 (Cucumis sativus)、甜瓜 (Cucumis melo)、Hi (Hibiscus rosasanensis) ,朱槿 (Rosa spp.)、郁金香屬物種(Tulipa spp.)、火炬松(Pinus taeda)、、濕地松(Pinus elliotii)、西黃松(Pinus ponderosa)、小干 松(Pinus contorta)、$§身寸 公(Pinus radiata)?？梢栽谑沟媚軌颢@得表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)的在農(nóng)業(yè)上重要的植物的各種方法 中使用本發(fā)明。如此，可以將編碼抗病原體性蛋白質(zhì)的核酸序列(SEQ ID No. 1)與引入到 在農(nóng)業(yè)上重要的植物中的啟動子相組合地使用?？梢允褂帽磉_(dá)高水平的抗病原體性蛋白質(zhì) 和產(chǎn)生升高水平的抗病原體性蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型啟動子。在其他形式中，可以對編碼抗 病原體性蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行操作，并使之與組織特異性啟動子相融合以指導(dǎo)在特別是對病 原體易感的植物的組織中的表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是包含標(biāo)識為SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 7的氨基酸序列的 多肽。這些多肽中的任一種具有針對致病體的生物學(xué)活性，因此在本發(fā)明中稱為抗病原體 性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在其多肽鏈中包含與SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性 的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗病原體性多肽或蛋白質(zhì)通過重組方法或化 學(xué)合成獲得。本發(fā)明的抗病原體性蛋白質(zhì)可以通過重組DNA技術(shù)而在不同的宿主系統(tǒng)中 表達(dá)，并從它們中分離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗病原體性蛋白質(zhì)可以在酵母中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過重組DNA方法的表達(dá)在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中，優(yōu)選地在培養(yǎng)物上清液中進(jìn)行。通過應(yīng)用蛋白質(zhì)分離技術(shù)，可以從宿主中獲 得本發(fā)明的多肽?？梢酝ㄟ^使用免疫酶技術(shù)、色譜技術(shù)、細(xì)胞沉淀洗滌技術(shù)和現(xiàn)有技術(shù)中熟 知的其他技術(shù)來實(shí)現(xiàn)純化過程。氨基酸序列的變體也是本發(fā)明的目標(biāo)，所述變體由于序列SEQ ID No. 6與穩(wěn)定化 肽或者指導(dǎo)在宿主的確定區(qū)室中的表達(dá)的肽相融合而產(chǎn)生，并且保持對于該分子所證實(shí)的 生物學(xué)活性。它們的一個(gè)實(shí)例是其序列呈現(xiàn)為SEQ ID No. 7的融合蛋白。保持了對于致病 體的控制活性的所述抗病原體性蛋白質(zhì)的片段也是本發(fā)明的目標(biāo)，例如在序列列表中標(biāo)識 為SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9的那些片段。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于控制致病體的生物制品，其包含標(biāo)識為SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 7的多肽，或者與SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性的多肽。在本發(fā)明的情形 下，將來源于活生物體的產(chǎn)品稱為生物制品。在本發(fā)明中，首次在生物制品中使用這些抗病原體性蛋白質(zhì)，所述生物制品賦予 針對由致病體產(chǎn)生的主要疾病的高水平的保護(hù)，其中具有高穩(wěn)定性和低污染率，因此，它的 使用具有更好的公眾認(rèn)識和更少的規(guī)章要求。包含本發(fā)明的抗病原體性蛋白質(zhì)的生物制品 產(chǎn)生高水平的針對真菌和細(xì)菌的保護(hù)，這是以前未報(bào)道過的。為了獲得該生物制品，所述抗 病原體性蛋白質(zhì)可以通過懸浮液、溶液、乳劑、粉劑、顆粒劑、乳油、氣霧劑、浸漬型顆粒、輔 助劑、糊劑，或者通過包囊來進(jìn)行配制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物制品包含從 經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的宿主中純化的多肽，或者以包含在所述宿主的培養(yǎng)物上清液中的形式直接使 用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主是巴斯德畢赤酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以首次將其序列被要求保護(hù)的抗病原體性蛋白質(zhì) 以及包含其的生物制品用于控制廣泛多樣的病原體，例如曲霉屬(Aspergillus)；青霉屬 (Penicillium)；鏈格孢屬(Alternaria)(蕓苔生鏈格孢(Alternaria brassicola)、馬鈴 薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)、鏈格孢(Alternaria alternata))；甘蔗平臍蠕孢 (Bipolaris sacchari)；灰葡萄抱(Botrytis cinerea)；尾抱屬(Cercospora)(菊池尾抱 (Cercospora kikuchii)、玉蜀.1 (Cercospora zaea—maydis)、]lf— 包(Cercospora medicaginis)、大丑尾抱(Cercospora sojina)、高梁尾抱(Cercospora sorghi))；黃枝 孢(Cladosporium fulvun)；刺盤孢屬(Colletotrichum)(豆刺盤孢(Colletotrichum lindemuthianum)、束狀刺盤抱(Colletotrichum dematium)、禾生刺盤抱(Colletotrichum graminicola))；玉蜀黍殼色單隔孢(Diplodia maydis)；白粉菌屬(Erysiphe)(禾草白 粉菌禾草小禾中(Erysiphe graminis f. sp. graminis)、禾草白粉菌大麥小禾中(Erysiphe graminis f. sp. hordei))；鍵抱屬(Fusarium)(雪腐鍵抱(Fusarium nivale)、尖鍵 抱(Fusarium oxysporum)、禾谷鍵抱(Fusarium graminearum)、黃色鍵抱(Fusarium culmorum)、腐皮鐮孢(Fusarium solani)、串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)、粉紅鐮孢 (Fusarium roseum))；長螺抱屬(Helminthosporium)(大斑病長螺抱(Helminthosporium turcicum)、炭色長螺抱(Helminthosporium carbonum)、玉蜀黍長螺抱(Helminthosporium maydis)) ； M ^L ^！ 1 ] ji ^ (Maganaporthe grisea) ； ^·lif (Mycosphaerella f igensis) ； It β M (Peronospora)(東；!匕 It 霄(Peronospora manshurica)、煙草 If 霄 (Peronospora tabacina)) 5 " ;1 (Phoma betae) (Phytophthora) (1^ (Phytophthora cirmamomi)、惡疫霄(Phytophthora cactorum)、菜豆疫霄(Phytophthora phaseoli)、寄生疫 β (Phytophthora parasitica)、ttf 結(jié) Ii 腐疫 β (Phytophthora citrophthora) > ^dfIiSβS^nft (Phytophthora megasperma f. sp. sojae) ^ ^(Phytophthora infestans))；柄繡菌屬(Puccinia)(高梁柄繡菌(Puccinia sorghi)、 條形柄銹菌(Puccinia striiformis)、禾草柄銹菌小麥小禾中(Puccinia graminis f. sp. tritici)、天門冬屬柄繡菌(Puccinia asparagi)、隱匿柄繡菌(Puccinia recondita)、 I^Vc^M^M (Puccinia arachidis) >HTjS^M(Puccinia melanocephala))；腐霉屬 (Pythium) ()1 ^ (Pythium aphanidermatum)(Pythium ultimum)) MMM(Pyricularia oryzae)；絲核菌屬(Rhizoctonia)(立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、 禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)) ；Scerotium rolfsii ；核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)；殼針孢屬(Septoria)(番爺殼針孢(Septoria lycopersici)、大豆殼 針抱(Septoria glycines)、穎枯殼針抱(Septoria nodorum)、小麥殼針抱(Septoria tritici))；根串珠霉(Thielaviopsis basicola)；黑粉菌屬(Ustilago)(玉蜀黍黑粉菌 (Ustilago maydis)、甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scitaminea))；輪枝孢屬(Verticillium) (大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)、黑白輪枝孢(Verticillium alboatrum))； 丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae p. v. glycinea)；野油菜黃單胞 菌菜豆致病變種(Xanthomonas campestris p. v. phaseoli)；野油菜黃單胞菌苜蓿致 病變種(Xanthomonas campestris p. v. alfalfae)；野油菜黃單胞菌半透明致病變種 (Xanthomonas campestris p. v. translucens) ；丁香假單胞菌丁香致病變禾中(Pseudomonas syringae p. v. syringae)；古月胃卜軟腐歐文1 古月胃卜禾中(Erwinia carotovorum p. v. carotovora)；斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)；密執(zhí)安棍狀桿菌內(nèi)布拉斯加 亞禾中(Clavibacter michiganense subsp. Nebraskense) ； ^ ^ j[x Ifi lif (Pseudomonas avenae)；菊歐文氏菌玉米致病變種(Erwinia chrysanthemi p. v. zea)；胡蘿卜軟腐歐文氏 菌(Erwinia carotovora)；野油菜黃單胞菌棲絨毛草致病變種(Xanthomonas campestris p. v. holcicola)；須芒草假單胞菌(Pseudomonas andropogonis)和燕麥假單胞菌。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，該生物制品對于控制致植物病性真菌是有用的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方案中，在生物制品中所包含的多肽在1至9μ g/ml的濃度范圍中。用于控制植物致病體的方法也是本發(fā)明的一部分，其特征在于，向植物施用包含 標(biāo)識為SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7的多肽或者與SEQ ID No. 6具有至少60%同源性的多 肽的生物制品。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于控制植物致病體的方法的特征在于，與生物 殺蟲劑相聯(lián)合地施用本發(fā)明的生物制品。植物(轉(zhuǎn)基因植物)也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分，所述植物用SEQ ID No. 1的核酸 序列或包含SEQ ID No. 1的核酸序列進(jìn)行遺傳修飾以提高其針對由致病體產(chǎn)生的植物疾病 的抗性。附圖簡述

圖1.將目的抗病原體性蛋白質(zhì)克隆到在植物中(圖1A)和在酵母中(圖1B)的 表達(dá)載體之中的策略。圖2.通過載體PPIC9K，在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)，其與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子的信號肽相融合。在巴斯德畢赤酵母的上清液 中(A)和在由純化而得到的級分中(B)抗病原體性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。圖3.抗病原體性蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中的組成型表達(dá)以及評價(jià)針對疾病的抗 性的實(shí)驗(yàn)。該圖顯示了在對照樣品中和在表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因克隆中具有疾 病癥狀的葉和莖的百分比。(圖3Α)天仙子霜霉煙草小種(Peronospora hyoscyami f. sp tabacina)對于煙草的葉的影響。(圖3B)馬鈴薯早疫病鏈格孢對于馬鈴薯的葉的影響。 (圖3C)寄生疫霉對于煙草的莖的影響。(圖3D)致病疫霉對于馬鈴薯的葉的影響。在所述 圖中，柱表示a.經(jīng)接種的對照；b.未接種的對照；c.克隆1. 1 ；d.克隆1. 2 ；e.克隆1. 3。圖4.在不同濃度下，抗病原體性蛋白質(zhì)針對各種植物病原體的活性的實(shí)驗(yàn)。該圖 顯示了在液體培養(yǎng)基中病原體生長的抑制百分比，所述病原體用不同濃度的抗病原體性蛋 白質(zhì)進(jìn)行處理，所述抗病原體性蛋白質(zhì)與α因子的信號肽相融合(A)和以沒有信號肽的形 式合成(B)。圖4Β的圖例□與α因子的信號肽相融合的蛋白質(zhì)對于致病疫霉的效應(yīng)， 沒有信號肽的蛋白質(zhì)對于致病疫霉的效應(yīng)，■對照。圖5.抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02的制劑對于土壤真菌㈧和空氣真菌⑶的控 制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。在所述圖中，柱表示■對照植物，□用殺真菌劑處理的植物， 用抗病原體 性蛋白質(zhì)的制劑處理的植物。圖6.抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02的片段對于致病疫霉的生物學(xué)活性?！蹼腟EQ ID No 8對于致病疫霉的效應(yīng)， 肽SEQ ID No 9對于致病疫霉的效應(yīng)。實(shí)施例實(shí)施例1.植物材料的制備，編碼大管煙草的抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02的DNA 的分離和克隆。使大管煙草這一物種在按比例G 1)包含黑泥炭和稻殼的6英寸盆中生長，并 且于23°C在栽培室中進(jìn)行維持。將采集自哈瓦那(Havana)煙草田的天仙子霜霉煙草小種 的分離株用于接種。為此，通過放置具有5X103個(gè)孢子/ml (用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定的)的 數(shù)滴10μ 1的液滴，在6周齡的該物種的植物中進(jìn)行接種。在12小時(shí)的時(shí)間段期間，將植 物放置在具有高濕度(在袋內(nèi)通過使水霧化來獲得該濕度)的黑色塑料袋中以促進(jìn)感染。6天后，使用經(jīng)由離心的總RNA提取系統(tǒng)(!Iomega，Madison, WI, USA)，從經(jīng)接種 的大管煙草植物的葉中提取總RNA。最后，使用!Iomega公司的cDNA合成系統(tǒng)來合成雙鏈 互補(bǔ) DNA (cDNA)。使用選擇性的用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的遞減雜交系統(tǒng)(Clontech Jalo Alto,AC, USA)，通過遞減雜交來構(gòu)建cDNA文庫。將從用天仙子霜霉接種并在接種后6天收獲的大管 煙草植物中獲得的cDNA用作用于所述遞減的樣品。根據(jù)制造商的說明書，將該經(jīng)遞減的文 庫克隆到載體pGEM-T Easy (Promega)中。使用自動測序儀進(jìn)行cDNA的測序。在序列分析后，選擇出與數(shù)據(jù)庫中所報(bào)道的蛋 白質(zhì)具有低水平的同源性的DNA序列，將其用于后面的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2.用抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02的基因來轉(zhuǎn)化植物。煙草轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生二元載體的構(gòu)建。在該試驗(yàn)中，用寡核苷酸SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3分離出編碼抗病原體性蛋白質(zhì)的基因的完整cDNA，并且在限制位點(diǎn)Hind ΙΙΙ/Pst I處克隆到轉(zhuǎn)化載體pCambia 2300 中(圖 1A)。為此，通過 Zambryski 等人，(1983) EMBO Journal，2 :2143-2150 的方法來進(jìn) 行普通煙草植物的遺傳轉(zhuǎn)化。為此，通過液氮法(Hofgen和Willmitzer (198 Nucl. Acids Res. 16 9877)用所形成的二元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的 菌株AT 2沈0。轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的變種Petit Havana SR 1的普通煙草植物的葉盤。使用卡那 霉素(100mg/L)作為轉(zhuǎn)化事件的選擇標(biāo)記。將葉盤與土壤桿菌的重組菌在液體Murashige 和Skoog(MS)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)48小時(shí)。煙草幼苗的再生周)在包含25g/L蔗糖、Img/ L 6-芐氨基嘌呤(BAP)、0. lmg/L萘乙酸(NAA)、100mg/L卡那霉素和500mg/L凱福隆(Claf) 的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行。幼苗的生根(1-3周)在包含30g/L蔗糖、100mg/L卡那霉素和500mg/ L Claf的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行。馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生二元載體的構(gòu)建。在該試驗(yàn)中，用寡核苷酸SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3分離出編碼抗病原體性蛋白 質(zhì)的基因的完整cDNA，并且在限制位點(diǎn)Hind ΙΙΙ/Pst I處克隆到轉(zhuǎn)化載體pCambia 3300 中(圖1A)。在組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用的植物材料取自馬鈴薯栽培種“D6sir6e”的體外 胚芽。在試管中，使植物在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生長。將培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.7。使用培養(yǎng)4周 的植物，并在具有25°C和2000LUX照明的室中進(jìn)行維持。用作用于再生和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ) 的培養(yǎng)基為 SC (MS 鹽、0. %ig/L 維生素 Bl、100mg/L 肌醇、20g/L 蔗糖、3. 5mg/L BAP、0. Olmg/ LNAA、6g/L植物瓊脂化1^切38310)，38(1^鹽、10011^/1肌醇、2(^/1蔗糖、3. 5mg/L AG3、6g/L 植物瓊脂)，和PP (MS鹽、0. 4mg/L維生素Bi、100mg/L肌醇、2mg/L泛酸鈣、30g/L蔗糖、6g/L 植物瓊脂、5g/L活性炭和lmg/L硝酸硫代硫酸銀鈉(STS))。對于轉(zhuǎn)化，使用土壤桿菌的菌株At2260和LBA 4404。于在黑暗條件下，將細(xì) 菌在具有l(wèi)g/L酵母提取物、lg/L細(xì)菌用蛋白胨、5g/L蔗糖和5g/L粉末狀Lab-Iemco的培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至達(dá)到0. 7-0. 9的光密度(OD) 62(|。以下述方式，以兩個(gè)階段來進(jìn)行轉(zhuǎn)化-再生程序?qū)⑴囵B(yǎng)4周的體外植物的莖的節(jié) 段在黑暗中于25°C在MS培養(yǎng)基中溫育12-16小時(shí)，然后，通過將外植體與ImL細(xì)菌懸浮液 (每20ml MS)溫育7分鐘來進(jìn)行用根瘤土壤桿菌的感染，在黑暗中于22°C在SC培養(yǎng)基中 共培養(yǎng)48小時(shí)，并且將外植體放置在無菌濾紙上。小心地在MS培養(yǎng)基中洗滌外植體，并用 無菌濾紙進(jìn)行干燥。在第一個(gè)階段中，將它們在光照條件下在選擇性培養(yǎng)基SC、500mg/L凱 福隆和5mg/L草銨膦(PPT)中培養(yǎng)15天；和在第二個(gè)階段中，將它們在光照條件下在選擇 性培養(yǎng)基SB、500mg/L凱福隆和5mg/L PPT中進(jìn)行培養(yǎng)。最后，將幼苗在具有500mg/L凱福 隆的選擇性培養(yǎng)基PP上進(jìn)行個(gè)體化，并在5mg/LPPT中進(jìn)行選擇。實(shí)施例3.抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02對于針對疾病的抗性的影響的評價(jià)。在煙草中對于天仙子霜霉煙草小種的抗性的試驗(yàn)。將對于抗生素卡那霉素具有抗性并且具有抗病原體性蛋白質(zhì)基因的帶根植物移 植到花盆中，以讓其在溫室中適應(yīng)45天。在這一時(shí)間段后，通過放置具有5X IO3個(gè)孢子/ ml的數(shù)滴10 μ 1的液滴，用天仙子霜霉煙草小種接種一組6周齡的100個(gè)轉(zhuǎn)基因克隆。在 12小時(shí)的時(shí)間段期間，將植物放置在黑色且潮濕的塑料袋中以促進(jìn)感染。為此，通過在一周 后測量具有疾病癥狀的葉的百分比來進(jìn)行易感性的評價(jià)(圖3Α)。如在該圖中可以看出的， 當(dāng)我們在經(jīng)接種的對照和所述不同克隆之間比較具有癥狀的葉的百分比時(shí)，達(dá)到了高水平的對于該病原體的抗性，這顯示了用于控制該重要病原體的抗病原體性蛋白質(zhì)的效用。在煙草中對于寄生疫霉的抗性的試驗(yàn)。將對于抗生素卡那霉素具有抗性并且具有抗病原體性蛋白質(zhì)基因的帶根植物移 植到花盆中，以讓其在溫室中適應(yīng)45天。用寄生疫霉接種一組100個(gè)轉(zhuǎn)基因克隆，并且在 一個(gè)月后評價(jià)具有疾病癥狀的莖的百分比。為了進(jìn)行評價(jià)，使真菌寄生疫霉在包含濃度為 39g/L的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行生長。在10天的時(shí)間段期間，將 該真菌在27°C的溫度下進(jìn)行溫育。為了進(jìn)行煙草植物的接種，在莖的基部處放置包含所述 真菌的PDA皿(直徑1cm)，并且在的溫度下以高濕度進(jìn)行溫育(圖:3B)。如在該圖中 可以看出的，表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)的克隆達(dá)到了以前從未見到的高水平的針對該土壤病 原體的抗性，所述土壤病原體在該作物的秧田期造成嚴(yán)重的損失。該結(jié)果表明，將該蛋白質(zhì) 用于控制該真菌是可行的。
在馬鈴薯中對于致病疫霉的抗性的試驗(yàn)。該測試包括在受控的光照、溫度和相對濕度條件下，在5周齡的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植 物中接種真菌致病疫霉。用IO6個(gè)游動孢子/ml的懸浮液對表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)的100 個(gè)5周齡的克隆進(jìn)行噴灑。將所述克隆在具有85-95%的相對濕度和23°C的溫度的受控條 件下進(jìn)行維持。在接種后一周，將具有癥狀的葉的百分比用作對于該病原體的易感性的量 度(圖3C)。這是出人意料的結(jié)果，因?yàn)樵摬≡w是極其難以控制的。如在該圖中可見的， 與所使用的對照相比較，表達(dá)抗病原體性蛋白質(zhì)的克隆顯示出高水平的抗性。該結(jié)果表明 了該蛋白質(zhì)用于控制該病原體的可能性，特別是就其在世界范圍內(nèi)的重要性而言。在馬鈴薯中對于馬鈴薯早疫病鏈格孢的抗性的試驗(yàn)。在受控的光照、溫度和相對濕度條件下，在5周齡的100株轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中接 種真菌馬鈴薯早疫病鏈格孢。用IO6個(gè)孢子/ml的懸浮液對所述克隆進(jìn)行噴灑。將所述克 隆在具有85-95%的相對濕度和20°C的溫度的受控條件下進(jìn)行維持。將接種后一周，將具 有癥狀的葉的百分比用作對于該病原體的易感性的量度(圖3D)。所分析的三個(gè)克隆顯示 出高水平的對于該病原體的抗性，這首次為將該蛋白質(zhì)用于控制該病原體賦予了可能性。實(shí)施例4.用于在巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物上清液中以細(xì)胞外形式表達(dá)抗病原體性 蛋白質(zhì)NmDef-02的載體的構(gòu)建。使用相應(yīng)于SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的特異寡核苷酸來分離編碼大管煙草的 抗病原體性蛋白質(zhì)的基因，以獲得編碼抗病原體性蛋白質(zhì)NmDef-02的基因的完整序列，其 中具有對于將其克隆到表達(dá)載體PPICQk中來說必需的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)Bio I/EcoR I。該克隆策略在氨基末端向目的蛋白添加了釀酒酵母的α因子的信號肽(圖IB)，因此， 所得的蛋白質(zhì)相應(yīng)于SEQ ID No. 7。用Bgl II使該質(zhì)粒線性化，然后轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母 菌株GS115。為此，通過電穿孔來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。菌株GS115是his3營養(yǎng)缺陷型突變體，其在轉(zhuǎn) 化后獲得His+表型。在具有葡萄糖的基本培養(yǎng)基中選擇His+轉(zhuǎn)化體，在具有甘油的基本培 養(yǎng)基中培養(yǎng)所述克隆，并且在下用甲醇誘導(dǎo)126小時(shí)。通過斑點(diǎn)印跡(Dot Blot)來鑒定轉(zhuǎn)化體克隆。通過使用Southern印跡技術(shù)來確 定，在哪些中通過由重組質(zhì)粒的表達(dá)盒替代巴斯德畢赤酵母的AOXl基因而發(fā)生了整合，這 相應(yīng)于表型Muts (低的甲醇使用)和His+。巴斯德畢赤酵母分泌低水平的自身蛋白質(zhì)并且 其培養(yǎng)基不需要蛋白質(zhì)的補(bǔ)充，因此可以預(yù)期，分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中的異源蛋白質(zhì)是培養(yǎng)物上清液中全體蛋白質(zhì)的多數(shù)部分(大于80%) (Tschopp等人，(1987)Bio/Technology 5 1305-1308)。為此，在5升發(fā)酵罐中通過向培養(yǎng)基添加甲醇來進(jìn)行抗病原體性蛋白質(zhì)在巴 斯德畢赤酵母中的表達(dá)。該重組抗病原體性蛋白質(zhì)的表達(dá)和其完整性通過質(zhì)譜法來進(jìn)行檢查。實(shí)施例5.抗病原體性蛋白質(zhì)的純化和生物學(xué)活性試驗(yàn)。通過在pH 4. 5的25mM乙酸鈉中進(jìn)行透析，而從培養(yǎng)物上清液中純化與α因子 的信號肽相融合的抗病原體性蛋白質(zhì)(NmDef-Plus)；使透析產(chǎn)物通過用25mM乙酸鈉(pH 4.5)平衡的陽離子交換樹脂CM-kpharose Fast-flow ；并且用IM氯化鈉，50mM Tris (pH 7. 6)洗脫下所述蛋白質(zhì)。收集包含該蛋白質(zhì)的級分，并且通過使用具有孔徑大小(截止值) 為3kDa的膜的超速離心系統(tǒng)來進(jìn)行濃縮。為了進(jìn)行檢測，使用254nm的波長。通過在15% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠(Tris-Glycine)上的電泳來檢查純化，并 且通過銀染色來使所述蛋白質(zhì)可視化(圖2)。通過分光光度法來定量該抗病原體性蛋白質(zhì)的抗真菌活性，和通過光學(xué)顯微 術(shù)借助于乳酚藍(lán)染色來進(jìn)行菌絲體的分析(Terras等人，(1992) J. Biol. Chem. 267 14301-15309)。為此，在96-孔平板中進(jìn)行評價(jià)，在所述孔中添加有50 μ L馬鈴薯-葡萄糖 液體培養(yǎng)基、50 μ L病原真菌的孢子的懸浮液和20 μ L經(jīng)部分純化的抗病原體性蛋白質(zhì)。根據(jù)先前的報(bào)道(Terras等人，(1992) J. Biol. Chem. 267 :14301-15309)，通 過下面的公式來測定病原體的生長抑制百分比(PIC ;porcentaje de inhibicion del crecimiento)
權(quán)利要求
1.包含SEQID No. 1的核酸序列的核酸。
2.編碼多肽的核酸，所述多肽包含a)標(biāo)識為SEQID No. 6的氨基酸序列，或b)這樣的 氨基酸序列，其中在標(biāo)識為SEQ ID No. 6的氨基酸序列之中刪除、置換和添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基，并且其保持其控制由致病體引起的感染的特性。
3.通過用包含SEQID No. 1的核酸序列的核酸序列對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化來提高針對由 致病體產(chǎn)生的植物疾病的抗性的方法，所述遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)致包含SEQ ID No. 6的抗病原體性 蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)。
4.包含標(biāo)識為SEQID No. 6或SEQ ID No. 7的氨基酸序列的多肽。
5.在其多肽鏈中包含與SEQ.ID No. 6具有至少60%同源性的氨基酸序列的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5的多肽，其通過重組方法或化學(xué)合成獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多肽，其中通過重組DNA方法的表達(dá)在巴斯德畢赤酵母中，優(yōu)選地 在培養(yǎng)物上清液中進(jìn)行。
8.用于控制致病體的生物制品，其包含標(biāo)識為SEQID No. 6、SEQ ID No. 7的多肽，或 者與SEQ. ID No. 6具有至少60%同源性的多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的生物制品，其中所述多肽從經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的宿主中純化，或者以包 含在所述宿主的培養(yǎng)物上清液中的形式直接使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的生物制品，其中所述宿主是巴斯德畢赤酵母。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的生物制品，其中所述致病體是致植物病性真菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的生物制品，其中所述多肽在1至9μg/ml的濃度范圍內(nèi)。
13.用于控制致病體的生物制品，其包含標(biāo)識為SEQID No. 6或SEQ ID No. 7的多肽的 片段。
14.用于控制植物的致病體的方法，其特征在于，向所述植物施用權(quán)利要求8的生物制品
15.用于控制植物的致病體的方法，其特征在于，與生物殺蟲劑相聯(lián)合地施用權(quán)利要求 8的生物制品。
16.植物，其用SEQID No. 1的核酸序列進(jìn)行遺傳修飾以提高其針對由致病體產(chǎn)生的植 物疾病的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開了源自大管煙草(Nicotiana megalosiphon)的核酸序列，其編碼抗病原體性蛋白質(zhì)。本發(fā)明考慮了該核酸分子在獲得顯示出病原體抗性的在農(nóng)業(yè)上重要的轉(zhuǎn)基因植物中的用途。本發(fā)明還包括用于控制植物的致病體的生物制品，其包含該抗病原體性蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/82GK102046798SQ200980119164
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者諾德羅 C·G·博洛托, C·艾拉帕爾多, E·M·岡薩雷斯拉莫斯, G·A·恩里克斯奧夫雷貢, M·普霍爾費(fèi)雷爾, O·博拉斯伊達(dá)爾戈, R·C·波鐵列斯阿爾瓦克斯 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心