專(zhuān)利名稱(chēng)：菜豆幾丁質(zhì)酶基因及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的基因。
背景技術(shù)：
近年來(lái)真菌病對(duì)農(nóng)作物造成了巨大的危害，因此通過(guò)基因工程手段進(jìn)行真菌病防治具有重要意義。由于許多危害植物的病原真菌的細(xì)胞壁的組成成分之一是幾丁質(zhì)，而植物中尚未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的底物，所以幾丁質(zhì)酶在防御病原真菌侵害中具有重要作用，是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分。因此，幾丁質(zhì)酶基因的分離和轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為作物抗真菌病基因工程的研究熱點(diǎn)。
植物幾丁質(zhì)酶基因的研究開(kāi)始于1986年。1986年，Broglie等從菜豆中分離了幾丁質(zhì)酶基因，閱讀框?yàn)?84個(gè)核苷酸，編碼328個(gè)氨基酸。1991年，Zhu等以蠶豆幾丁質(zhì)酶基因片段為探針，從水稻基因組文庫(kù)分離到第一個(gè)幾丁質(zhì)酶RCH10基因的全部核苷酸序列，它含有一個(gè)無(wú)內(nèi)含子的開(kāi)放讀碼框，編碼由336個(gè)氨基酸組成的多肽。1994年，Wu等利用PCR技術(shù)得到玉米幾丁質(zhì)酶的兩個(gè)cDNA克隆PCH2和PCH11，并發(fā)現(xiàn)它們是編碼ClassI的幾丁質(zhì)酶。
目前幾丁質(zhì)酶基因大多是從玉米、水稻、煙草中分離得到的，對(duì)菜豆幾丁質(zhì)酶基因的研究較少。并且近年來(lái)所分離到的幾丁質(zhì)酶基因在轉(zhuǎn)化植株中雖然顯示出一定的抗真菌病能力，但是仍然需要分離具有更強(qiáng)抗真菌病能力的幾丁質(zhì)酶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在從菜豆基因組中分離一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，擴(kuò)大植物抗真菌病基因資源，從而為植物抗病蟲(chóng)害及品質(zhì)改良基因工程提供更加豐富的優(yōu)良候選基因。本發(fā)明的菜豆幾丁質(zhì)酶基因Bchi是以菜豆品種油豆總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的，它具有如下所示核苷酸序列agagaaatga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg60ctgttagttg gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc120ccagggggca actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc180aaggattgcc agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc240
atatccaggt ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc 300aaaggcttct acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga 360aacaccggag acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct 420cacgaaacaa ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc 480ttcgtgaggg agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc 540cctgggcagc agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt 600cagtgcggaa gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac 660tctgtcatct ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct 720tcctcccacg acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc 780cggcttcccg gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga 840ggacaggaca gctagggcac agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt 900ggagttggtt atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc 960ttcctctctg accttgtcac ctctcagtga cactgccatc ccatcagaat aaataaactc 1020ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat 1080caataaat1088構(gòu)建重組載體采用的載體為pUC18載體，這是一種公知的載體，在市場(chǎng)上即有銷(xiāo)售，如大連寶生物工程公司生產(chǎn)的、商品名稱(chēng)即為“PUC18”的載體，這是一種常用的克隆載體，大小為2686bp，具有Amp抗性基因。帶有一段大腸桿菌lacZ的調(diào)控序列和N-端146個(gè)氨基酸的編碼信息，此編碼區(qū)插入了多克隆位點(diǎn)，若無(wú)外源基因插入，載體會(huì)與大腸桿菌lacZ的C-端序列功能互補(bǔ)，即α互補(bǔ)，產(chǎn)生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，則破壞了其讀碼框，產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的肽段，因此，在附加X(jué)-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的細(xì)菌。
外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞所用宿主細(xì)胞為E.coliJM109，基因?qū)胨拗鞯倪^(guò)程即CaCl2法制備E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞的過(guò)程(1)E.coliJM109在LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落接入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取過(guò)夜活化的E.coliJM109菌液1ml置于100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.3；(3將菌液分裝于兩個(gè)預(yù)冷的50ml無(wú)菌離心管中，冰浴30min。
(4)4℃，4000rpm，離心10min，棄上清；(5)加入10ml冰冷的0.1MCaCl2，重懸菌體，冰浴30min；(6)4℃，4000rpm，離心10min，棄上清；(7)加入2ml冰冷的0.1MCaCl2，重懸菌體。
陽(yáng)性重組子的篩選和鑒定(1)藍(lán)白斑反應(yīng)篩選陽(yáng)性重組子根據(jù)α-互補(bǔ)反應(yīng)的原理，在附加X(jué)-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的菌落，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的菌落，因此白色菌落可初步鑒定為陽(yáng)性重組子。
(2)陽(yáng)性重組子的酶切鑒定提取白斑菌落質(zhì)粒，利用SacI和BamHI對(duì)重組質(zhì)粒雙酶切分析，若電泳顯示出約2.7kb(pUC18載體大小)和約1.1kb(目的基因大小)兩條帶，則證明質(zhì)粒重組正確，是陽(yáng)性重組子。
基因產(chǎn)物的表達(dá)及其制備本發(fā)明基因產(chǎn)物表達(dá)所采用的宿主細(xì)胞為E.coliM15，將幾丁質(zhì)酶基因Bchi與原核表達(dá)載體pQE-30重組，pQE-30載體由中科院微生物研究所提供，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-Bchi，熱激法轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌E.coliM15感受態(tài)細(xì)胞中，1.0mMIPTG誘導(dǎo)3.5h后，經(jīng)12％的SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)基因的表達(dá)情況將分離的Bchi基因與原核表達(dá)載體pQE-30連接，構(gòu)建成pQE-Bchi重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)后表達(dá)出目的蛋白(35～36kD)，證實(shí)該基因是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。
本發(fā)明Bch編碼的多肽產(chǎn)物的氨基酸序列為mkknrmmimi csvgvvwmll vggsygeqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd 60cqsqcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh rndgvcpakg gnccsqfgwc akaypsfgnt 120gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg 180qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss 240hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv 300gygnnldcys qtpfgnslfl sdlvtsq 327菜豆幾丁質(zhì)酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化將幾丁質(zhì)酶基因Bchi與植物表達(dá)載體pMHL7133-Gus重組，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMHL7133-Bchi，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌pRiA4b介導(dǎo)將pMHL7133-Bchi轉(zhuǎn)化到煙草中，所用pMHL7133-Gus載體由日本農(nóng)林水產(chǎn)省生物資源所大喬先生惠贈(zèng)。
轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定采用氨基葡萄糖法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株葉片幾丁質(zhì)酶活力。
(1)幾丁質(zhì)酶液提取及處理①稱(chēng)取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照植株)葉片各2g，放入預(yù)冷的研缽中，并加入6ml 0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)及少許石英砂，冰浴中研磨成勻漿；②4℃，12000rpm離心15min，上清液即為粗酶液；③取1ml酶液，加1ml 0.5％殼聚糖(pH6.0)2ml 0.2M醋酸鈉(pH5.2)，混勻。同時(shí)用樣品緩沖液代替底物做空白對(duì)照；④37℃水浴2h，4℃，12000rpm離心5min，取上清液備用。
(2)外切酶活力測(cè)定①取1ml上清液于試管中，加1ml H2O及1ml乙酰丙酮試劑，搖勻；②用玻璃球封住試管口，沸水中加熱20min，然后冷卻至室溫；③加5ml無(wú)水乙醇和1mlDMAB試劑，再以無(wú)水乙醇補(bǔ)足至總體積10ml，充分混勻；④65℃-70℃水浴10min，加速CO2釋放，然后冷卻至室溫，測(cè)530nm處的吸收值。用水代替酶液做空白對(duì)照。
(3)總酶活力測(cè)定①取1ml上清液于試管中，加100μl 1M磷酸緩沖液(pH7.1)和70μl3％蝸牛酶，搖勻；②37℃水浴2h，加水至總體積為2ml；③65℃-70℃水浴10min，加速CO2釋放，冷卻至室溫，測(cè)530nm處的吸收值。
(4)計(jì)算方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，將OD值換算成氨基葡萄糖產(chǎn)量，以每小時(shí)分解膠體殼聚糖產(chǎn)生1μg氨基葡萄糖為一個(gè)酶活力單位。
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y＝329.82X-3.3249XOD值 Y氨基葡萄糖量(μg)直線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r＝0.9923
(5)內(nèi)切酶活力計(jì)算內(nèi)切酶活力＝總酶活力-外切酶活力。
本發(fā)明基因是從五常油豆基因組中分離得到的，基因序列在GenBank注冊(cè)號(hào)為AY357300。該基因全長(zhǎng)1088bp，其中T、C、G、A分別為232(21.3％)、330(30.3％)、276(25.4％)、250(23.0％)。在7bp處有起始密碼子ATG，在988bp處有終止密碼子TGA，在1008bp和1082bp處各有一個(gè)poly(A)附加信號(hào)。該序列無(wú)內(nèi)含子，具有981bp完整的開(kāi)放讀碼框，編碼327個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為35.3kD，等電點(diǎn)pI為7.93。在結(jié)構(gòu)上具有Class Ia幾丁質(zhì)酶前體的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)構(gòu)分為四個(gè)區(qū)域N-端具有一個(gè)26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；41個(gè)氨基酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，其中有8個(gè)半胱氨酸；由249個(gè)氨基酸組成的高度保守的催化區(qū)；C-端為由11個(gè)氨基酸組成的液泡定位多肽。在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)之間無(wú)富含脯氨酸的可變交連區(qū)。通過(guò)GenBank基因序列比對(duì)分析，表明與已注冊(cè)的菜豆Class I幾丁質(zhì)酶同源性為90～98％，證明是一個(gè)新的菜豆Class Ia幾丁質(zhì)酶基因，為堿性?xún)?nèi)切幾丁質(zhì)酶基因。將分離的Bchi基因與原核表達(dá)載體pQE-30連接，構(gòu)建成pQE-Bchi重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)后表達(dá)出目的蛋白(35～36kD)，證實(shí)該基因是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。本發(fā)明在從菜豆基因組中分離出一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，擴(kuò)大了植物抗真菌病基因資源，從而為植物抗病蟲(chóng)害及品質(zhì)改良基因工程提供了更加豐富的優(yōu)良候選基因。本發(fā)明將分離的Bchi基因與植物表達(dá)載體pMHL7133-Gus連接，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pMHL7133-Bchi，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌pRiA4b介導(dǎo)將pMHL7133-Bchi轉(zhuǎn)化到煙草中。氨基葡萄糖法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力是非轉(zhuǎn)基因煙草(對(duì)照植株)的1.4～2.3倍，證實(shí)Bchi基因在煙草中得到表達(dá)，提高了煙草植株的幾丁質(zhì)酶活力。赤星病菌鏈格孢菌對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草抗真菌病能力測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片表面基本沒(méi)有病斑，而對(duì)照植株葉表面接菌部位發(fā)黃，產(chǎn)生褐色的病斑，表明陽(yáng)性植株較對(duì)照植株對(duì)真菌病害有較強(qiáng)的抗性，進(jìn)一步證實(shí)Bchi基因在煙草中得到表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶具有較強(qiáng)的抗真菌病害能力。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的田間調(diào)查結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照植株對(duì)蚜蟲(chóng)具有一定抗性，證明Bchi基因的表達(dá)產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶具有一定的抗蚜蟲(chóng)能力。


圖1是pUC18載體圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的菜豆幾丁質(zhì)酶基因Bchi是以菜豆品種五常油豆總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的。對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá)檢測(cè)，同時(shí)構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定和抗真菌病能力測(cè)驗(yàn)。其具體方法如下1、菜豆幾丁質(zhì)酶基因的克隆(1)PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中收錄的菜豆mRNA序列，采用軟件Primer Primier5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，序列如下P1(5′端引物)5′GGGGATCCAGAGAATGAAGAAGAATAGG 3′BamHIP2(3′端引物)5′GGGAGCTCATTTATTGATAGATGGTGGG3′SacI(2)菜豆基因組總DNA的提取取菜豆植株幼葉約100mg，放入液氮中研磨成粉末狀，采用SDS法提取。
(3)幾丁質(zhì)酶基因的PC擴(kuò)增以菜豆總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系1x Buffer，0.2mM dNTP，引物P1、P2各0.4μM，ExTaqDNA聚合酶1.25U，模板DNA0.1～1μg，加ddH2O至25μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。
(4)PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物用柱式DNA膠回收試劑盒回收，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。回收產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶SacI、BamHI酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pUC18克隆載體連接，連接體系pUC18載體50ng，PCR產(chǎn)物50～100ng，1x Ligase Buffer，T4DNA連接酶1U，加ddH2O至20μL。23℃～26℃連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiJM109感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進(jìn)行酶切以鑒定陽(yáng)性重組子。
(5)DNA序列測(cè)定與分析利用ABI377熒光自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用軟件DNAMAN進(jìn)行序列比較分析，序列的同源性比較在http//www.ncbi.nlm.gov網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行。
2.構(gòu)建重組載體采用的載體為pUC18載體，這是一種公知的載體，在市場(chǎng)上即有銷(xiāo)售，如大連寶生物工程公司生產(chǎn)的、商品名稱(chēng)即為“PUC18”的載體，這是一種常用的克隆載體，大小為2686bp，具有Amp抗性基因。帶有一段大腸桿菌lacZ的調(diào)控序列和N-端146個(gè)氨基酸的編碼信息，此編碼區(qū)插入了多克隆位點(diǎn)，若無(wú)外源基因插入，載體會(huì)與大腸桿菌lacZ的C-端序列功能互補(bǔ)，即α互補(bǔ)，產(chǎn)生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，則破壞了其讀碼框，產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的肽段，因此，在附加X(jué)-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的細(xì)菌。
3、外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞所用宿主細(xì)胞為E.coliJM109，基因?qū)胨拗鞯倪^(guò)程即CaCl2法制備E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞的過(guò)程(1)E.coliJM109在LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落接入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取過(guò)夜活化的E.coliJM109菌液1ml置于100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.3；(3)將菌液分裝于兩個(gè)預(yù)冷的50ml無(wú)菌離心管中，冰浴30min。
(4)4℃，4000rpm，離心10min，棄上清；(5)加入10ml冰冷的0.1MCaCl2，重懸菌體，冰浴30min；(6)4℃，4000rpm，離心10min，棄上清；(7)加入2ml冰冷的0.1MCaCl2，重懸菌體。
熱激法轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞(1)取200μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，加入4μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物。
(2)冰浴30min。
(3)42℃水浴中熱激90s，勿搖動(dòng)。
(4)冰浴2-3min。
(5)加入800μl無(wú)附加抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻，37℃200-250rpm搖床振蕩預(yù)表達(dá)培養(yǎng)45-60min。
(6)室溫，4000rpm，離心5min，棄去900μl上清液，余液將菌體懸浮。
(7)將細(xì)菌涂布在附加50mg/L Amp、4μlIPTG和40μlX-gal的LB固體培養(yǎng)基上。
(8)平板于37℃正向放置至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
4、陽(yáng)性重組子的篩選和鑒定(1)藍(lán)白斑反應(yīng)篩選陽(yáng)性重組子根據(jù)α-互補(bǔ)反應(yīng)的原理，在附加X(jué)-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的菌落，藍(lán)色菌落為帶有重新環(huán)化載體的菌落，因此白色菌落可初步鑒定為陽(yáng)性重組子。
(2)陽(yáng)性重組子的酶切鑒定提取白斑菌落質(zhì)粒，利用SacI和BamHI對(duì)重組質(zhì)粒雙酶切分析，電泳顯示出約2.7kb(pUC18載體大小)和約1.1kb(目的基因大小)兩條帶，證明質(zhì)粒重組正確，是陽(yáng)性重組子。
基因產(chǎn)物的表達(dá)及其制備本發(fā)明基因表達(dá)所采用的宿主細(xì)胞為E.coliM15，將幾丁質(zhì)酶基因Bchi與原核表達(dá)載體pQE-30重組，pQE-30載體由中科院微生物研究所提供，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-Bchi，熱激法轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)宿主菌E.coliM15感受態(tài)細(xì)胞中，1.0mM IPTG誘導(dǎo)3.5h后，經(jīng)12％的SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)基因的表達(dá)情況誘導(dǎo)后表達(dá)出目的蛋白(35～36kD)，證實(shí)該基因是一個(gè)具有表達(dá)功能的基因。
Bchi編碼的多肽產(chǎn)物符合Class Ia幾丁質(zhì)酶前體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)其N(xiāo)-端具有一個(gè)26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，其中疏水性氨基酸為18個(gè)，約占69％，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在G26-E27之間，與幾丁質(zhì)酶的細(xì)胞定位有關(guān)，在成熟肽中將被切除；其后是富含8個(gè)半胱氨酸(Cys)、長(zhǎng)41個(gè)氨基酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)；還有由249個(gè)氨基酸組成的高度保守的催化區(qū)，在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)之間無(wú)富含脯氨酸(Pro)的可變交連區(qū)；C-端有由11個(gè)氨基酸組成的液泡定位多肽序列，見(jiàn)圖1。因此Bchi編碼的蛋白產(chǎn)物屬于Class Ia幾丁質(zhì)酶，且為堿性?xún)?nèi)切幾丁質(zhì)酶。該基因序列已被GenBank收錄，登錄號(hào)為AY357300。
5、菜豆幾丁質(zhì)酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化將幾丁質(zhì)酶基因Bchi與植物表達(dá)載體pMHL7133-Gus重組，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMHL7133-Bchi，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌pRiA4b介導(dǎo)將pMHL7133-Bchi轉(zhuǎn)化到煙草中，所用pMHL7133-Gus載體由日本農(nóng)林水產(chǎn)省生物資源所大喬先生惠贈(zèng)。
6、轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定
采用氨基葡萄糖法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株葉片幾丁質(zhì)酶活力。
(1)幾丁質(zhì)酶液提取及處理①稱(chēng)取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株(對(duì)照植株)葉片各2g，放入預(yù)冷的研缽中，并加入6ml 0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)及少許石英砂，冰浴中研磨成勻漿；②4℃，12000rpm離心15min，上清液即為粗酶液；③取1ml酶液，加1ml 0.5％殼聚糖(pH6.0)和2ml 0.2M醋酸鈉(pH5.2)，混勻。同時(shí)用樣品緩沖液代替底物做空白對(duì)照；④37℃水浴2h，4℃，12000rpm離心5min，取上清液備用。
(2)外切酶活力測(cè)定①取1ml上清液于試管中，加1ml H2O及1ml乙酰丙酮試劑，搖勻；②用玻璃球封住試管口，沸水中加熱20min，然后冷卻至室溫；③加5ml無(wú)水乙醇和1ml DMAB試劑，再以無(wú)水乙醇補(bǔ)足至總體積10ml，充分混勻；④65℃-70℃水浴10min，加速CO2釋放，然后冷卻至室溫，測(cè)530nm處的吸收值。用水代替酶液做空白對(duì)照。
(3)總酶活力測(cè)定①取1ml上清液于試管中，加100μl 1M磷酸緩沖液(pH7.1)和70μl 3％蝸牛酶，搖勻；②37℃水浴2h，加水至總體積為2ml；③65℃-70℃水浴10min，加速CO2釋放，冷卻至室溫，測(cè)530nm處的吸收值。
(4)計(jì)算方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，將OD值換算成氨基葡萄糖產(chǎn)量，以每小時(shí)分解膠體殼聚糖產(chǎn)生1μg氨基葡萄糖為一個(gè)酶活力單位。
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y＝329.82X-3.3249XOD值Y氨基葡萄糖量(μg)直線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r=0.9923(5)內(nèi)切酶活力計(jì)算內(nèi)切酶活力＝總酶活力-外切酶活力。
7、轉(zhuǎn)基因煙草抗真菌病實(shí)驗(yàn)
所用真菌為赤星病菌鏈格孢菌。將菌絲接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天。用1ml無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面制成菌液，倒入培養(yǎng)皿，再將45℃的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，搖勻，培養(yǎng)7天后使用。接菌過(guò)程如下①制備孢子懸浮液用適量無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面，保證菌液濃度不低于100000個(gè)/ml，在孢子懸浮液中加入1％的葡萄糖。
②接菌選取生長(zhǎng)狀況一致的轉(zhuǎn)基因植株葉片和非轉(zhuǎn)基因植株葉片，取20ml孢子液滴在濾紙片上，將濾紙貼在煙草葉片上。
③瓷盤(pán)底鋪上濾紙，濾紙浸濕。接菌葉片放置在瓷盤(pán)中的濾紙上，蓋上玻璃板，保濕20℃光照培養(yǎng)2周，觀(guān)察感病情況。
測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活力是非轉(zhuǎn)基因煙草(對(duì)照植株)的1.4～2.3倍，證實(shí)Bchi基因在煙草中得到表達(dá)，提高了煙草植株的幾丁質(zhì)酶活力。赤星病菌鏈格孢菌對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草抗真菌病能力測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片表面基本沒(méi)有病斑，而對(duì)照植株葉表面接菌部位發(fā)黃，產(chǎn)生褐色的病斑，表明陽(yáng)性植株較對(duì)照植株對(duì)真菌病害有較強(qiáng)的抗性，進(jìn)一步證實(shí)Bchi基因在煙草中得到表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶具有較強(qiáng)的抗真菌病害能力。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的田間調(diào)查結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照植株對(duì)蚜蟲(chóng)具有一定抗性，證明Bchi基因的表達(dá)產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶具有一定的抗蚜蟲(chóng)能力。
附序列表菜豆幾丁質(zhì)酶基因Bchi的核苷酸序列agagaaatga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg60ctgttagttg gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc120ccagggggca actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc180aaggattgcc agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc240atatccaggt ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc300aaaggcttct acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga360aacaccggag acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct420cacgaaacaa ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc480ttcgtgaggg agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc540cctgggcagc agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt600cagtgcggaa gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac660tctgtcatct ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct720tcctcccacg acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc780cggcttcccg gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga840ggacaggaca gcagggttca agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt900ggagttggtt atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc960ttcctctctg accttgtcac ctctcagtgacactgccatc ccatcag taaactc 1020(5)ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat 1080c t 1088(6)Bchi編碼的多肽產(chǎn)物的氨基酸序列mkknrmmimi csvgvvwmll vggsygeqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd 60(1)(2)cqsqspcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh mdgcpakg fytyafiaa akaypsfgnt 120gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg 180(3)qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss 240hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv 300gygnnldcys qtpfgnslfl sdlvtsq327(4)幾丁質(zhì)酶基因Bchi核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列(1)N-端信號(hào)肽；(2)幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)；(3)催化區(qū)；(4)液泡定位多肽；(5)、(6)poly(A)附加信號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種菜豆幾丁質(zhì)酶基因，該基因命名為Bchi，它具有如下所示DNA序列agagaaatga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg 60ctgttagttg gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc120ccagggggca actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc180aaggattgcc agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc240atatccaggt ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc300aaaggcttct acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga360aacaccggag acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct420cacgaaacaa ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc480ttcgtgaggg agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc540cctgggcagc agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt600cagtgcggaa gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac660tctgtcatct ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct720tcctcccacg acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc780cggcttcccg gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga840ggacaggaca gcagggttca agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt900ggagttggtt atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc960ttcctctctg accttgtcac ctctcagtga cactgccatc ccatcagaat aaataaactc 1020ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat 1080caataaat1088。
2.一種權(quán)利要求1所述菜豆幾丁質(zhì)酶基因的編碼產(chǎn)物，它具有如下所示的氨基酸序列mkknrmmimi csvgvvwmll vggsygeqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd60cqsqcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh rndgvcpakg fytydafiaa akaypsfgnt120gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg180qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss240hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv300gygnnldcys qtpfgnslfl sdlvtsq327。
全文摘要
菜豆幾丁質(zhì)酶基因及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列，它涉及一種新的基因序列?，F(xiàn)在需要分離具有強(qiáng)抗真菌病能力的幾丁質(zhì)酶基因。本發(fā)明基因序列在GenBank注冊(cè)號(hào)為AY357300，該基因全長(zhǎng)1088bp，其中T、C、G、A分別為232 (21.3％)、330(30.3％)、276(25.4％)、250(23.0％)。在7bp處有起始密碼子ATG，在988bp處有終止密碼子TGA，在1008bp和1082bp處各有一個(gè)poly(A)附加信號(hào)。該序列無(wú)內(nèi)含子，具有981bp完整的開(kāi)放讀碼框，編碼327個(gè)氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為35.3kD，等電點(diǎn)pI為7.93。本發(fā)明在從菜豆基因組中分離出一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，擴(kuò)大了植物抗真菌病基因資源，從而為植物抗病蟲(chóng)害及品質(zhì)改良基因工程提供了更加豐富的優(yōu)良候選基因。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1597963SQ20041004388
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者徐香玲, 王全偉, 李集臨, 李新玲, 閆玉清, 張延明, 徐淑紅 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)