本發(fā)明涉及中藥基原物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種哈蟆油藥材及其基原動物鑒定的PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

中藥鑒定是研究中藥品種、質(zhì)量，制定中藥標(biāo)準(zhǔn)，尋找和擴(kuò)大藥源的前提和基礎(chǔ)。中藥四大傳統(tǒng)鑒定方法為基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。傳統(tǒng)鑒定方法主要依據(jù)性狀特征差異進(jìn)行鑒定，這些性狀特征是與物種的不同發(fā)育階段和環(huán)境緊密相關(guān)的表現(xiàn)型，易受環(huán)境飾變和知識經(jīng)驗(yàn)影響。而基因組DNA序列由物種的遺傳基礎(chǔ)決定，也是不同生物的不可變“身份證”，這為動植物分類和鑒定提供了本質(zhì)依據(jù)。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組序列中一段通用DNA片段，對PCR擴(kuò)增的通用DNA片段進(jìn)行比較分析完成物種快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定。當(dāng)前中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已經(jīng)納入2010版、2015版中國藥典，該指導(dǎo)原則規(guī)定動物類中藥材采用細(xì)胞色素C氧化酶亞基(COI)為主體序列，利用PCR通用引物(LCO1490和HCO2198)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增序列測序后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對，從而確定動物藥材基原物種。

但是，現(xiàn)在的通用引物及鑒定方法在哈蟆油藥材鑒定中的使用效果并不好，非特異擴(kuò)增較多，無法進(jìn)行測序。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員想要開發(fā)一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決COI通用引物在哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定中存在非特異擴(kuò)增的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的擴(kuò)增引物。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，該擴(kuò)增引物對的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明的另一個(gè)方面還提供了一種獲得哈蟆油藥材DNA條形碼的擴(kuò)增方法。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，該擴(kuò)增方法采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

進(jìn)一步地，上述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50℃-54℃。

進(jìn)一步地，上述PCR擴(kuò)增的條件為：94℃變性1分鐘；94℃變性1分鐘，50℃-54℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

優(yōu)選地，上述PCR擴(kuò)增的退火溫度為54℃。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于，使用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的擴(kuò)增引物，并結(jié)合50℃-54℃退火的PCR反應(yīng)條件，尤其是54℃的退火溫度，能夠?qū)悠稤NA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，從DNA電泳結(jié)果可以得到單一擴(kuò)增條帶。基于上述引物及擴(kuò)增方法，能快速有效的獲得哈蟆油藥材DNA條形碼，使利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行哈蟆油藥材基原動物鑒定成為可能。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的退火溫度篩選電泳圖；其中，泳道1為DL 2000Marker；泳道2和11為陰性對照；泳道3-10為樣品LWY1，退火溫度分別為60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52.0℃、50.7℃和50℃(自左及右)；泳道12-19為樣品LWY7，退火溫度分別為60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52.0℃、50.7℃和50℃(自左及右)。

圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中進(jìn)行PCR擴(kuò)增方法驗(yàn)證的DNA電泳圖；其中，泳道1為DL 2000Marker；泳道2-17為LWY1-16號樣品，泳道18為陰性對照。

圖3是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中樣品LWY1的PCR結(jié)果的部分測序峰圖(含正反向測序結(jié)果)。

圖4是采用2015版中國藥典中的COI通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的結(jié)果圖。其中，泳道1為DL 2000Marker；泳道2-17為LWY1-16號樣品，泳道18為陰性對照。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅作為例證的目的，不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下具體實(shí)施方式中使用的PCR試劑為PC56-KOD DNA Polymerase(購自北京艾德萊生物科技有限公司)。其他試劑若無特殊說明，均可直接購買獲得。

實(shí)施例1哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定的COI引物設(shè)計(jì)

哈蟆油的基原動物為蛙科(Ranidae)林蛙屬的中國林蛙，因此選取GenBank中蛙科的所有全長COI序列，通過序列比對，設(shè)計(jì)與通用引物(LCO1490和HCO2198)擴(kuò)增區(qū)域大致相同的引物，以確保條形碼數(shù)據(jù)之間的可比性。

由于蛙科動物不同屬間的COI序列差異較大，因此，在設(shè)計(jì)能通用的擴(kuò)增引物時(shí)具有較大的困難，故通過簡并引物的方式，即在引物的3’端引入簡并堿基，最終設(shè)計(jì)了適合于哈蟆油藥材的COI條形碼擴(kuò)增的PCR引物，具體如下：

正向引物L(fēng)WF01(SEQ ID No.1)：

5’-TCTC TACT AATC ATAA AGA YATYGG-3’；

反向引物L(fēng)WR01(SEQ ID No.2)：

5’-TAAA CTTC AGGG TGAC CAAARAATCA-3’；

其中，R代表可以是A或G；Y代表可以是C或者T。

實(shí)施例2哈蟆油藥材COI條形碼擴(kuò)增方法的確定

購買了13批次哈蟆油藥材樣品和3批次哈蟆油標(biāo)準(zhǔn)對照藥材樣品，基原物種均為中國林蛙Rana temporaria chensinensis David。具體的：

LWY1-12，LWY14：13批次哈蟆油藥材；

LWY13，LWY15-16：中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)對照哈蟆油藥材。

選擇LWY1和LWY7哈蟆油藥材樣品進(jìn)行本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)。

1.模板DNA準(zhǔn)備

取哈蟆油藥材約5mg，置入2.0mL離心管，加入500μL含0.1％～2％鹽酸的水對哈蟆油組織進(jìn)行復(fù)性，使用研磨杵反復(fù)研磨30秒左右，至無明顯顆粒并混勻。

加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸鈉、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸鈉的緩沖液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解樣品，使用渦旋混合儀混勻30秒左右，56℃孵育至溶液澄清，每半小時(shí)顛倒混合樣品2～3次，或者使用水浴振蕩器。

加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM已二胺四乙酸的緩沖液，渦旋混勻30秒。

加入700μL酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入700μL氯仿/異戊醇(24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

加入等體積無水乙醇，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下靜置2～5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入1/10體積的3mol/L PH 5.2的乙酸鈉，在渦旋混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻。

加入2～2.5倍體積冰冷的無水乙醇或等體積異丙醇，在渦旋混合器上振蕩混勻，冰浴5分鐘，室溫下以最高速度離心5分鐘。

棄去上清，加入1mL預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀1～2次。

沉淀在真空干燥器或者真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，或者小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，常溫自然干燥。

加入50μL ddH2O溶解，獲得模版DNA，在4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用上述方法提取哈蟆油DNA，避免了哈蟆油藥材的高度膨脹，且獲得的模版DNA純度較高。

2.PCR反應(yīng)體系(以25μL為參照)

2×Taq PCR Mix：12.50μL

正向引物：1.00μL

反向引物：1.00μL

dd H₂O^$：8.50μL

模板^$：2.00μL

^$根據(jù)模板濃度可適當(dāng)調(diào)整

3.PCR反應(yīng)的退火溫度篩選

為了能保證擴(kuò)增效果，對PCR擴(kuò)增的退火溫度進(jìn)行了篩選，測試了60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52.0℃、50.7℃和50℃的退火溫度梯度。篩選選用了LWY1和LWY7號DNA。

PCR反應(yīng)條件為：

94℃1分鐘；94℃1分鐘，上述退火溫度，1.5分鐘，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。

PCR產(chǎn)物的DNA電泳結(jié)果如圖1所示，當(dāng)退火溫度在50℃至54℃的范圍時(shí)，兩種待測樣品均擴(kuò)增出了較多的目的產(chǎn)物(即圖中的條帶明亮)。但是，當(dāng)退火溫度較低，如在50℃時(shí)，由于非特異性反應(yīng)的存在，產(chǎn)生了一些非特異性產(chǎn)物。因此，在保證擴(kuò)增產(chǎn)物的量和減少非特異性產(chǎn)物的前提下，選擇了54℃作為通用退火溫度。

實(shí)施例3哈蟆油藥材COI條形碼的擴(kuò)增方法驗(yàn)證

利用上述13批次哈蟆油藥材樣品(LWY1-12，LWY14)和3批次哈蟆油標(biāo)準(zhǔn)對照藥材樣品(LWY13，LWY15-16)進(jìn)行哈蟆油藥材COI條形碼的擴(kuò)增方法驗(yàn)證

1.模板DNA準(zhǔn)備

取哈蟆油藥材約5mg，置入2.0mL離心管，加入500μL含0.1％～2％鹽酸的水，使用研磨杵反復(fù)研磨30秒左右，至無明顯顆粒并混勻。

加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸鈉、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸鈉的緩沖液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解樣品，使用渦旋混合儀混勻30秒左右，56℃孵育至溶液澄清，每半小時(shí)顛倒混合樣品2～3次，或者使用水浴振蕩器。

加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM已二胺四乙酸的緩沖液，渦旋混勻30秒。

加入700μL酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入700μL氯仿/異戊醇(24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

加入等體積無水乙醇，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下靜置2～5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入1/10體積的3mol/L PH 5.2的乙酸鈉，在渦旋混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻。

加入2～2.5倍體積冰冷的無水乙醇或等體積異丙醇，在渦旋混合器上振蕩混勻，冰浴5分鐘，室溫下以最高速度離心5分鐘。

棄去上清，加入1mL預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀1～2次。

沉淀在真空干燥器或者真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，或者小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，常溫自然干燥。

加入50μL ddH2O溶解，獲得模版DNA，在4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR擴(kuò)增方法驗(yàn)證

對實(shí)施例1中確定引物(序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)以及實(shí)施2中確定的PCR擴(kuò)增條件(94℃1分鐘；94℃1分鐘，54℃1.5分鐘，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘)進(jìn)行驗(yàn)證。這些樣品的PCR擴(kuò)增后的DNA電泳圖如圖2所示，16個(gè)樣品的擴(kuò)增效果均滿足后續(xù)測序要求。

對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以樣品LWY1為例，測序峰圖的部分結(jié)果如圖3所示，信號較強(qiáng)且沒有出現(xiàn)重峰等情況，這進(jìn)一步說明擴(kuò)增效果均滿足后續(xù)測序要求。

對比例1

采用常規(guī)的通用引物進(jìn)行哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定。

2015版中國藥典DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則中，動物類中藥材采用的COI PCR引物為：

正向引物L(fēng)CO1490(SEQ ID No.3)：

5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

反向引物HCO2198(SEQ ID No.4)：

5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’

1.選擇待測樣本

使用與實(shí)施例3中相同的13種哈蟆油樣品以及3種中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)對照哈蟆油藥材。

2.準(zhǔn)備模板DNA

取哈蟆油藥材約5mg，置入2.0mL離心管，加入500μL含0.1％～2％鹽酸的水，使用研磨杵反復(fù)研磨30秒左右，至無明顯顆粒并混勻。

加入360μL含1％～2.5％的十二烷基磺酸鈉、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸鈉的緩沖液和40μL蛋白酶K(20mg/mL)裂解樣品，使用渦旋混合儀混勻30秒左右，56℃孵育至溶液澄清，每半小時(shí)顛倒混合樣品2～3次，或者使用水浴振蕩器。

加入400μL含10～20mM甘氨酸和10mM已二胺四乙酸的緩沖液，渦旋混勻30秒。

加入700μL酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入700μL氯仿/異戊醇(24:1)，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下以最高速度離心5分鐘。

加入等體積無水乙醇，在渦旋混合器上劇烈振蕩混勻30秒，室溫下靜置2～5分鐘。

小心將上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管，加入1/10體積的3mol/L PH 5.2的乙酸鈉，在渦旋混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻。

加入2～2.5倍體積冰冷的無水乙醇或等體積異丙醇，在渦旋混合器上振蕩混勻，冰浴5分鐘，室溫下以最高速度離心5分鐘。

棄去上清，加入1mL預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀1～2次。

沉淀在真空干燥器或者真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，或者小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，常溫自然干燥。

加入50μL ddH₂O溶解，獲得模版DNA，在4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.PCR反應(yīng)體系(以25μL為參照)：

采用2015版中國藥典DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則中的PCR反應(yīng)體系，具體為：1×PCR緩沖液(不含MgCl₂)，2.0mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.1μmol/L引物對，模板DNA，1.0U Taq DNA聚合酶，加滅菌雙蒸水至25μL。設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為陰性對照。

4.PCR擴(kuò)增程序：

采用2015版中國藥典DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則中的PCR反應(yīng)條件，具體為：94℃預(yù)變性1分鐘；94℃1分鐘，45℃1.5分鐘，72℃1.5分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃1分鐘，50℃1.5分鐘，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。

將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳分析，如圖4所示。所以，使用以上條件及藥典中的通用引物對哈蟆油樣品進(jìn)行擴(kuò)增，存在非常明顯的非特異擴(kuò)增，無法進(jìn)行后續(xù)測序分析，進(jìn)而導(dǎo)致無法利用中藥材DNA條形碼分子鑒定法對哈蟆油藥材進(jìn)行有效鑒定。

序列表

<110> 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所；哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心

<120> 哈蟆油藥材DNA條形碼鑒定PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LWF01

<400> 1

tctctactaa tcataaagay atygg 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LWR01

<400> 2

taaacttcag ggtgaccaaa raatca 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LCO1490

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HCO2198

<400> 4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26