本發(fā)明屬于基因診斷制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(簡(jiǎn)寫為先天性CCMC，下同)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

發(fā)明背景

先天性白內(nèi)障(congenitalcataract)多在出生前后即已存在，或在兒童期內(nèi)罹患，白內(nèi)障其發(fā)生率在我國(guó)為0.05％，其中約50％與遺傳有關(guān)，其遺傳方式以常染色體顯性遺傳最為常見。白內(nèi)障能導(dǎo)致嬰幼兒失明或弱視，失明兒童中有22％～30％為白內(nèi)障所致，是一組嚴(yán)重的致盲疾病，嚴(yán)重影響兒童的視力發(fā)育，已成為兒童失明的第二位原因。可為單純性白內(nèi)障或伴發(fā)眼部及其他全身發(fā)育異常。其中12％-18％的先天性白內(nèi)障患者常發(fā)生合并小角膜癥狀。白內(nèi)障-小角膜綜合征(Cataract-microcornea syndrome,CCMC,OMIM 116200)是一種先天發(fā)育異常性眼病，常累及雙眼，表現(xiàn)為不同表型的白內(nèi)障及角膜橫徑小于10mm，常伴發(fā)眼前節(jié)發(fā)育不良，如虹膜缺損、Peters異常、瞳孔異位及眼球震顫等，這些多發(fā)畸形常使大多數(shù)患者喪失視力，是先天性致盲的重要原因之一。并且和單純先天性白內(nèi)障相比，伴發(fā)小角膜的患者更易患青光眼，并造成不可逆轉(zhuǎn)的視覺損害。目前對(duì)于CCMC治療手段有限、致盲率很高，給全社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

先天性CCMC的病因及病理機(jī)制尚不清楚，目前世界上研究較少。國(guó)內(nèi)外的遺傳學(xué)研究結(jié)果表明該病很大程度上是由于遺傳因素導(dǎo)致的。CCMC具有顯著的遺傳異質(zhì)性，存在多個(gè)候選致病基因。到目前為止對(duì)CCMC的致病基因的了解仍然有限，迄今為止已知的基因僅能解釋不到30％的患者的發(fā)病。這已經(jīng)成為CCMC的發(fā)病機(jī)制的研究以及針對(duì)病因的診斷和治療研究的瓶頸。這種現(xiàn)狀促使進(jìn)一步去發(fā)現(xiàn)和了解該病新的致病基因，為后續(xù)的基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療提供基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與先天性CCMC相關(guān)的SNP位點(diǎn)，并通過檢測(cè)該位點(diǎn)來進(jìn)行CCMC的診斷。

申請(qǐng)人從一個(gè)3代呈常染色體顯性遺傳的先天性CCMC家系中，對(duì)該家系全部成員進(jìn)行了HSF4基因的測(cè)序，找到了該家系的致病基因HSF4存在遺傳上的致病突變，從而促成了本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種與先天性CCMC相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為HSF4基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第82位堿基，其堿基由G變?yōu)锳。

本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)先天性CCMC的制品，所述的制品中包含有用于檢測(cè)上述SNP位點(diǎn)的引物對(duì)；

其中用于檢測(cè)上述SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，其一種具體的序列信息如下：

HSF4-F:CCCTTCCTATCTGCTTGCC(SEQ ID NO:1)

HSF4-R:GTTCACTGACGTGGAGGGAC(SEQ ID NO:2)。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種檢測(cè)上述SNP位點(diǎn)的方法，是用HSF4-F和HSF4-R進(jìn)行的。

本發(fā)明提供了HSF4基因的新的用途，從而提供了一種有效的進(jìn)行先天性CCMC基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點(diǎn)及檢測(cè)引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進(jìn)行HSF4基因突變位點(diǎn)的快速檢測(cè)。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1的先天性CCMC家系內(nèi)患者HSF4測(cè)序圖，其中A：患者父親，正常表型；B：患者。該家系中3名患者HSF4基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第82位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的申請(qǐng)人在一個(gè)先天性的CCMC家系中發(fā)現(xiàn)HSF4基因的突變位點(diǎn)從而促成了本發(fā)明。HSF4基因，位于Chr 16:67.16-67.17Mb，可轉(zhuǎn)錄成大約2532bp的mRNA(NM_001538)，直接翻譯形成462個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：從先天性CCMC家系中篩選HSF4基因的突變位點(diǎn)

1、提取外周血基因組DNA：

在符合國(guó)家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對(duì)象同意的基礎(chǔ)上，抽取家系成員外周靜脈血2-5ml，放入EDTA抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μL放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時(shí)離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入l/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。

對(duì)提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，檢測(cè)DNA純度及濃度。

2、目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序：目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)是一種新型的基因組分析技術(shù)，使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標(biāo)序列，然后使用通用引物對(duì)這些捕獲到的序列進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量生物信息學(xué)分析。取該家系中1名患者的基因組DNA，捕獲人類視覺系統(tǒng)異常相關(guān)單基因遺傳病的505個(gè)基因的外顯子區(qū)域，然后對(duì)富集的外顯子文庫進(jìn)行高通量測(cè)序。將突變?yōu)V過4個(gè)正常人數(shù)據(jù)庫：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計(jì)劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，應(yīng)用直接測(cè)序法在該家系內(nèi)篩選到與致病單倍體型共分離的致病基因HSF4，并在正常人群外周血基因組DNA樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

3、直接測(cè)序法尋找該家系內(nèi)患者HSF4基因的突變

PCR擴(kuò)增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：

(1)PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃40sec，55℃30se，72℃40sec，30-35cycles；72℃5min。

(2)反應(yīng)體系：(InvitrogenTaq DNA聚合酶)

應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進(jìn)行每名家系成員的基因組DNA模板與該HSF4引物的擴(kuò)增反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物測(cè)序：應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序法對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其中應(yīng)用引物對(duì)HSF4-F:CCCTTCCTATCTGCTTGCC，HSF4-R:GTTCACTGACGTGGAGGGAC，在該家系中3名患者的HSF4基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第82位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳(圖1)。多次測(cè)序結(jié)果表明該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測(cè)序錯(cuò)誤引進(jìn)的。該突變?yōu)橐恍律蛔儭Ｔ撏蛔儾淮嬖谟谙旅娴乃膫€(gè)數(shù)據(jù)庫中：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性數(shù)據(jù)庫，千人基因組計(jì)劃，Hapmap8數(shù)據(jù)庫及炎黃數(shù)據(jù)庫，表明該突變非常罕見，該突變導(dǎo)致了HSF4蛋白第28位氨基酸由纈氨酸突變位甲硫氨酸。應(yīng)用點(diǎn)突變預(yù)測(cè)程序SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變導(dǎo)致了HSF4蛋白功能“damaging”級(jí)的損壞；應(yīng)用點(diǎn)突變預(yù)測(cè)程序PolyPhen(The Polymorphism Phenotype)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變導(dǎo)致了HSF4蛋白功能“POSSIBLY DAMAGING”級(jí)的損壞；從而引起了該家系中患者先天性CCMC的發(fā)生。

而在200例正常當(dāng)?shù)厝巳旱耐庵苎蚪MDNA樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

另在山東地區(qū)收集診斷明確的先天性CCMC散發(fā)患者一名，提取其外周血基因組DNA，應(yīng)用該患者的DNA模板與HSF4-L和HSF4-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序法對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，該患者的HSF4基因存在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的SNP突變，即編碼區(qū)域由起始密碼子起第82位堿基發(fā)生了雜合突變，其堿基由G變?yōu)锳。

上述結(jié)果表明本發(fā)明篩選的SNP位點(diǎn)可以用來檢測(cè)患者是否具有潛在患先天性CCMC的危險(xiǎn)。通過將檢測(cè)者的HSF4基因的擴(kuò)增片段于正常的對(duì)應(yīng)片段比較，確定待檢測(cè)者的患病風(fēng)險(xiǎn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島大學(xué)

<120> 一種與先天性CCMC相關(guān)的SNP位點(diǎn)

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

cccttcctat ctgcttgcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gttcactgac gtggagggac 20