本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的引物及鑒別方法。
背景技術(shù)：
：增殖放流指用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗種或親體的活動(dòng)。對(duì)于瀕危物種，通過(guò)增殖放流不僅可以補(bǔ)充和恢復(fù)生物資源的群體，保護(hù)瀕危物種、增加漁業(yè)資源產(chǎn)量和修復(fù)生態(tài)環(huán)境，還具有培養(yǎng)漁民環(huán)保意識(shí)和增加漁民收入等多方面的重要意義。在增殖放流過(guò)程中，通常通過(guò)體外標(biāo)志法或體內(nèi)標(biāo)志方法跟蹤增殖放流的魚(yú)類(lèi)。體外標(biāo)志法主要包括剪鰭法、烙印法、掛牌法等。該方法操作簡(jiǎn)單、易于識(shí)別，不需要專(zhuān)門(mén)的儀器，但可能會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)行為活動(dòng)、易脫落，所以準(zhǔn)確率不高。體內(nèi)標(biāo)志法主要包括線(xiàn)碼標(biāo)志法、檔案式標(biāo)志法、被動(dòng)式整合雷達(dá)標(biāo)志法和分離式衛(wèi)星標(biāo)志法等。該方法幾乎不影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)，也不會(huì)遺失，準(zhǔn)確率高于體外標(biāo)志，但費(fèi)用比較昂貴。近年來(lái)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記作為一種新型的標(biāo)志方法，已在國(guó)內(nèi)外開(kāi)始逐步試用。與傳統(tǒng)標(biāo)志方法相比，分子標(biāo)記技術(shù)是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，不存在脫落或改變的情況，最大程度減少了傳統(tǒng)標(biāo)志方法對(duì)魚(yú)體造成的傷害，適用于魚(yú)類(lèi)的放流活動(dòng)。微衛(wèi)星，亦稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)，一般為2～6個(gè)堿基單元重復(fù)，如(CA)n、(CAA)n、(GACA)n。微衛(wèi)星DNA作為一種分子標(biāo)記，具有分布廣且均勻、多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳研究、生物遺傳作圖、個(gè)體鑒定以及親子鑒定等方面。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的引物及鑒別方法，采用本發(fā)明的鑒別方法可準(zhǔn)確的鑒定出漁獲物中哪些是放流的個(gè)體，為魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果評(píng)估提供依據(jù)，準(zhǔn)確率能達(dá)到99.99％，可應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果評(píng)估研究中。技術(shù)方案：一種用于鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的引物，包括有用于擴(kuò)增的15對(duì)微衛(wèi)星引物，其序列如下：F1SEQIDNO.1～2、F2SEQIDNO.3～4、F3SEQIDNO.5～6、F4SEQIDNO.7～8、F5SEQIDNO.9～10、F6SEQIDNO.11～12、F7SEQIDNO.13～14、F8SEQIDNO.15～16、F9SEQIDNO.17～18、F10SEQIDNO.19～20、F11SEQIDNO.21～22、F12SEQIDNO.23～24、F13SEQIDNO.25～26、F14SEQIDNO.27～28、F15SEQIDNO.29～30。所述的每對(duì)引物對(duì)中至少有一個(gè)引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。每對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記時(shí)是采用PET、6FAM、NED和VIC中的任意一種進(jìn)行染色。所述的引物對(duì)是經(jīng)過(guò)分組的。具體分組為：F1、F2、F3、F4、F5為第一組；F6、F7、F8、F9、F10為第二組；F11、F12、F13、F14、F15為第三組。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了包含有上述引物組的檢測(cè)試劑盒。所述的試劑盒由如下組成：DNA模板，2×TaqPCRMix，正向和反向引物，去離子水。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了上述試劑盒用于鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的方法，包括以下步驟：步驟1，在放流前收集放流魚(yú)類(lèi)的鱗片樣本、在調(diào)查水域采集和放流品種一致的魚(yú)類(lèi)鱗片樣本，提取兩種來(lái)源樣本的基因組DNA；步驟2，以步驟1得到的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟3，運(yùn)用Cervus軟件分析兩種來(lái)源的魚(yú)類(lèi)微衛(wèi)星標(biāo)記，鑒定得到調(diào)查水域采集的魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體。所述的鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的方法中，步驟2中PCR擴(kuò)增體系為：PCR反應(yīng)總體積為15μL，其中16.6ng/μLDNA模板2μL，2×TaqPCRMix5μL，10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，去離子水7μL。有益效果：本發(fā)明利用分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行個(gè)體鑒定，通過(guò)提取魚(yú)類(lèi)鱗片DNA，篩選微衛(wèi)星引物，多重PCR擴(kuò)增，Cervus軟件分析微衛(wèi)星標(biāo)記等步驟鑒定出放流的個(gè)體，準(zhǔn)確率達(dá)到99.99％。該方法具有不損傷魚(yú)體，操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本方法建立的一套操作流程，可應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果評(píng)估研究中。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例11.用磁珠富集法開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，篩選出擴(kuò)增效率好，多態(tài)性高的引物。取15對(duì)微衛(wèi)星引物，用PET6，F(xiàn)AM，NED和VIC等不同熒光標(biāo)記引物，根據(jù)擴(kuò)增片段大小及標(biāo)記的熒光構(gòu)成三組多重PCR，建立穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系。其中Multiplex1含有5對(duì)PCR引物，Multiplex2含有5對(duì)PCR引物，Multiplex3含有5對(duì)PCR引物，見(jiàn)表1。在三組多重PCR中，每對(duì)引物的濃度均一致。表1擴(kuò)增的微衛(wèi)星引物及其熒光標(biāo)記引物名稱(chēng)熒光標(biāo)記引物序列(5’-3’)多重PCRF1-FPETCGTAATGGAAGTCAGTGGACTGGMultiplex1F1-RCTGATTTAGCTTTTTAGTGCCCAATGCF2-FNEDTTATTATCCAAAGGGGTCAAAAMultiplex1F2-RGAGGTCGCTGGGGTTTACTATF3-FPETCTTTACAAATAGACAGACTMultiplex1F3-RGTCATACAGTCACTATCATCF4-FNEDCCTTTTGACAGATTTAGGATTTCMultiplex1F4-RCAAACCAAACATACCTAAAGCCF5-F6FAMGGCCCAGACAGATAAACAAACACGCMultiplex1F5-RGCCAACAGCAGCATCTACACCCAGF6-FNEDTTGTGAAGGGGCTGACTAACMultiplex2F6-RTCAATTGTTGGGTGCACATAGF7-F6FAMCTTGGAATATCTAGAATATGGCMultiplex2F7-RGTTCATGTGTTAATGTTGCGTGF8-FPETCTTGGTCCCGTTCTTACGACAACCMultiplex2F8-RTGCACGCTGCTTGGTCCTTGF9-FPETTTAGATGGTGGGATACTGGGAGGCMultiplex2F9-RCGGGAGCCCCATAACCCTACTAATAACF10-FNEDATCGAAATGGAACTTTTGAATGMultiplex2F10-RGCTTAGGGCTGAGAGAGGAATACF11-FPETTGGCAGGGATTTGACATAACMultiplex3F11-RGGGTTGAGTAGGGAGGCTTGF12-FNEDTCGCTGTGTATCAGTATTTTGGMultiplex3F12-RACTCGGATAACACTCACAGGTCF13-F6FAMTGTGGATTTTTGTATTATGTTAMultiplex3F13-RATACATTTCCTCCTCATTCAGTF14-FVICAGGAAGGTGCTGAAGAGGAACMultiplex3F14-RCAATTACCACAAGCCCGCTCF15-FVICGATGGCAAAGAGGAAAGTGAGMultiplex3F15-RTTGTTATGCTCTACCTCTGAA2.放流前，用鑷子取1143尾三文魚(yú)尾部鱗片，同樣方法取河流上游垂釣到的210尾三文魚(yú)尾部鱗片放入牛皮樣品袋中保存。取上述不同來(lái)源樣品的三片鱗片放入96孔板中的樣品孔中，加入75μl堿性裂解液(0.25mMNaOH,0.2mMEDTA)，加熱樣品到95℃，持續(xù)10分鐘，迅速冷卻樣品到4℃，加75μl中性液(40mMTris-HCl)，得到樣品的DNA。4℃保存?zhèn)溆谩?.運(yùn)用PCR儀同時(shí)擴(kuò)增兩種來(lái)源的三文魚(yú)DNA，ABI3730測(cè)序儀分析擴(kuò)增的微衛(wèi)星片段大小。三組多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)總體積為15μL，其中DNA模板(約16.6ng/μL)2μL，2×TaqPCRMix5μL，正向和反向引物(10μmol/L)各0.5μL，去離子水7μL。其中multiplex1和MultiplexPCR2的反應(yīng)程序均為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，55℃退火溫度45s，72℃延伸1min，循環(huán)28次；72℃延伸5min；4℃保存。MultiplexPCR3的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，57℃退火溫度45s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸5min；4℃保存。PCR產(chǎn)物直接通過(guò)ABI3730測(cè)序儀分析，獲得擴(kuò)增的微衛(wèi)星片段大小。4.運(yùn)用Cervus軟件分析放流和垂釣的三文魚(yú)個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記，Allowfuzzymatching選項(xiàng)設(shè)為2。分析得出210尾垂釣到的三文魚(yú)中有135尾是來(lái)自放流的三文魚(yú)，見(jiàn)表2。其中第一列是垂釣到的三文魚(yú)個(gè)體編號(hào)，第三列是來(lái)自放流的三文魚(yú)個(gè)體編號(hào)。從表2中可看出，除了SF138和V386有一個(gè)位點(diǎn)錯(cuò)配外，其它的垂釣到的三文魚(yú)基因型和放流的三文魚(yú)基因型完全匹配，可認(rèn)定這135尾三文魚(yú)來(lái)自放流的，而另外65尾三文魚(yú)則來(lái)自其它源頭。表2放流和垂釣的三文魚(yú)個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記比對(duì)由上表可知，采用本發(fā)明的鑒別方法可準(zhǔn)確的鑒定出漁獲物中哪些是放流的個(gè)體，為魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果評(píng)估提供依據(jù)，準(zhǔn)確率能達(dá)到99.99％，可應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)的增殖放流效果評(píng)估研究中。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心<120>一種用于鑒定魚(yú)類(lèi)增殖放流個(gè)體的引物、試劑盒及鑒別方法<130>2016<160>30<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cgtaatggaagtcagtggactgg23<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2ctgatttagctttttagtgcccaatgc27<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ttattatccaaaggggtcaaaa22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gaggtcgctggggtttactat21<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5ctttacaaatagacagact19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gtcatacagtcactatcatc20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7ccttttgacagatttaggatttc23<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8caaaccaaacatacctaaagcc22<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>9ggcccagacagataaacaaacacgc25<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gccaacagcagcatctacacccag24<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11ttgtgaaggggctgactaac20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tcaattgttgggtgcacatag21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13cttggaatatctagaatatggc22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>14gttcatgtgttaatgttgcgtg22<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15cttggtcccgttcttacgacaacc24<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16tgcacgctgcttggtccttg20<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17ttagatggtgggatactgggaggc24<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>18cgggagccccataaccctactaataac27<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>19atcgaaatggaacttttgaatg22<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>20gcttagggctgagagaggaatac23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21tggcagggatttgacataac20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22gggttgagtagggaggcttg20<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23tcgctgtgtatcagtattttgg22<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>24actcggataacactcacaggtc22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>25tgtggatttttgtattatgtta22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26atacatttcctcctcattcagt22<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>27aggaaggtgctgaagaggaac21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28caattaccacaagcccgctc20<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>29gatggcaaagaggaaagtgag21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>30ttgttatgctctacctctgaa21當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3