本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用Hoxb5誘導(dǎo)B細胞轉(zhuǎn)分化為T細胞的方法、其相關(guān)產(chǎn)品及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

T細胞對于免疫系統(tǒng)不可或缺。目前，國內(nèi)外已有的基礎(chǔ)研究表明，利用Pax5缺失(Pax5-/-)可以將小鼠成熟B細胞轉(zhuǎn)分化為T細胞。Ebf1和Pax5復(fù)合型雜合子小鼠(Ebf1+/-Pax5+/-)的B細胞也能轉(zhuǎn)分化為T細胞。此外，通過逆分化途徑將B祖細胞返祖至多能祖細胞階段，可以再次分化得到T細胞。然而，以上途徑得到的T細胞功能均不健全，甚至?xí)寺』a(chǎn)生淋巴瘤。歸根結(jié)底，以上研究采用的關(guān)鍵基因大多為造血譜系命決定關(guān)鍵因子(lineage master regulators，缺失或過表達這些因子均會導(dǎo)致再生T細胞的功能異?；虬┳?。因此，在造血干祖細胞中尋找新的譜系潛力決定性因子，從細胞表觀遺傳組學(xué)上徹底改變靶向細胞以實現(xiàn)轉(zhuǎn)分化T細胞獲得全部的T細胞潛力。只有完全轉(zhuǎn)分化的再生T祖細胞才能再次循著類似生理T細胞的發(fā)育軌跡，在體內(nèi)分化成熟為功能性T細胞以及盡量避免致瘤風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的在于提供一種使用轉(zhuǎn)錄因子Hoxb5誘導(dǎo)B淋系細胞轉(zhuǎn)分化為T淋系細胞的方法、其相關(guān)產(chǎn)品及應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)明人通過RNA-Seq及生物信息學(xué)技術(shù)，深度解析小鼠造血干祖細胞及成熟血細胞的轉(zhuǎn)錄表達譜，篩選出候選轉(zhuǎn)錄因子——Hoxb5；然后，通過一系列生物實驗發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子不僅可使B淋系細胞成功轉(zhuǎn)分化為功能性T細胞，還可避免再生T細胞的致瘤風(fēng)險。

技術(shù)方案

為實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了Hoxb5、編碼Hoxb5的核酸分子或包含所述核酸分子的構(gòu)建體在制備(i)用于將B淋系細胞轉(zhuǎn)分化為功能性T細胞的制劑，(ii)用于增強免疫響應(yīng)、優(yōu)選地增強T細胞相關(guān)的免疫響應(yīng)的藥物，和/或(iii)用于預(yù)防或治療免疫缺陷、優(yōu)選地用于預(yù)防或治療T細胞免疫缺陷的藥物中的用途。

上述用途中，作為優(yōu)選，所述B淋系細胞為祖B細胞或前B細胞。

第二方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化的B淋系細胞，所述B淋系細胞中引入了Hoxb5、編碼Hoxb5的核酸分子或包含所述核酸分子的構(gòu)建體以過表達Hoxb5，并且所述B淋系細胞具有轉(zhuǎn)分化為T細胞潛能。

作為優(yōu)選，所述B淋系細胞為祖B細胞(Pro-B)或前B細胞(Pre-B)。

第三方面，本發(fā)明提供了如第二方面所述的轉(zhuǎn)化的B淋系細胞在制備(i)用于再生T細胞的藥物，(ii)用于增強免疫響應(yīng)、優(yōu)選地增強T細胞相關(guān)的免疫響應(yīng)，和/或(iii)用于預(yù)防或治療免疫缺陷、優(yōu)選地用于預(yù)防或治療T細胞免疫缺陷的藥物中的用途。

第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括作為活性成分的、如第二方面所述的轉(zhuǎn)化的B淋系細胞，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

第五方面，本發(fā)明提供了一種用于將B淋系細胞轉(zhuǎn)分化為功能性T細胞的方法，其包括：

(1)將Hoxb5、編碼Hoxb5的核酸分子或包含所述核酸分子的構(gòu)建體引入至所述B淋系細胞，獲得Hoxb5過表達的B淋系細胞；

(2)將步驟(1)獲得的B淋系細胞植入受試者體內(nèi)，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化獲得T細胞祖細胞，再經(jīng)分化獲得功能性T細胞。

上述方法中，作為優(yōu)選，所述B淋系細胞為祖B細胞或前B細胞。

作為優(yōu)選，在步驟(1)中，所述Hoxb5、編碼Hoxb5的核酸分子或包含所述核酸分子的構(gòu)建體攜帶追蹤劑，優(yōu)選熒光蛋白追蹤劑，更優(yōu)選EGFP熒光蛋白追蹤劑。

作為優(yōu)選，在步驟(1)中，通過轉(zhuǎn)染或病毒感染、優(yōu)選地通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，將編碼Hoxb5的核酸分子或包含所述核酸分子的構(gòu)建體引入B淋系細胞。

在一個具體的實施方案中，發(fā)明人首先構(gòu)建了Hoxb5逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，具體地，通過設(shè)計酶切位點，把Hoxb5基因重組到逆轉(zhuǎn)錄表達載體(例如，pMYs-IRES-EGFP)；利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝體系，包被出含有Hoxb5基因的高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒；接著，借助逆轉(zhuǎn)錄病毒整合功能將Hoxb5基因在小鼠pro-/pre-B細胞內(nèi)實現(xiàn)過表達；然后，通過眼靜脈移植，將轉(zhuǎn)導(dǎo)Hoxb5的Pro-/Pre-B細胞移植到清髓后的受體鼠；移植4周后，借助流式細胞術(shù)，Southern blot，RNA-Seq測序及生物信息學(xué)分析，鑒定再生T細胞的來源和身份，結(jié)果表明：再生T細胞確實來自Pro-/Pre-B細胞的轉(zhuǎn)分化；進一步結(jié)合分析再生T細胞的免疫表型、在淋巴組織的分布、TCR受體重排及體外抗體刺激增殖實驗，證明再生T細胞的功能正常；此外，連續(xù)追蹤移植受體鼠健康狀態(tài)，特別是T淋系造血，評估再生T細胞的致瘤風(fēng)險，結(jié)果表明：使用本發(fā)明的方法所獲得的再生T細胞沒有致瘤風(fēng)險或者致瘤風(fēng)險極低。

附圖說明

圖1顯示：(A)再生T細胞的實驗設(shè)計流程圖；(B)熒光EGFP檢測顯示Hoxb5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝plat-E細胞的效率超過85％(轉(zhuǎn)染后48小時)；(C)流式檢測分析顯示Hoxb5逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Pro-/Pre-B細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率超過50％(感染后48小時)。

圖2顯示：(A)流式細胞術(shù)分析移植后第2至第4周受體鼠胸腺內(nèi)再生T細胞的比例及構(gòu)成。移植第4周時，流式細胞術(shù)分析受體鼠外周血(B)、脾臟(C)、淋巴結(jié)(D)中供體來源細胞(GFP⁺)的構(gòu)成、再生T細胞的分類。其中，右側(cè)為3次獨立重復(fù)實驗的統(tǒng)計圖。(E)Northern blot檢測單個再生T細胞中的B細胞特征VDJ重排。

圖3顯示：(A)細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聚類分析受體鼠胸腺內(nèi)各類再生T細胞與野生型T細胞(B)B細胞Ig重鏈VDJ重排PCR檢測單個再生T細胞中不同位點的TCR-β鏈重排(C)抗CD3和抗CD28抗體體外刺激再生T細胞增殖的代表性形態(tài)圖。其中，WT為野生型對照。(D)ELISA法檢測體外刺激增殖后的再生T細胞分泌到培養(yǎng)基上清中的代表性細胞因子。

圖4顯示：(A)Hoxb5敲進模型小鼠(LSL-Hoxb5)在ROSA26位點打靶構(gòu)建示意圖。(B)動態(tài)分析4周齡、8周齡、12周齡的CD19-Cre LSL-Hoxb5復(fù)合模型小鼠胸腺中再生T細胞(GFP⁺)的比例及構(gòu)成。(C)B細胞Ig重鏈VDJ重排PCR分析單個和10個再生T細胞的不同重鏈VDJ重排位點(V_HJ558、V_HQ52、V_HGAM3、D_HQ52)，證實再生T細胞來源于B細胞。

具體實施方式

為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

首先，設(shè)計體內(nèi)Hoxb5轉(zhuǎn)分化B細胞產(chǎn)生再生T整個實驗流程圖(圖1A)。接著，通過Lasergene軟件分析Hoxb5基因的酶切位點信息，選取XhoI/SnaBI作為上下游重組酶切位點，將Hoxb5基因重組構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMYs-IRES-EGFP)。DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物后，利用氨芐平板篩選陽性重組克隆。進一步結(jié)合菌液PCR及提取重組質(zhì)粒進行DNA測序，確定重組成功的pMY-Hoxb5-IRES-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒進行去內(nèi)毒素大提后備用。隨后，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法把Hoxb5重組載體轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系(Plat-E細胞)。24小時后，借助熒光顯微鏡查看轉(zhuǎn)染率，確保轉(zhuǎn)染率≥85％(圖1B)。48h后，收集含有Hoxb5的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清備用。同時，犧牲4-6周小鼠，取出小鼠骨髓并制備成單細胞懸液。接著，借助磁珠富集法，將骨髓單細胞懸液中的B220+細胞富集出來。通過Pro-/Pre-B抗體組合(CD19/B220/CD93/IgM)染色后，用超高速流式分選儀(Moflo Astrios)將Pro-/Pre-B細胞(CD 19+B220+CD93+IgM-)分選出來。500g低溫離心后收集分選的Pro-/Pre-B細胞。隨后，把富集的Pro-/Pre-B細胞放入B淋系細胞完全培養(yǎng)基中預(yù)刺激培養(yǎng)12-14小時。將逆轉(zhuǎn)錄病毒按1∶1體積加入opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時加入8μg/ml polybrene混勻好后備用。通過350g離心5分鐘收集預(yù)刺激后的Pro-/Pre-B細胞。隨后，用重新配置好的逆轉(zhuǎn)錄病毒液重懸Pro-/Pre-B細胞后置于低粘附6孔板，在35℃恒溫水平離心機中805g離心感染90分鐘。離心結(jié)束后，將6孔培養(yǎng)板放回細胞培養(yǎng)箱(37℃；5％CO2)中靜置培養(yǎng)2小時。隨后，350g離心收集Pro-/Pre-B細胞。用預(yù)熱后的完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)Pro-/Pre-B細胞，保持密度在每毫升2-4百萬細胞的密度。24小時后，重復(fù)一次離心感染。第二次感染24小時后，取少量細胞用臺盼藍計數(shù)及流式儀分析Pro-/Pre-B細胞感染率。結(jié)果表明：無論對照組，還是Hoxb5組的感染率都超過50％(圖1C)。隨后，350g離心收集懸浮細胞，按每只受體鼠移植6-8百萬的活細胞量進行移植，受體鼠提前4小時進行亞致死劑量(6.5Gy)的輻照處理。同時，在小鼠的飼養(yǎng)水中添加1.14g/L的新霉素硫酸鹽預(yù)防輻照后小鼠腸道感染。

移植2-4周后，犧牲移植受體鼠，分析胸腺，脾臟，淋巴結(jié)、外周血的T細胞生成。借助T淋巴細胞表面抗原CD3和內(nèi)源EGFP熒光蛋白追蹤再生T淋巴細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在移植2周后，即可在受體鼠胸腺發(fā)現(xiàn)高達10％的EGFP和CD3雙陽性的T細胞：進一步分析證實，這群T細胞中包含：CD4單陽性、CD8單陽性、CD4CD8雙陽性(Double positive，DP)和CD4CD8雙陰性(Double negative，DN)T細胞(圖2A)。

此外，通過對DN細胞的進一步分析，其可分類為似生理狀態(tài)比例下的四群細胞：DN1細胞(CD44⁺CD25^-)、DN2細胞(CD44⁺CD25⁺)、DN3細胞(CD44^-CD25⁺)、DN4細胞(CD44^-CD25^-)(圖2A)。

接著，對受體鼠胸腺細胞的連續(xù)分析表明：隨著時間的推移，受體鼠胸腺中CD3⁺EGFP⁺的再生T細胞比例在逐步增高。在移植4周，超過80％的胸腺細胞都為再生T細胞(圖2A)。

此外，對受體鼠外周血、脾臟、淋巴結(jié)的再生T細胞進行分析，結(jié)果表明：在外周血中再生T細胞群體中能夠檢測到CD4單陽性輔助T(Th)細胞、CD8單陽性細胞毒性T細胞及表達T細胞受體(TCR)β鏈(圖2B)。在受體鼠脾臟內(nèi)能夠檢測到Foxp3⁺CD4⁺的調(diào)節(jié)性T細胞(圖2C)。而在淋巴結(jié)中能夠檢測到TCR-γδ陽性T細胞(圖2D)。

為了進一步確定再生T細胞(CD3⁺EGFP⁺)是否從Pro-/Pre-B細胞來源，借助分析B細胞Ig重鏈VDJ及輕鏈(κ、λ)重排加以鑒定。通過流式分選單個CD3⁺EGFP⁺細胞進行PCR檢測。隨后，將PCR片段回收連接到T載體進行測序分析。結(jié)果顯示：不同的單個CD3⁺EGFP⁺的T細胞具有B細胞Ig重鏈VDJ及輕鏈(κ、λ)重排，表明所述T細胞是由B細胞轉(zhuǎn)分化而來的(圖2E)。

此外，發(fā)明人分選了移植4周后受體鼠胸腺內(nèi)再生T細胞(EGFP⁺)發(fā)育的7個細胞群體：DN1、DN2、DN3、DN4、DP、CD4+單陽性、CD8+單陽性細胞進行RNA-Seq測序分析。接著，生物信息學(xué)解析7群細胞的轉(zhuǎn)錄表達譜，并進行了樹枝聚類分析。結(jié)果表明，再生的7群T細胞與野生型具有接近的轉(zhuǎn)錄表達譜的相對應(yīng)T細胞群聚類到一起(圖3A)。進一步借助流式細胞分選受體鼠脾臟單個成熟T細胞(CD4⁺/CD8⁺)進行TCR-β重排進行分析。結(jié)合PCR技術(shù)和T載體測序，實驗結(jié)果表明：不同的再生T細胞具有不同的TCR-β重排(圖3B)。并且，發(fā)明人將脾臟成熟的再生T細胞分選出來進行了體外刺激增殖實驗，聯(lián)合CD3和CD28抗體刺激培養(yǎng)6天，再生T細胞能夠?qū)Υ碳ぷ龀龇磻?yīng)并大量增殖(圖3C)。采用ELISA技術(shù)分析培養(yǎng)上清，結(jié)果表明：刺激增殖后的再生T細胞能夠分泌大量的白介素2(IL-2)、白介素10(IL10)、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(圖3D)；最后，連續(xù)追蹤移植受體鼠的健康狀態(tài)，尤其是T淋系造血，結(jié)果表明：小鼠體內(nèi)再生T細胞沒有致瘤風(fēng)險，或致瘤風(fēng)險極低。

實施例2

為了排除逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點不確定及表達水平不均一等潛在問題，發(fā)明人還構(gòu)建了Hoxb5敲進動物模型(LSL-Hoxb5)(圖4A)。通過Hoxb5敲進小鼠與B淋系特異性表達Cre模式小鼠CD19-Cre進行雜合，得到LSL-Hoxb5CD19-Cre(以下簡稱Hoxb5小鼠)。通過對Hoxb5小鼠的胸腺進行分析，發(fā)現(xiàn)其中有少量CD3⁺EGFP⁺的再生T細胞(圖4B)。同樣將再生T細胞分選出來進行B細胞Ig重鏈VDJ及輕鏈(κ、λ)重排加以鑒定(圖4C)。結(jié)合T載體測序，結(jié)果表明：再生T細胞具有B細胞特征的重排，表明其源自B細胞的轉(zhuǎn)分化。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及用途，但本發(fā)明并不局限于此，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。