專(zhuān)利名稱：細(xì)胞及其獲得方法
細(xì)胞及其獲得方法本發(fā)明涉及重編程體細(xì)胞、重編程方法、體細(xì)胞的重編程因子以及此類(lèi)因子和細(xì)胞的用途。通過(guò)表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子(Yamanaka因子)即0ct4、Sox2、c_Myc以及Klf4(l_3),可以將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)重編程為多能狀態(tài)。之后應(yīng)用同一組基因或其變體重編程小鼠(4-6)、大鼠和人(7-9)中的多種譜系的體細(xì)胞。將原代體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)是復(fù)雜且逐漸的過(guò)程，伴隨著遺傳和表觀遺傳變化(37，51)。因此，4種Yamanaka因子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)所產(chǎn)生的小鼠iPS克隆經(jīng)常是異源的，為全部或部分重編程細(xì)胞的混合物(52)。iPS細(xì)胞自我更新和其他重要的胚胎干細(xì)胞(ES)樣特性有時(shí)需要外源因子的持續(xù)表達(dá)(51，11)。因此，在無(wú)強(qiáng)的選擇方案來(lái)鑒定完全重編程細(xì)胞的情況下，已經(jīng)證明，通過(guò)簡(jiǎn)單連續(xù)傳代和亞克隆難以建立種系有活性的(germline-competent)小鼠iPS細(xì)胞系。盡管利用基于Yamanaka因子的各種平臺(tái)，產(chǎn)生了人類(lèi)iPS細(xì)胞，但是可以合理地預(yù)測(cè)，這些細(xì)胞的性質(zhì)可能也是異源的。因?yàn)槿鄙倏煽康膱?bào)道基因，如連接于內(nèi)源多能基因 的熒光標(biāo)記或藥物選擇標(biāo)記，使得難以從利用可用的重編程因子所產(chǎn)生的人類(lèi)iPS細(xì)胞異源群體中分離完全重編程細(xì)胞。目前來(lái)源于胚胎的人類(lèi)ES細(xì)胞，在其形態(tài)、基因表達(dá)陌生以及集落生成上不同于小鼠ES細(xì)胞(53，44)。最明顯的差別是，小鼠ES細(xì)胞的多能性取決于Jak/Stat3途徑通過(guò)白血病抑制因子(LIF)的激活(54)或Mek/Erk途徑的抑制(40)。相比之下，人類(lèi)ES細(xì)胞不響應(yīng)LIF，并且僅能通過(guò)FGF和活化素維持(44)。最近利用人類(lèi)ES細(xì)胞培養(yǎng)條件衍生了小鼠外胚層干細(xì)胞(EpiSC) (55，56)，這表明人類(lèi)ES細(xì)胞在許多方面與小鼠EpiSC類(lèi)似，而不是與真正的多能小鼠ES細(xì)胞類(lèi)似。目前缺少小鼠ES細(xì)胞的真正的人類(lèi)配對(duì)物，這使得難以證明操縱ES細(xì)胞多能性的常見(jiàn)范例是否在其他哺乳動(dòng)物種類(lèi)中起作用。此外，從應(yīng)用的觀點(diǎn)看，等同于小鼠ES細(xì)胞的人類(lèi)多能干細(xì)胞系的有效性，會(huì)使得將小鼠ES細(xì)胞自我更新、分化以及基因操作的知識(shí)財(cái)富直接應(yīng)用于人類(lèi)ES細(xì)胞成為現(xiàn)實(shí)。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)體細(xì)胞的核重編程制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使體細(xì)胞與核重編程因子[NRF]接觸的步驟，所述因子包括下述中的一種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑或拮抗劑；(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑；(iii)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑；(iv)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物；(V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸(polynucleic acid)。一方面，所述方法包括使用上文的(i)和(ii)兩者。一方面，本發(fā)明涉及將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能細(xì)胞的方法，包括(a)使體細(xì)胞與NRF接觸，NRF包含或?yàn)橄率鲋械末`種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑；
(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑；(iii)視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑；(iv)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物；(V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；以及(b)任選地檢查或確定所述體細(xì)胞是否已經(jīng)被重編程，以及(c)使步驟(a)的產(chǎn)物與RA或RAR/RXR家族成員的拮抗劑接觸，或消除與NRF的接觸，從而維持多能性。 一方面，本發(fā)明提供了 NRF，其包含下述中的ー種或多種(i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑或拮抗劑；(ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其拮抗劑；(iii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；(iv)視黃酸或參與視黃酸合的成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑；(V)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物；(vi)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；一方面，NRF用于將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來(lái)自RAR家族成員和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的 NRF。另ー方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來(lái)自RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員以及Myc家族成員的基因產(chǎn)物的NRF。在另一方面，本發(fā)明提供了包含或編碼來(lái)自RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員、Klf家族成員、Myc家族成員以及Sox家族成員的基因產(chǎn)物的NRF。在本發(fā)明的另一方面，所述NRF包含ー個(gè)或多個(gè)載體，所述載體包含編碼本文所述的ー種或多種核重編程因子的ー個(gè)核酸/多個(gè)核酸。在另一方面，本發(fā)明提供了諸如人類(lèi)iPS的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其通過(guò)本文所述方法獲得或通過(guò)本文所述方法可以獲得。在另一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)性人類(lèi)多能細(xì)胞，其特征為下述至少之一 表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物,如0ct4、Nanog、Rexl ； 不依賴FGF生長(zhǎng)； 在傳代后保持正常核型，所述核型利用光譜核型分析進(jìn)行測(cè)量； 當(dāng)注射到小鼠中時(shí)，能形成畸胎瘤；· 0ct4、Nanog、Rexl中的一個(gè)或多個(gè)的啟動(dòng)子區(qū)脫甲基化； 細(xì)胞可以解離為能形成次生集落的活單細(xì)胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增殖仍然在另一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)，其中所述iPS包含外源DNA序列。在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)分化本發(fā)明的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的體細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明提供了這樣的細(xì)胞，其基因組已經(jīng)被修飾為允許調(diào)節(jié)編碼視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的核酸或Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明提供了組織、器官或非人類(lèi)動(dòng)物，其衍生自或包含通過(guò)分化本發(fā)明的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的體細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與藥物可接受賦形劑組合的本文所述的核重編程因子、載體、細(xì)胞或組織。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的核重編程因子或iPS細(xì)胞或衍生自iPS細(xì)胞的體細(xì)胞或組織或器官在醫(yī)藥中的用途和本文所述的核重編程因子或iPS細(xì)胞或衍生自iPS細(xì)胞的體細(xì)胞或組織或器官在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括將藥學(xué)可接受量的本發(fā)明的核重編程因子、iPS細(xì)胞、體細(xì)胞、組織或器官之一送遞給所述患者。


圖I.表示重編程中的RA信號(hào)傳導(dǎo)(signaling)。A.利用piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座的重編程策略的示意圖。B-C.表達(dá)Rara或Rarg以及4種Yamanaka因子顯著促進(jìn)重編程,而通過(guò)表達(dá)Rara-DN抑制RA信號(hào)傳導(dǎo)阻斷重編程。D.重編程短暫需要RA信號(hào)傳導(dǎo)。E-F.重編程細(xì)胞中多能性基因的表達(dá)(E)和在Nanog和Rexl基因座處的甲DNA基化(F)。G. Rarg激動(dòng)劑⑶437改善iPSC質(zhì)量。圖2. Rarg(R)和Lrh-1 (L)協(xié)同促進(jìn)重編程。A. Tet-On重編程策略的不意圖。B. 6種因子(TRE-0CKS和TRE-RL)的4天表達(dá)足以完全激活內(nèi)源0ct4表達(dá)用于獲得不依賴Dox的iPSC。C.轉(zhuǎn)染后6天的集落圖像。D.共表達(dá)Rarg和Lrh-I (RL)而不是單獨(dú)的Rarg或Lrh-I改善iPSC質(zhì)量。圖3.不依賴Dox的小鼠iPSC的表征。A.對(duì)iPS20_Al細(xì)胞免疫染色來(lái)檢測(cè)0ct4和Nanog0 B.小鼠iPSC、親代MEFs和野生型ES細(xì)胞中0ct4、Nanog和Rexl的qRT-PCR。
C.iPSC(iPS20-Al)中0ct4和Nanog的啟動(dòng)子幾乎完全脫甲基化。D.衍生于iPSC的畸胎瘤含有所有3種胚層的細(xì)胞類(lèi)型。E. iPSC對(duì)嵌合體中的種系的貢獻(xiàn)。圖4.在無(wú)血清、無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下,將MEF重編程為基態(tài)(ground state) iPSC。
A.用 PB-TRE-OCKS (4F)或 PB-TRE-OCKS 加 PB-TRE-RU6F)重編程的 AP+集落的數(shù)量。B.利用qRT-PCR分析iPSC的基因表達(dá)。C.用于Nanog和SSEA-1表達(dá)的iPSC的免疫染色(6F)。
D.免疫染色所檢測(cè)的iPSCs(6F)向代表3種胚層的細(xì)胞類(lèi)型的體外分化。圖5.不依賴Dox的獨(dú)特的人類(lèi)iPSC的產(chǎn)生和表征。A. RAREoct序列在幾種哺乳動(dòng)物種類(lèi)中保守。B.利用Tet-On 6因子平臺(tái)重編程HDFn細(xì)胞。C.典型的人類(lèi)iPSC集落形態(tài)和AP染色。D.親代HDFn、人類(lèi)iPSC以及HlhESC細(xì)胞中多能性基因的qRT-PCR分析。
E.用于ES細(xì)胞表面標(biāo)志物和多能性因子的人類(lèi)iPSC的免疫染色。F.人類(lèi)iPSC的體外分化?？贵w。G.由人類(lèi)iPSC分化的畸胎瘤。H.通過(guò)基因表達(dá)(qRT-PCR)所測(cè)量的人類(lèi)iPSC的信號(hào)傳導(dǎo)依賴性。I.生長(zhǎng)于不同條件下的人類(lèi)iPSC的基因表達(dá)變化。圖6· A.攜帶轉(zhuǎn)錄因子cDNA的PB轉(zhuǎn)座子。B. 0ct4-IRES-Puro_Egfp敲入等位基因。C. 0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF 細(xì)胞和 0ct4-IRES-Puro_Egfp 敲入 ES 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。D.在轉(zhuǎn)染中増加攜帯Rarg的轉(zhuǎn)座子的量降低OCKS重編程效率。E.在2種嘌呤霉素濃度存活的重編程小鼠細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖7. Rarg和Lrh-I協(xié)同促進(jìn)重編程。A.攜帶由編碼2A( ロ足病病毒2A自切割肽)的DNA所連接的多重cDNA的PB轉(zhuǎn)座子。B.典型的iPSC集落。C.轉(zhuǎn)染10天后iPSC集落的堿性磷酸酶染色.D.用于熒光素酶報(bào)道基因測(cè)定的DNA構(gòu)建體圖。圖8.小鼠iPSC多能性的表征。A.免疫染色iPS20_Al細(xì)胞以檢測(cè)SSEAl和Nanog。B.小鼠iPSC中內(nèi)源多能性基因的強(qiáng)健(robust)表達(dá)。C.小鼠iPSC系中外源重編程因子表達(dá)的RT-PCR分析。圖9.在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)血清的條件下MEF的重編程。A.轉(zhuǎn)染的MEF。B.蘇木素和曙紅使畸胎瘤的石蠟切片染色。圖10.用6因子平臺(tái)(CAG啟動(dòng)子版本)產(chǎn)生獨(dú)特的人類(lèi)iPSC細(xì)胞。A.形成于 M15加LIF培養(yǎng)基或2i/LIF培養(yǎng)基中的人類(lèi)iPSC集落，其與常規(guī)小鼠ES細(xì)胞集落相似。
B.免疫染色所檢測(cè)的人類(lèi)iPSC中內(nèi)源多能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。C. RT-PCR所檢測(cè)的人類(lèi)iPSC中多能性基因的表達(dá)。D.在畸胎瘤中人類(lèi)iPSC向3種胚層細(xì)胞類(lèi)型的分化。E.大量傳代(>20代)后，人類(lèi)iPSC的正常核型。F.人類(lèi)iPSC的Y染色體基因分型分析證實(shí)人類(lèi)iPSC的HDFn來(lái)源。圖11.利用6因子Tet-On系統(tǒng)(不依賴Dox)所產(chǎn)生的獨(dú)特的人類(lèi)iPSC的表征。
A.人類(lèi)iPSC中基因表達(dá)的RT-PCR分析。B.人類(lèi)iPSC的SSEA-4、Tra-l_60以及Tra_l_81表達(dá)的FACS分析。C.人類(lèi)iPSC中重編程因子表達(dá)的RT-PCR分析表明無(wú)外源重編程因子表達(dá)。D.在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后，人類(lèi)iPSC具有正常的核型。E.基因捕獲PB轉(zhuǎn)座子插入HPRT基因座中。圖12. Rarg顯性失活(Dominant-negative)等位基因阻斷ES細(xì)胞分化。A.攜帶強(qiáng)CAG啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和ー對(duì)剪接受體的PB轉(zhuǎn)座子的示意圖。B. Rexl-Puro-IRES-Egfp敲入小鼠ES細(xì)胞系的圖。C. ES細(xì)胞中的遺傳學(xué)篩選策略，用于鑒定能阻斷視黃酸所誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化的突變體。D.遺傳學(xué)篩選中所鑒定的Rarg處的4個(gè)獨(dú)立突變。E. Rarg或Rara顯性形式的過(guò)表達(dá)阻斷RA誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化。F. Rarg或Rara特異性拮抗劑阻斷RA誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化。圖13. RA信號(hào)傳導(dǎo)在將小鼠MEF重編程為iPS細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。A.更高質(zhì)量的iPS細(xì)胞與在更高濃度的嘌呤霉素存活關(guān)聯(lián)。B. Rarg-FL的過(guò)表達(dá)顯著增加重編程效率。c. iPS細(xì)胞培養(yǎng)平板表明Rarg增加重編程效率。細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。D. Rarg-DN的過(guò)表達(dá)也改善iPS克隆的質(zhì)量，但是降低重編程效率。E. Rarg的劑量影響重編程效率。F. Rarg或Rara特異性激動(dòng)劑增強(qiáng)重編程效率。G. Rarg特異性激動(dòng)劑改善iPS細(xì)胞的質(zhì)量。圖14. Rarg和Lrhl協(xié)同作用促進(jìn)重編程。A. Rarg特異性拮抗劑處理可以改善部分重編程iPS克隆的質(zhì)量。B. Lrhl的超表達(dá)促進(jìn)重編程。C.如Puro抗性iPS細(xì)胞集落的非常早期表觀所示，6種因子對(duì)MEF的快速重編程。快速實(shí)現(xiàn)完全重編程的多能性需要Rarg和Lrhl的表達(dá)。E. Rarg和Lrhl表達(dá)的劑量對(duì)iPS細(xì)胞的質(zhì)量非常關(guān)鍵。圖15. 6種因子重編程的iPS細(xì)胞的高質(zhì)量。A.利用Rarg和Lrhl所產(chǎn)生的小鼠iPS細(xì)胞具有ES細(xì)胞多能性標(biāo)志物的強(qiáng)健表達(dá)。B. 6因子誘導(dǎo)的小鼠iPS細(xì)胞可對(duì)畸胎瘤中的所有譜系有貢獻(xiàn)。
圖16.利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量iPS細(xì)胞。A.在M15加hLIF培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的人類(lèi)iPS細(xì)胞集落(上幅)。人類(lèi)iPS細(xì)胞集落在在2i加hLIF培養(yǎng)條件下擴(kuò)增(底幅)。
B.人類(lèi)iPS細(xì)胞表達(dá)高水平的0CT4和NANOG。C. RT-PCR分析證實(shí)，人類(lèi)iPS細(xì)胞中多能性基因的高水平表達(dá)。4-1、4-2、4-3以及4-5是人類(lèi)iPS細(xì)胞。ES :人類(lèi)ES細(xì)胞對(duì)照。表表I.含有推斷的RAREoct元件的小鼠基因啟動(dòng)子的列表。表2.含有推斷的RAREoct元件的人類(lèi)基因啟動(dòng)子的列表。表3.CDNA克隆所用的引物。表4. Splinkerette PCR 所用的引物。
表5. RT-PCR和DMR分析所用的引物。表6. Applied Bioscience為小鼠和人類(lèi)基因的實(shí)時(shí)RT-PCR預(yù)設(shè)計(jì)的Taqman探針。表7.定制設(shè)計(jì)的人類(lèi)QPCR探針。詳細(xì)描述在此我們報(bào)導(dǎo)了小鼠和人類(lèi)體細(xì)胞的快速和高效的重編程。在小鼠中，將胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)重編程。根據(jù)形態(tài)和分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所產(chǎn)生的iPS克隆是高度同質(zhì)的。當(dāng)用同樣的6種因子重編程人類(lèi)新生兒包皮真皮成纖維細(xì)胞(HDFn)時(shí)，我們鑒定了人類(lèi)多能干細(xì)胞克隆。這些細(xì)胞還可以以單細(xì)胞密度在小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下亞克隆，并擴(kuò)增且無(wú)任何可識(shí)別的染色體異常。我們還證明，可以在這些人類(lèi)iPS細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)座，其效率與小鼠ES細(xì)胞相當(dāng)。在一方面，本發(fā)明涉及體細(xì)胞的核重編程因子(NRF)。合適的是，NRF能促進(jìn)由體細(xì)胞形成iPS。在一方面，核重編程因子包含視黃酸受體RAR/RXR家族成員(如Rar a、Rar Y、Rar^ ,RXRa、RXR0、RXR γ -在本文中也稱為 Rara、Rarg、Rarb、RXRa、RXRb、RXRg，其在一方面，具有小鼠或人類(lèi)序列)的基因產(chǎn)物和/或視黃酸和/或Lrhl家族成員(如Lrhl、Sfl，或核受體/nR5a類(lèi)固醇激素受體家族Ftz-Fl亞家族的其他成員)的基因產(chǎn)物和/或參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物。提到RAR家族，包括提到RXR家族，除非根據(jù)上下文具有明顯不同。在一方面，核重編程因子包含視黃酸受體RAR家族成員(如Rar a、Rar Y、Rar β )和Lrhl家族成員，例如全長(zhǎng)Rarg和Lrhl。在一方面，提到RAR家族成員指RAR。在一方面，核重編程因子包含視黃酸，例如所有反式或RA或9-順式RA，合適的是其濃度為I(T8-K)-iqM,合適的是10_9M。本文提到家族成員和其基因產(chǎn)物，包括編碼所述基因產(chǎn)物的多核苷酸，如RAR家族成員和Lrhl家族成員，包括一物種中相同基因/蛋白質(zhì)家族的成員、不同物種的家族成員和其變體，如具有取代、缺失或添加的蛋白質(zhì)，合適的是，所述成員或其變體在功能上是等同的，因?yàn)樗鼈儏g獨(dú)或與其他因子組合能促進(jìn)由本文所述體細(xì)胞形成iPS，這可以合適地通過(guò)本申請(qǐng)所述方法評(píng)估。這類(lèi)基因產(chǎn)物包括在氨基酸水平或核苷酸水平與本發(fā)明的NRF序列具有至少70%、優(yōu)選至少80%、90%或95%同源性或相同性的序列，所述序列能單獨(dú)或與其他因子組合促進(jìn)由本文所述的體細(xì)胞形成iPS，這可以合適地通過(guò)本申請(qǐng)所述的方法評(píng)估。優(yōu)選地，RAR家族成員是人類(lèi)全長(zhǎng)野生型Rar Y或Rar α序列。優(yōu)選地,LRHl家族成員是人類(lèi)全長(zhǎng)野生型LRHl序列。在一方面，在本發(fā)明的任何方面提到蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物，指該蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物的人類(lèi)全長(zhǎng)野生型序列。在一方面，由體細(xì)胞形成iPS的促進(jìn)通過(guò)0ct4基因表達(dá)的激活來(lái)評(píng)估，例如在ES細(xì)胞中所觀察到的水平，或通過(guò)具有本文所公開(kāi)的任何特征的iPS細(xì)胞的形成來(lái)評(píng)估。在一方面，如本文所述，基因產(chǎn)物是具有人類(lèi)或小鼠序列的蛋白質(zhì)，或是其變體。在NRF組分的上下文中，在本文中提到基因產(chǎn)物并非限于由多核苷酸的表達(dá)所制備的蛋白質(zhì)或多肽，而是包括例如可以直接合成的蛋白質(zhì)或其片段。提到基因產(chǎn)物還包括可以由基因產(chǎn)生的其他非蛋白質(zhì)物質(zhì)，例如由DNA向RNA的 轉(zhuǎn)錄而引起的多核苷酸片段。提到視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，包括具有視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物的ー些活性的RAR/RXR家族成員突變體的基因產(chǎn)物。在一方面，本發(fā)明涉及體細(xì)胞的核重編程因子，其包含RAR/RXR家族成員和/或Lrhl家族成員的突變體所編碼的蛋白質(zhì)，所述突變體如蛋白質(zhì)功能降低或廢除的突變體或活性增強(qiáng)的突變體。如上文所討論的，具有親本蛋白質(zhì)的ー些活性的突變體，可以視為該蛋白質(zhì)的變體。在一方面，本發(fā)明涉及體細(xì)胞的核重編程因子，其包含RAR家族成員和/或Lrhl家族成員的顯性失活突變體所編碼的蛋白質(zhì)。合適的是，顯性失活突變體蛋白能阻斷視黃酸(RA)、合適地高濃度如I. O μ M的RA所誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化。在一方面，核重編程因子包含Rarg或Rara的顯性失活突變體所編碼的蛋白質(zhì)。在一方面，所述蛋白質(zhì)是C末端缺失部分的Rarg蛋白。在一方面，所述突變體是RARG的突變體，其對(duì)應(yīng)于Rarg的最后內(nèi)含子(內(nèi)含子9)的氨基酸序列已經(jīng)缺失。在一方面，所述蛋白質(zhì)是Rara的顯性失活形式，合適地是 Rara-DN。野生型RARG 的序列(SEQ ID No. I)ATGGCCACCAATAAGGAGAGACTCTTTGCGCCCGGTGCCCTGGGGCCTGGATCTGGTTACCCAGGAGCAGGCTTCCCATTCGCCTTCCCAGGTGCACTCAGAGGGTCGCCACCATTTGAGATGCTGAGCCCTAGCTTCCGGGGCCTGGGCCAGCCTGACCTCCCCAAGGAGATGGCTTCTCTCTCGGTGGAGACACAGAGCACCAGCTCGGAGGAGATGGTACCCAGCTCTCCCTCACCCCCACCACCTCCTCGGGTCTATAAGCCATGCTTTGTATGCAATGACAAGTCTTCTGGCTACCACTATGGGGTCAGCTCCTGTGAAGGCTGCAAGGGCTTCTTCAGACGCAGCATTCAGAAAAACATGGTGTATACATGTCACCGTGACAAAAACTGTATCATCAACAAGGTCACCAGAAATCGATGCCAGTACTGCAGGCTACAAAAGTGTTTCGAAGTGGGCATGTCCAAGGAAGCTGTAAGGAACGATCGAAACAAGAAGAAAAAGGAGGTAAAAGAGGAGGGCTCGCCCGACAGCTATGAACTGAGTCCACAGTTAGAGGAACTCATCACCAAGGTCAGCAAAGCCCACCAGGAGACTTTTCCCTCACTCTGCCAGCTGGGCAAGTACACCACGAACTCCAGTGCAGATCACCGGGTGCAGCTGGACCTGGGGCTGTGGGACAAGTTCAGCGAGCTGGCCACCAAATGCATCATCAAGATTGTGGAGTTTGCGAAGCGGCTGCCTGGTTTTACAGGGCTCAGCATTGCCGACCAGATCACGCTGCTCAAGGCTGCTTGTCTGGACATCCTAATGCTGCGGATCTGTACAAGGTATACCCCAGAGCAGGACACTATGACATTCTCGGATGGGCTGACCCTGAACCGAACCCAGATGCACAATGCTGGCTTTGGGCCCCTTACAGACCTCGTCTTTGCCTTTGCCGGGCAGCTGCTGCCCCTGGAGATGGATGACACCGAGACTGGGCTACTTAGTGCTATCTGCCTCATCTGTGGAGACCGAATGGACCTGGAAGAGCCCGAGAAGGTGGACAAGCTGCAGGAGCCCCTGCTGGAAGCCCTGAGGCTCTATGCCCGGCGACGGAGACCCAGCCAACCCTACATGTTCCCAAGGATGCTGATGAAAA
TCACCGACCTCCGGGGCATCAGCACTAAGGGAGCAGAAAGGGCTATAACCCTGAAGATGGAGATTCCAGGCCCGATG
CCACCCCTGATCCGAGAGATGCTGGAGAACCCGGAGATGTTTGAGGACGACTCCTCGAAGCCTGGCCCCCACCCCAA
GGCTTCCAGTGAGGACGAAGCTCCAGGGGGCCAGGGCAAAAGGGGCCAAAGTCCCCAACCTGACCAGGGGCCCTGA突變的Rarg 的序列(SEQ ID No. 2)ATGGCCACCAATAAGGAGAGACTCTTTGCGCCCGGTGCCCTGGGGCCTGGATCTGGTTACCCAGGAGCAGGCTTCCCATTCGCCTTCCCAGGTGCACTCAGAGGGTCGCCACCATTTGAGATGCTGAGCCCTAGCTTCCGGGGCCTGGGCCAGCCTGACCTCCCCAAGGAGATGGCTTCTCTCTCGGTGGAGACACAGAGCACCAGCTCGGAGGAGATGGTACCCAGCTCTCCCTCACCCCCACCACCTCCTCGGGTCTATAAGCCATGCTTTGTATGCAATGACAAGTCTTCTGGCTAC CACTATGGGGTCAGCTCCTGTGAAGGCTGCAAGGGCTTCTTCAGACGCAGCATTCAGAAAAACATGGTGTATACATGTCACCGTGACAAAAACTGTATCATCAACAAGGTCACCAGAAATCGATGCCAGTACTGCAGGCTACAAAAGTGTTTCGAAGTGGGCATGTCCAAGGAAGCTGTAAGGAACGATCGAAACAAGAAGAAAAAGGAGGTAAAAGAGGAGGGCTCGCCCGACAGCTATGAACTGAGTCCACAGTTAGAGGAACTCATCACCAAGGTCAGCAAAGCCCACCAGGAGACTTTTCCCTCACTCTGCCAGCTGGGCAAGTACACCACGAACTCCAGTGCAGATCACCGGGTGCAGCTGGACCTGGGGCTGTGGGACAAGTTCAGCGAGCTGGCCACCAAATGCATCATCAAGATTGTGGAGTTTGCGAAGCGGCTGCCTGGTTTTACAGGGCTCAGCATTGCCGACCAGATCACGCTGCTCAAGGCTGCTTGTCTGGACATCCTAATGCTGCGGATCTGTACAAGGTATACCCCAGAGCAGGACACTATGACATTCTCGGATGGGCTGACCCTGAACCGAACCCAGATGCACAATGCTGGCTTTGGGCCCCTTACAGACCTCGTCTTTGCCTTTGCCGGGCAGCTGCTGCCCCTGGAGATGGATGACACCGAGACTGGGCTACTTAGTGCTATCTGCCTCATCTGTGGAGACCGAATGGACCTGGAAGAGCCCGAGAAGGTGGACAAGCTGCAGGAGCCCCTGCTGGAAGCCCTGAGGCTCTATGCCCGGCGACGGAGACCCAGCCAACCCTACATGTTCCCAAGGATGCTGATGAAAATCACCGACCTCCGGGGCATCAGCACTAAGGGATGATGATGA在一方面，本發(fā)明涉及RAR/RXR的拮抗劑和/或Lrhl家族成員的拮抗劑，以及所述拮抗劑在制備和維持IPS細(xì)胞中的用途。一種合適的Rarg拮抗劑是⑶2665。一種合適的Rara拮抗劑是R0-41-5253。在另一方面，所述拮抗劑與DNA甲基化抑制劑如5-氮胞苷和5-氮雜-2’ -脫氧胞苷組合使用。在一方面，重編程因子包含RAR和/或Lrhl家族成員的激動(dòng)劑，例如Rara的激動(dòng)齊[J，如AM580，或Rarg的激動(dòng)劑，其為CD437。在一方面，核重編程因子包含上文所述RAR家族成員、Lrhl家族成員、視黃酸、它們的激動(dòng)劑和它們的突變體和/或變體中的一種或多種的組合，例如RAR(全長(zhǎng))和Lrhl (全長(zhǎng))家族成員的組合，例如Rarg和Lrhl的組合。合適的是，Rarg和Lrhl的作用是協(xié)同的，因?yàn)?，例如，如本文所述，?duì)于所獲得的iPS細(xì)胞的數(shù)量和/或質(zhì)量，所觀察到其對(duì)iPS重編程的作用大于相加。合適的是，通過(guò)監(jiān)測(cè)本文所述的0ct4表達(dá)水平和/或產(chǎn)生具有本文所列的iPS細(xì)胞的一種或多種特征的iPS的能力來(lái)評(píng)估iPS重編程。核重編程因子還可以包括其他附加組分。合適的是，NRF能將體細(xì)胞重編程形成iPS細(xì)胞，并且合適地頻率比單獨(dú)的Yamanaka因子更高。Yamanaka因子公開(kāi)于EP1970446中，其教導(dǎo)通過(guò)援引并入本文。NRF可以包含ー種或多種Yamanaka因子或編碼它們的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如C-MYC的MYC蛋白，或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如KLF4的KLF蛋白或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含諸如S0X2的SOX基因，或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含0ct4或編碼它的核酸。在一方面，核重編程因子包含 C-MYC、KLF-4、0ct4 和 S0X2 或編碼 C-MYC、KLF-4、0ct4 和 S0X2 的核酸。在本文中提到任何基因或蛋白質(zhì)，如C-MYC、0ct4KLF-4和S0X2，包括與上文所述C-MYC.KLF-4.0ct 4和S0X2家族成員享有相同性的基因或蛋白質(zhì)，合適地編碼至少在某種程度上與全長(zhǎng)野生型序列具有共同的重編程活性的蛋白質(zhì)。包括在本發(fā)明的NRF中的蛋白質(zhì)包括諸如添加、缺失或取代突變體的變體，所述變體合適地在至少某種程度上與全長(zhǎng)野生型序列具有共同的重編程活性。已經(jīng)鑒定了可以取代Yamanaka因子的組分的各種因子。當(dāng)將本發(fā)明描述為利用ー種或多種Yamanaka因子時(shí),應(yīng)當(dāng)理解到,本發(fā)明還考慮了包括Yamanaka因子姆種因子的替換。例如，通過(guò)孤兒核受體Nr5a2的過(guò)表達(dá),該受體能取代oct4,已經(jīng)報(bào)道了不依賴0ct4的重編程。據(jù)報(bào)道，另ー孤兒核受體Esrrb能取代Klf4。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核重編程因子和Nr5a2或Esrrb組合的NRF或包含編碼核重編程因子和Nr5a2或Esrrb的核 酸的NRF。在一方面，核重編程因子包含下述的組合(i)選自下述中任ー種或多種的基因產(chǎn)物或編碼它們的核酸上述RAR/RXR家族成員、Lrhl家族成員、它們的激動(dòng)劑、它們的拮抗劑、以及它們的突變體和變體，優(yōu)選RAR和Lrhl家族成員、視黃酸以及調(diào)節(jié)RA信號(hào)途徑或被RA信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的因子。(ii)能將多能性賦予給分化的細(xì)胞或?qū)⒊审w細(xì)胞轉(zhuǎn)化成多能細(xì)胞的因子的基因產(chǎn)物或編碼所述因子的多核苷酸，所述因子優(yōu)選為下述中的ー種或多種0ct家族基因、Klf家族基因、以及Myc家族基因和Sox家族基因，或其功能等同物。在一方面,Klf-4的功能等同物是Esrrb。在一方面,0ct4的功能等同物是Nr5a2。在一方面，NRF包含RAR家族成員、Lrhl家族成員、Oct家族成員和Myc家族成員的基因產(chǎn)物或編碼所述基因產(chǎn)物的一或多種多核苷酸。在一方面，NRF包含RAR家族成員、Lrhl家族成員、KLF-4以及S0X2的基因產(chǎn)物，但不包含C-MYC和Oct 4。優(yōu)選地，在利用這類(lèi)NRF將人類(lèi)體細(xì)胞重編程為IPS細(xì)胞的本發(fā)明方法中，在重編程體細(xì)胞的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)KLF-4和S0X2表達(dá)，但是所產(chǎn)生的人類(lèi)IPS細(xì)胞系在染色體中不具有KLF-4和/或S0X2插入。在一方面，KLF-4和/或S0X2沒(méi)有整合于待重編程的細(xì)胞中，例如編碼這類(lèi)因子的轉(zhuǎn)座子沒(méi)有整合于本發(fā)明的人類(lèi)iPSC系中。在一方面，NRF包含或編碼0CT4、CMYC, LRHl以及RARG，且在另一方面，不包含其他2種Yamanaka因子中的任何一種因子。在一方面，NRF包括至少Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因或它們的基因產(chǎn)物。合適的家族成員包括Oct 3/4、Klf4、c-Myc家族基因和Sox2的基因產(chǎn)物或編碼它們的多核苷酸。在一方面，本發(fā)明的NRF包含或編碼所有4種Yamanaka因子，即Oct家族基因產(chǎn)物、Klf家族基因產(chǎn)物、Myc家族基因產(chǎn)物以及Sox家族基因產(chǎn)物，或這些基因產(chǎn)物的能促進(jìn)將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的功能等同物。在一方面，核重編程因子還包含或編碼下述中的ー種或多種
細(xì)胞因子，其和Myc家族基因的基因產(chǎn)物一起，或可選地代替Myc家族基因的基因產(chǎn)物。作為更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了上文所述的因子，其中所述細(xì)胞因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)。除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因以及Sox家族基因中各自的基因產(chǎn)物外的TERT基因的基因產(chǎn)物；除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因以及TERT基因中各自的基因廣物外，選自下述基因的一種或多種類(lèi)型的基因的一種或多種基因廣物SV40大 T 抗原、HPV16E6、HPV16E7 以及 Bmil ；一種或多種選自下述的基因的一種或多種基因產(chǎn)物Fbxl5、Nanog、ERas >ECAT15-2, Tcll以及β-連環(huán)蛋白；一種或多種選自下述的基因的ー種或多種基因產(chǎn)物ECATl、Esgl、Dnmt3L 、ECAT8、Gdf3, Soxl5、ECAT15-1、Fthll7、Sall4、RexUUTFU Stella、Stat3 以及 Grb2。優(yōu)選的NRF包含或編碼可合適地送遞到體細(xì)胞中并且可以在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的全長(zhǎng) Oct 3/4、Klf4、c-Myc 家族基因和 Sox2、Lrhl 和 Rarg。在一方面，上文所述的NRF還包含或編碼RXR，如RXR α、β或γ。在本發(fā)明的另一方面，NRF包含RA信號(hào)途徑的能促進(jìn)本文所述的體細(xì)胞重編程的組分。這類(lèi)組分可以是RA的下游效應(yīng)物、RARG或LRHl的上游或下游的調(diào)節(jié)劑或影響RA產(chǎn)生的分子。本申請(qǐng)所公開(kāi)的測(cè)定，允許鑒定所述途徑的合適組分(即能將體細(xì)胞重編程從而形成本文所述iPS細(xì)胞的那些組分)，并允許確定實(shí)現(xiàn)重編程的那些組分的合適濃度。本發(fā)明的NRF還包括內(nèi)源基因或內(nèi)源基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑，如RAR/RXR家族成員和Lrhl家族成員的基因或基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑。例如，可以增強(qiáng)LRHl和/或RARG的內(nèi)源表達(dá)。通過(guò)插入或操作驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)宿主基因表達(dá)的操作，從而提供必須的增強(qiáng)的重編程效果。這類(lèi)啟動(dòng)子可以包括MSCV(逆轉(zhuǎn)錄病毒)的LTS、CAG以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Tet-Οη。這類(lèi)NRF可以用于本發(fā)明的所有所述方面。作為實(shí)例,包含或表達(dá)4種Yamanaka因子或其功能等同物和Lrhl的核重編程因子可以與內(nèi)源Rarg表達(dá)得到增強(qiáng)或可以通過(guò)用細(xì)胞外因子處理細(xì)胞而得以增強(qiáng)的細(xì)胞聯(lián)合使用。這類(lèi)細(xì)胞外因子可以是例如化學(xué)制品或環(huán)境條件的變化。因此，本發(fā)明還涉及這樣的細(xì)胞，其基因組已經(jīng)得到修飾，從而允許內(nèi)源(RAR/RXR)家族成員和/或Lrhl家族成員的表達(dá)響應(yīng)于細(xì)胞外因子而得到增強(qiáng)或受到調(diào)節(jié)。NRF可以與其他化合物或藥物聯(lián)合使用，所述其他化合物或藥物可以是促進(jìn)重編程或?qū)嶋H上改善NRF的送遞效率的化合物或藥物。NRF可以包含本文所述的基因產(chǎn)物如蛋白質(zhì)，為單獨(dú)表達(dá)的或融合蛋白形式。在一方面，NRF可以包含或組成為編碼上文所述的重編程因子的組分的多核苷酸，所述多核苷酸可以送遞到體細(xì)胞。因此，可以理解的是，重編程因子可以包含蛋白質(zhì)成分(composition),或經(jīng)設(shè)計(jì)允許合適的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的核酸成分,或?qū)嶋H上多核苷酸和蛋白質(zhì)的組合。合成的或純化的化學(xué)品也可以是本發(fā)明NRF的一部分。例如，如果使用蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或拮抗劑，則如果合適，NRF可以包含經(jīng)設(shè)計(jì)而激活或抑制蛋白質(zhì)功能的化學(xué)品。如果使用多核苷酸，且如果多個(gè)基因產(chǎn)物形成NRF，則這些可以編碼于相同或不同的多核苷酸片段上。例如，一方面，Rarg和Lrhl基因產(chǎn)物可以編于一 DNA構(gòu)建體上，且I、
2、3或4種Yamanaka因子可以編碼于單獨(dú)的多核苷酸片段上。編碼NRF的蛋白質(zhì)組分的多核苷酸可以是裸DNA或與送遞試劑復(fù)合的DNA或采用適合送遞到體細(xì)胞中的諸如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子或病毒載體的載體形式。為了完整，在這個(gè)意義上，本發(fā)明還涉及編碼所述NRF的組分的多核苷酸，則本發(fā)明還涉及編碼所述NRF組分的的變體的多核苷酸，所述組分能単獨(dú)或組合地促進(jìn)由體細(xì)胞形成iPS。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸和載體的細(xì)胞，但不限于體細(xì)胞，并包括例如適合產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的核酸的諸如細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞。NRF的各種組分可以單獨(dú)或組合地在調(diào)節(jié)系統(tǒng)的控制下表達(dá)。在一方面，一種或多 種組分，例如4種Yamanaka因子(或其等同物)的任何組分,Rarg或Lrhl,單獨(dú)或組合,可以在Tci-Ollii系統(tǒng)(Clonetech)的控制下表達(dá)。因此,在一方面,控制例如Lrhl或Rarg表達(dá)的啟動(dòng)子，受到啟動(dòng)子內(nèi)響應(yīng)四環(huán)素的存在或不存在的元件的控制。本發(fā)明的重編程因子，可以與其他重編程技術(shù)如低氧聯(lián)合使用。作為實(shí)例，本發(fā)明的NRF可以包含下述(作為蛋白質(zhì)，或編碼所述蛋白質(zhì)的DNA或RNA，或多核苷酸和蛋白質(zhì)的混合物)# Rarg 和 Lrhl# Rarg、Lrhl、0ct4 和 cMyc· Rarg、Lrhl、Sox2 和 Klf4# Rarg、Lrhl、0ct4、cMyc、Sox2 和 Klf4.為了避免懷疑，NRF可以包含單組分蛋白質(zhì)，或包含編碼單個(gè)蛋白質(zhì)的核酸，或編碼本文所述的單個(gè)激動(dòng)劑或拮抗劑。諸如Rarg的某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，影響重編程效率。因此，本發(fā)明還涉及確定合適的NRF重編程水平的方法，所述方法包括改變NRF或其組分的濃度，并直接或例如通過(guò)監(jiān)測(cè)0ct4的表達(dá)并選擇用于重編程的NRF的合適濃度來(lái)監(jiān)測(cè)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生。本發(fā)明還包括用于本文所公開(kāi)的重編程的方法，其中用上文所評(píng)估的適當(dāng)量的NRF來(lái)實(shí)現(xiàn)重編程。本文所公開(kāi)的各種元件的合適濃度包括例如Ro-41_5253RARa拮抗劑I μ Μ、CD2665RARg 拮抗劑 I μ M、AM580RARa 激動(dòng)劑 10nM、CD437RARg 激動(dòng)劑 ΙΟΟηΜ、約 1Χ1(Γ9Μ 的所有的反式RA和9-順式RA。本發(fā)明的NRF可以包含載體，諸如質(zhì)粒、活病毒載體或轉(zhuǎn)座子，載體具有編碼本文所公開(kāi)的NRF組分。特別是，載體可以是包含編碼本文所述核重編程因子組分的核酸的載體。本發(fā)明的載體通常適合將編碼NRF的組分的核酸送遞到體細(xì)胞中，并且還可以含有允許或促進(jìn)所述核酸所編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的必需序列。載體可以表達(dá)來(lái)自染色體外基因座的NRF的組分，或可以被設(shè)計(jì)為整合到染色體中，并從染色體內(nèi)表達(dá)。諸如PiggyBac的轉(zhuǎn)座子可以適合將核酸送遞到體細(xì)胞中的用途，并且還可以適合將外源DNA送遞到本發(fā)明的iPS細(xì)胞中的用途。本發(fā)明還涉及通過(guò)體細(xì)胞的核重編程制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使本文所述的核重編程因子與體細(xì)胞接觸的步驟。所述方法可以任選地包括例如通過(guò)選擇或篩選具有本文所述特性的細(xì)胞而選擇或篩選iPS細(xì)胞的另ー步驟。使NRF與體細(xì)胞接觸可以以多種方式發(fā)生。例如，可以將核重編程因子添加于體細(xì)胞的培養(yǎng)物或?qū)⒕幋a核重編程因子的組分的載體引入體細(xì)胞。載體例如可以是質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子或病毒載體。如果NRF包含蛋白質(zhì)，則合適的是，將NRF暴露于培養(yǎng)的體細(xì)胞，例如持續(xù)3、4、5、
6、7、8、9 或 10 天。在一方面，不超過(guò) 8、9、10、11、12、13、14 或 15 天。體細(xì)胞可以是任何合適的細(xì)胞，且待編程的體細(xì)胞的類(lèi)型并無(wú)特別限制。例如，可以使用成熟的體細(xì)胞或祖細(xì)胞以及胚胎期的體細(xì)胞。當(dāng)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞用于疾病的治療 性治療時(shí)，使用分離自待治療的患者的體細(xì)胞是合適的。例如，可以使用與疾病有關(guān)的體細(xì)胞、參與疾病的治療性治療的體細(xì)胞等。體細(xì)胞可以是任何合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如，作為實(shí)例，人類(lèi)、小鼠、大鼠、豬、綿羊或牛。在一方面，一旦體細(xì)胞被重編程，則與所述體細(xì)胞接觸的外源重編程因子(也稱為外源因子或外源NRFs)的表達(dá)被關(guān)閉。這可以通過(guò)使用諸如Tet-On的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)，所述啟動(dòng)子通過(guò)從培養(yǎng)基中移除Dox而使得待關(guān)閉的外源重編程因子表達(dá)。合適的是，在使體細(xì)胞與NRF接觸約4天后關(guān)閉外源重編程因子的表達(dá)，在該階段已經(jīng)將體細(xì)胞重編程并足以能轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞而無(wú)需來(lái)自外源重編程因子的其他輸入。合適的是，在用NRF處理細(xì)胞后的10天內(nèi)，如在3、4、5、6、7、8或9天內(nèi)，并且合適的是，在處理2天后，鑒定并選擇iPS細(xì)胞，例如，這可以通過(guò)本文所述的Oct 4表達(dá)來(lái)評(píng)估，。根據(jù)本發(fā)明的方法，用于選擇出現(xiàn)于培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法并無(wú)特別限制，且合適的是，可以使用任何熟知的方式，例如利用藥物抗性作為指數(shù)，可以利用藥物抗性基因等作為標(biāo)志物基因來(lái)分離誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。含有未分化狀態(tài)和多能性的ES細(xì)胞的各種培養(yǎng)基以及不能維持這類(lèi)特性的各種培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是已知的，且利用合適培養(yǎng)基的組合可以有效分離誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用廣泛應(yīng)用于ES細(xì)胞的證實(shí)方式可以容易地證實(shí)分離的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化和増殖能力。在另一方面，本發(fā)明涉及維持多能性的合適量的RA激動(dòng)劑或拮抗劑(優(yōu)選RA拮抗劑)在任何細(xì)胞系(如人類(lèi)或小鼠的任何細(xì)胞系)的ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞培養(yǎng)基中的用途。本發(fā)明還涉及包含RA激動(dòng)劑或拮抗劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)短暫加強(qiáng)RA信號(hào)傳導(dǎo)將細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能細(xì)胞的方法。在一方面，加強(qiáng)RA信號(hào)傳導(dǎo)可以包括使體細(xì)胞與下述中的一種或種接觸i視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物或，該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；ii Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；iii視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；iv參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物；V編碼(i)-(iv)中任一的多核苷酸。合適的是，將RA信號(hào)傳導(dǎo)加強(qiáng)3、4、5、6、7或8天。在一方面,不超過(guò)8天。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定基因產(chǎn)物的合適劑量，從而優(yōu)化iPS產(chǎn)生。諸如上文所列家族成員的諸如蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物或其片段或變體可以直接添加于細(xì)胞，或可以例如通過(guò)插入表達(dá)期望的基因產(chǎn)物的表達(dá)載體在所操作的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，或可以通過(guò)啟動(dòng)子插入或操作而操作宿主基因表達(dá)。因此，本發(fā)明還涉及體細(xì)胞，其中一種或多種下述基因產(chǎn)物的表達(dá)水平已經(jīng)通過(guò)宿主細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)染或基因操作(例如通過(guò)靶向插入事件)而得到修飾i視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；ii Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物，或該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；iii參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或該基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑；iv參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物。 本發(fā)明還涉及通過(guò)本文所述方法獲得的或可獲得的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。iPS可以來(lái)自任何物種，但是合適的是，獲得自作為初始材料的小鼠或人體細(xì)胞。體細(xì)胞可以是任何合適的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞。特別是本發(fā)明涉及通過(guò)本文所述方法獲得的或可獲得的誘導(dǎo)性人類(lèi)多能干細(xì)胞。本發(fā)明合適地具有下述特性中的ー種或多種iPS細(xì)胞合適地是未分化的多能細(xì)胞。多能性可以利用下述方式評(píng)估，例如檢測(cè)諸如0ct4、Nanog、Rexl的一種或多種多能性標(biāo)志物的表達(dá),或使0ct4、Nanog、Rexl中的一種或多種的啟動(dòng)子區(qū)脫甲基化。在本申請(qǐng)的語(yǔ)境中，Oct 4的表達(dá)表示與報(bào)道ES細(xì)胞系(其中IRES-Puro-Egfp盒靶向0ct4基因座)中的表達(dá)水平相當(dāng)?shù)谋磉_(dá),如下文實(shí)施例所述和圖2a和圖7所示。這些報(bào)道ES細(xì)胞對(duì)2. O μ g/ml的嘌呤霉素是抗性的。合適的是，iPS細(xì)胞可以解離成能在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞分裂的活單細(xì)胞。iPS細(xì)胞可以合適地生長(zhǎng)于M15+hLIF培養(yǎng)基(對(duì)于600ml M15, 500或504ml (82%)GIBC0 敲除 D-MEM(Invitrogen,目錄號(hào):10829018) ,90ml (15%)胎牛血清(所測(cè)試的ES細(xì)胞)、6ml (1%)青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100X)、液體(Invitrogen,目錄號(hào)10378-016),4. 3ul β-巰基こ醇(Sigma,目錄號(hào)M 7522) LIF (IXlO6 單位)中。iPS細(xì)胞可以合適地生長(zhǎng)于2i+LIF培養(yǎng)基中。(2i+LIF培養(yǎng)基是2i補(bǔ)充了 lu/mL人重組LIF的2i培養(yǎng)基。2i培養(yǎng)基是補(bǔ)充了 IuM PD0325901和3 μ MCHIR99021的Ν2Β27。Ν2Β27培養(yǎng)基是DMEM/F12和Neurobasal培養(yǎng)基的I: I的混合物，DMEM/F12補(bǔ)充了修飾的Ν2(胰島素25 μ g/mL、apo_轉(zhuǎn)鐵蛋白100 μ g/mL、黃體酮6ng/mL、腐胺16 μ g/mL、亞硒酸鈉30nM、牛血清白蛋白組分 V 50 μ g/mL), Neurobasal 培養(yǎng)基(Neurobasal medium)補(bǔ)充了B27。DMEM/F12、Neurobasal 培養(yǎng)基以及 B27 均來(lái)自 Gibco)。本發(fā)明的iPS細(xì)胞合適地能在合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件下分化成體細(xì)胞。合適的是，本發(fā)明的iPS細(xì)胞可以用于在胚泡注射后產(chǎn)生嵌合體，從而證明種系傳遞。當(dāng)注射到小鼠中吋，iPS細(xì)胞合適地能形成畸胎瘤。在一方面，iPS細(xì)胞生長(zhǎng)合適地不依賴人類(lèi)ES細(xì)胞通常所需的FGF?？梢詫⒃鷌PS細(xì)胞合適地解離成單細(xì)胞，隨后所述單細(xì)胞在諸如M15+LIF的合適培養(yǎng)基中能形成次級(jí)集落和穩(wěn)定的細(xì)胞系。
本發(fā)明的iPS細(xì)胞合適地在形態(tài)上不同于在相同的條件下僅利用4種Yamanaka因子oct4、cmyc、sox2和Klf4制備的那些細(xì)胞。在一方面，iPS在預(yù)失活的狀態(tài)下包含2個(gè)X染色體。小鼠雌性基態(tài)ES細(xì)胞中的2個(gè)X染色體是預(yù)失活的，而小鼠EpiSC已經(jīng)經(jīng)歷了 X失活。用6F) Yamanaka因子LRHl和RARG)所產(chǎn)生的雌性iPSC具有2個(gè)活性X染色體。iPS細(xì)胞的基因組完整性可以利用光譜核型分析證實(shí)。即使在體外培養(yǎng)后，細(xì)胞仍然保持正常的核型，這一事實(shí)表示遺傳穩(wěn)定性/基因組完整性。合適的是，在傳代后(例如在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10、15或20代后)，iPS細(xì)胞具有正常的核型。因此，在一方面，本發(fā)明涉及特征為下述至少之一的誘導(dǎo)性人類(lèi)多能細(xì)胞 表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物，如0ct4、Nanog、Rexl等； 不依賴FGF而生長(zhǎng)； 在傳代后保持正常的核型，所述核型利用光譜核型分析進(jìn)行測(cè)量； 當(dāng)注射到小鼠中時(shí)能形成畸胎瘤；· 0ct4、Nanog、Rexl中的一種或多種的啟動(dòng)子區(qū)脫甲基化； 細(xì)胞可以解離成能形成次級(jí)集落的活單細(xì)胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增值； 外源重編程因子(例如，LRHU Rarg、0ct4、Sox2、Klf4以及c_Myc中的ー種或多種或其等同物)表達(dá)不存在或不顯著；在一方面，本發(fā)明的iPS細(xì)胞不表達(dá)外源重編程因子。如說(shuō)明書(shū)到處所討論的，這可以利用諸如Tet-On的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)，Tet-On允許通過(guò)從培養(yǎng)基中除去Dox而關(guān)閉外源重編程因子的表達(dá)。這還可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)防止外源重編程因子整合到iPS細(xì)胞的染色體中或從基因組中除去任何整合的外源重編程因子，從而使得iPS細(xì)胞不含任何外源重編程因子。在一些情況下，用諸如Tet-On的啟動(dòng)子關(guān)閉外源重編程因子的表達(dá)，可以允許可通過(guò)RT-PCR檢測(cè)但在生物學(xué)上無(wú)關(guān)緊要的外源因子的ー些表達(dá)。在一方面，本發(fā)明的人類(lèi)iPS細(xì)胞在FGF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不好并且不保持多能性。在一方面，iPS產(chǎn)生可以通過(guò)構(gòu)建含有本文所述的oct4-IRES-puro_egfp敲入的體細(xì)胞來(lái)評(píng)估。含有所述構(gòu)建體的細(xì)胞被視為哺乳動(dòng)物(如小鼠或人類(lèi))iPS細(xì)胞，其合適地對(duì)濃度為2ug/ml或更高的嘌呤霉素具有抗性，且優(yōu)選地還是GFP陽(yáng)性的，這可以合適地通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。在另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)分化本文所述的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的體細(xì)胞，以及涉及包含通過(guò)分化本文所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的一個(gè)或多個(gè)體細(xì)胞的組織、器官或非人類(lèi)動(dòng)物。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種因子、化合物或因子和化合物的組合，可以在體外實(shí)現(xiàn)分化?？赏ㄟ^(guò)分化本發(fā)明的iPS細(xì)胞而獲得的細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞、胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、ネ申經(jīng)細(xì)胞等)潛在地特別有用，這是因?yàn)樗鼈兛梢杂糜诙喾N疾病的干細(xì)胞移植療法，所述疾病例如心功能不全、胰島素依賴性糖尿病、帕金森氏病、癌癥以及脊髓損傷，由此可以避免移植后有關(guān)使用人類(lèi)胚胎和排斥的倫理問(wèn)題。由本文所公開(kāi)的iPS體外/離體產(chǎn)生的細(xì)胞、組織以及器官，在評(píng)價(jià)諸如藥物的化合物的功能或毒性方面是有價(jià)值的。因此，本發(fā)明還涉及iPS細(xì)胞和由此類(lèi)iPS細(xì)胞衍生的組織、器官以及非人類(lèi)動(dòng)物在分析化合物或醫(yī)藥治療的效果中的用途。人類(lèi)iPS細(xì)胞可以用于與感染性物質(zhì)有關(guān)的高通量篩選讀取。一方面，遺傳學(xué)修飾的或遺傳學(xué)突變的(包括純合突變體)(主要是喪失功能突變)人類(lèi)iPS細(xì)胞或由iPS細(xì)胞分化的體細(xì)胞可以被病原體感染，從而鑒定抑制或增強(qiáng)感染的因子。本發(fā)明還提供了利用誘導(dǎo)通過(guò)上述方法所獲得的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化而獲得的各種細(xì)胞，評(píng)估化合物、藥物、毒物等的生物功能或毒性的方法。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本文所述的核重編程因子或細(xì)胞或組織以及藥物可接受賦形劑。合適的賦形劑尤其包括，藥物可接受緩沖液、載體和水。在一方面，本發(fā)明的組織或器官或動(dòng)物并非衍生于人類(lèi)iPS細(xì)胞。在可選的方法，所述組織或器官衍生于人類(lèi)iPS細(xì)胞。在一方面，本發(fā)明不延伸至人類(lèi)胚胎或成體，但可以延伸至人類(lèi)器官或組織或在胚胎狀態(tài)確定前衍生自單個(gè)iPS細(xì)胞的人類(lèi)細(xì)胞群。 在一方面，iPS細(xì)胞是單個(gè)人類(lèi)細(xì)胞。本發(fā)明的iPS細(xì)胞的基因組例如通過(guò)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行合適的遺傳操作。我們已經(jīng)證明，可以用高效轉(zhuǎn)座到染色體中的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染人類(lèi)iPS細(xì)胞。因此本發(fā)明涉及對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的方法，所述方法包括將外源多核苷酸序列送遞到宿主染色體中，合適的是，送遞轉(zhuǎn)座子或基因捕獲構(gòu)建體或基因靶向構(gòu)建體。然而，可以將任何合適的構(gòu)建體送遞到本發(fā)明的iPS細(xì)胞中。在一方面，本發(fā)明的iPS細(xì)胞易于進(jìn)行同源重組和/或靶向，從而合適地允許校正遺傳突變，并易于潛在地在患者細(xì)胞中引入新的有利遺傳變化。本發(fā)明還涉及iPS細(xì)胞，其基因組包含外源DNA序列。本發(fā)明還涉及醫(yī)藥治療方法以及本發(fā)明在醫(yī)藥中的用途。本文公開(kāi)的iPS細(xì)胞或由其產(chǎn)生的體細(xì)胞可以在治療中用作藥物。此外，由人類(lèi)體細(xì)胞產(chǎn)生患者特異性人類(lèi)iPS系的能力使得校正iPS細(xì)胞中患者特異性遺傳異常并產(chǎn)生用于基因療法的無(wú)突變細(xì)胞成為可能。由本文所述iPS產(chǎn)生的組織或器官也可以用于醫(yī)藥中。NRF也可以用作藥物，其中它們被送遞且在體內(nèi)直接發(fā)揮作用，以及它們?cè)诋a(chǎn)生iPS中的用途。因此，本發(fā)明涉及合適地如本文所述的核重編程因子或iPS細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞、組織或器官在醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明還涉及治療有需要的患者的方法，所述方法包括合適地如本文所述，送遞藥物可接受量的重編程因子或iPS細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞，或送遞由本文所述的iPS細(xì)胞衍生的組織或器官。本發(fā)明還涉及合適地如本文所述的核重編程因子或iPS細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。如果體細(xì)胞分離自身體并且重編程為iPS細(xì)胞，則合適的是，所述細(xì)胞來(lái)自意圖得到治療的患者。本發(fā)明還涉及促進(jìn)分化的方法，其利用本發(fā)明的細(xì)胞或NRF，例如，產(chǎn)生起始iPS細(xì)胞或細(xì)胞群，由所述iPS細(xì)胞或細(xì)胞群產(chǎn)生分化的細(xì)胞。一方面，RAR家族成員如Rarg、Rara的激動(dòng)劑或拮抗劑或LRHl的激動(dòng)劑或拮抗劑可以用于促進(jìn)患者的細(xì)胞分化。本發(fā)明的可選方法涉及促進(jìn)細(xì)胞的分化而不是重編程。如本文所公開(kāi)的，全長(zhǎng)Rarg和Rara的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)RA所誘導(dǎo)的分化。本發(fā)明因此還涉及改善細(xì)胞的分化能力和/或生長(zhǎng)能力的方法，所述方法包括使體細(xì)胞與如諸如Rarg或Rara的全長(zhǎng)RAR并聯(lián)合RA以適合引發(fā)分化的濃度和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行接觸。任何合適的靶細(xì)胞都可以用于本發(fā)明中。用于通過(guò)本發(fā)明的NRF治療的合適的細(xì)胞包括肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、皮膚細(xì)胞以及單核細(xì)胞。在一方面，用于治療的靶細(xì)胞表達(dá)LRHl/RARG，或具有低水平的本文所述的C0UP-TFI/II和其他負(fù)效應(yīng)物，或兩者。本發(fā)明還涉及例如COUP-TFI、COUP-TFII, GCNF和G9a以及為多能基因的調(diào)節(jié)劑并與RA受體和LRHl家族成員相互作用的其他因子的miRNA和siRNA，所述miRNA和siRNA可以改善iPS細(xì)胞質(zhì)量和產(chǎn)生效率。本發(fā)明還涉及利用野生型或突變形式的C0UP-TFI、COUP-TFII, GCNF和G9a以及多能基因的其他調(diào)節(jié)劑改善iPS細(xì)胞質(zhì)量和產(chǎn)生效率。本發(fā)明一方面涉及能増加iPS細(xì)胞的數(shù)量和/或質(zhì)量的某些蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的組合，例如RARct、Rarg和Lrhl。在本文中提到蛋白質(zhì)或多肽應(yīng)當(dāng)認(rèn)為包括所述蛋白質(zhì)或多肽的能引發(fā)相同的或基本上相似的生物活性的功能等同物。相似的活性可以是，刺 激iPS細(xì)胞產(chǎn)生和/或iPS質(zhì)量的能力，這可以合適地利用本文所公開(kāi)的方法評(píng)估。作為非限制性實(shí)例，已知全長(zhǎng)RARa增強(qiáng)iPS產(chǎn)生，該蛋白質(zhì)的功能等同物也增強(qiáng)iPS產(chǎn)生，合適地以利用RARa所觀察到的水平的至少20、30、40、50%或更多增強(qiáng)iPS產(chǎn)生。功能等同物可以包括來(lái)自同一物種或不同物種的蛋白質(zhì)家族的其他成員，或諸如取代、添加或缺失突變體的蛋白質(zhì)變體。同樣，在本發(fā)明涉及例如編碼本文所公開(kāi)的蛋白質(zhì)或多肽或其功能等同物的多核苷酸方面，本發(fā)明涉及編碼所述序列的任何多核苷酸，例如天然存在的序列或所述天然存在的序列的簡(jiǎn)并等同物。本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，其一條鏈與編碼與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽在功能上等同的蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸合適地在嚴(yán)格性雜交條件下雜交。嚴(yán)格性條件可以包括例如將約45° C的6XNaCl/檸檬酸鈉(SSC)應(yīng)用于雜交步驟，隨后50° C下用2XSSC洗滌，或例如，可選地于42° C下5XSSC、20mM NaP04pH6. 8、50%甲酰胺下雜交并于42° C、0. 2XSSC中洗滌。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，基于待雜交的序列的長(zhǎng)度和GC核苷酸堿基含量，需要依據(jù)經(jīng)驗(yàn)改變這些條件，并且存在用于確定此類(lèi)改變的公式(參閱例如bambrook et al, Molecular Cloning:A Laboratory Manual , Second Edition, pages9.47-9. 51, Cold Spring Harbor, N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。應(yīng)當(dāng)理解到，以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的方式顯示了本文所述的具體實(shí)施方案。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用僅僅常規(guī)研究會(huì)意識(shí)到或能查明本文所述具體規(guī)程的許多等同規(guī)程。這類(lèi)等同規(guī)程視為位于本發(fā)明的范圍內(nèi)，并為權(quán)利要求涵蓋。說(shuō)明書(shū)所提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)表示本發(fā)明所述領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平。將所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)援引并入本文，其并入的程度如同特別和単獨(dú)地表示將每ー単獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)援引并入。當(dāng)與權(quán)利要求和/或說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)“包含”共同使用時(shí)，詞語(yǔ)〃a( —)〃或"an( —)〃的使用可以表示〃 一 〃，但是還與“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的涵義一致。在權(quán)利要求中使用術(shù)語(yǔ)“或”用來(lái)表示"和/或〃，除非清楚地指出僅僅指可選項(xiàng)或可選項(xiàng)相互排斥，盡管所公開(kāi)的內(nèi)容支持僅指可選項(xiàng)和“和/或”的定義。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)"約"用來(lái)表示，值包括裝置、用來(lái)確定值的方法的誤差的固有變動(dòng)，或存在于研究主題中的變動(dòng)。
如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)所用，措詞〃包含(comprising) 〃(和包含的任何形式，如〃包含(comprise) 〃和〃包含(comprises) 〃)、〃具有(having) 〃 (和具有的任何形式，如〃具有(have) 〃和〃具有(has) 〃)、〃包括(including) 〃 (和包括的任何形式，如〃包括(includes) 〃和〃包括(include) 〃)或〃含有(containing) 〃 (和含有的任何形式,如〃含有(contains)〃和〃含有(contain)")是包括在內(nèi)的或開(kāi)放式的，并且不排除其他未提及的要素或方法步驟。在一方面，這類(lèi)開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)還包含其范圍內(nèi)的限制或封閉式定義，例如“基本上由......組成(consisting essentially of)”或“由......組成(consisting of)，，。本文所用術(shù)語(yǔ)〃或其組合(or combinations thereof)"指該術(shù)語(yǔ)之前的所列項(xiàng)目的所有排列和組合。例如，〃A、B、C或其組合意圖包括下述至少之一 A、B、C、AB、AC、BC或ABC,如果順序在具體環(huán)境中重要，還有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。以該實(shí)例繼續(xù)，清楚地包括含有ー個(gè)或多個(gè)項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)的重復(fù)，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA,CABABB等。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通常不以任何組合限制項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)的數(shù)目，除非根據(jù)上下文顯而易見(jiàn)。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，在無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下，可以制備并實(shí)施本文所公開(kāi)和請(qǐng)求保護(hù)的所有組合物和/或方法。盡管已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合 物和方法，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不偏離本發(fā)明的概念、實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以改變本文所述的組合物和/或方法和步驟或步驟順序。所有此類(lèi)替代和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并視為位于所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)、范圍和概念內(nèi)。通過(guò)援弓I將本文提到的所有文獻(xiàn)并入，至可準(zhǔn)許的最充分程度。除非根據(jù)本申請(qǐng)的上下文顯而易見(jiàn)，否則本公開(kāi)內(nèi)容的任何要素清楚地考慮了與本公開(kāi)內(nèi)容的任何其他要素的組合。參考下述實(shí)施例，進(jìn)ー步描述本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明。實(shí)施例I表達(dá)視黃酸受體Y (RARG)和肝受體同系物I (LRH-I)以及4種Yamanaka因子將小鼠和人類(lèi)體細(xì)胞重編程為基態(tài)iPSC。摘要干細(xì)胞具有自我更新的能力和分化成不同細(xì)胞類(lèi)型的潛力?？梢酝ㄟ^(guò)表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)，但是機(jī)制仍然不明。在此我們報(bào)導(dǎo)了，調(diào)節(jié)視黃酸(RA)信號(hào)傳導(dǎo)強(qiáng)烈促進(jìn)重編程。此外，Rarg(視黃酸受體Y)和Lrh-I(肝受體同系物I)與4種因子的共表達(dá)，導(dǎo)致將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)在化學(xué)限定2i培養(yǎng)基中直接快速重編程為基態(tài)或天然iPSC。RA信號(hào)傳導(dǎo)與RARG和LRH-I在重編程中的關(guān)鍵功能在進(jìn)化上是保守的，這是因?yàn)橐蜃拥倪@種組合將人類(lèi)成纖維細(xì)胞重編程為iPSC，其在生長(zhǎng)特性、基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)依賴性以及對(duì)遺傳修飾的感受性方面與天然小鼠ES細(xì)胞相似。可以通過(guò)表達(dá)4種Yamanaka因子即0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4,將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)重編程為iPSC(l-3)。這些因子也能重編程小鼠(4-6)和人類(lèi)(7_9)中的各種體細(xì)胞譜系的細(xì)胞。已經(jīng)描述了最初重編程方案的許多改善，其包括替換0ct4(10)、使用化學(xué)化合物(11-14)、調(diào)節(jié)諸如Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(15)、擾亂諸如p53的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑(16，17)以及增強(qiáng)小鼠iPSC的種系能力(18)。重要的是，通過(guò)在四倍體互補(bǔ)測(cè)定中產(chǎn)生足月成體小鼠，小鼠iPSC已經(jīng)通過(guò)最嚴(yán)格的多能性測(cè)試(19-21)。盡管在iPSC領(lǐng)域有了巨大進(jìn)展，但是仍然存在技術(shù)挑戰(zhàn)，并且有關(guān)重編程機(jī)制知之甚少。例如，在小鼠中，重編程MEF花費(fèi)2-3周，且僅少量重編程細(xì)胞是真正的iPSC(22，23)。在人類(lèi)中，由原代細(xì)胞重編程的iPSC與常規(guī)人類(lèi)ES細(xì)胞相似，其被認(rèn)為具有更多的小鼠Epi干細(xì)胞(EpiStemcell)特征(24)。結(jié)果重編程需要RA信號(hào)傳導(dǎo)在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)具有復(fù)雜和多效性功能(25)。延長(zhǎng)對(duì)高濃度RA的暴露誘導(dǎo)小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞和胚胎性癌(EC)細(xì)胞的分化。然而，生化研究表明，在存在低濃度的RA的情況下，RA受體(RARs)能通過(guò)結(jié)合RAREoct的RAR = RXR異源ニ聚體正調(diào)節(jié)0ct4表達(dá)(28，29)，RAREoct是位于0ct4基因座啟動(dòng)子中的復(fù)合的RA響應(yīng)元 件(26-28)。此外，高水平的異源ニ聚體有效地從結(jié)合RAREoct競(jìng)爭(zhēng)掉諸如COUP-TF的阻遏物(28)。為了研究RA信號(hào)傳導(dǎo)在重編程中的作用，我們將0ct4、Sox2、Klf4、cMyc、Rara以及Rarg的cDNA克隆到PB-MSCV載體中，其中cDNA的表達(dá)受MSCV LTR控制(圖6A)。盡管外源c-Myc并非重編程必須的，但是省略它會(huì)降低重編程效率并且延遲該過(guò)程(23，30)。將個(gè)體PB-MSCV-cDNA與PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到MEF中(圖1A)。PB轉(zhuǎn)座促進(jìn)PB轉(zhuǎn)座子有效整合到基因組中，從而確保cDNA的穩(wěn)定表達(dá)(31)。ES細(xì)胞的多能性需要適當(dāng)水平的0ct4(Pou5fl)表達(dá)(32)，且已知0ct4的激活是重編程中的關(guān)鍵事件(3)。為了監(jiān)測(cè)重編程中內(nèi)源0ct4基因組的激活并允許公正地評(píng)估iPSC質(zhì)量，我們制備0ct4報(bào)道小鼠系，其中將IRES-Puro-GFP盒靶向0ct4基因座的3’ UTR(圖6B)。靶向的ES細(xì)胞對(duì)2. O μ g/ml嘌呤霉素(Puro)選擇具有抗性。這些細(xì)胞在熒光顯微鏡下并非可見(jiàn)的綠色，但是可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分(圖6C)。將Puio-GFP盒插入0ct4基因座，看起來(lái)不影響ES細(xì)胞多能性，這是因?yàn)榉N系有活性的嵌合體來(lái)源于這些ES細(xì)胞。因此將來(lái)自0ct4報(bào)道小鼠的MEF用于所有MEF重編程實(shí)驗(yàn)中，因此，可通過(guò)iPSC中的Puro抗性或GFP表達(dá)，方便地監(jiān)測(cè)重編程和iPSC質(zhì)量。由ES細(xì)胞樣細(xì)胞組成的集落在轉(zhuǎn)染后3三周開(kāi)始出現(xiàn)，且截至到第30天，Rara和Rarg的表達(dá)分別使AP+ES細(xì)胞樣集落的數(shù)量増加一和ニ個(gè)數(shù)量級(jí)(圖1B-C)。相比之下，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)Rara顯性失活(DN)形式(33)完全阻斷重編程(圖1B)，并且少數(shù)生長(zhǎng)中的集落不能擴(kuò)增成穩(wěn)定的系。因此，這些結(jié)果表明RA信號(hào)傳導(dǎo)在將MEF重編程為iPSC中的關(guān)鍵作用。接下來(lái)，我們利用RA的對(duì)Rarg具有特異性的合成激動(dòng)劑CD437 (34)檢查了 RA信號(hào)傳導(dǎo)在重編程中的特異性和短暫需要。以推薦的濃度向培養(yǎng)基添加CD437達(dá)4或8天大幅增加將MEF重編程為iPSC(圖1D)。然而，轉(zhuǎn)染后用⑶437處理MEF超過(guò)8天(圖1D)，或轉(zhuǎn)染增加量的PB-MSCV-Rarg質(zhì)粒DNA，降低了重編程效率(圖6D)，這反映了 RA信號(hào)傳導(dǎo)在重編程中的時(shí)間依賴方式和劑量依賴性方式。內(nèi)源0ct4的表達(dá)，在4種Yamanaka因子重編程的iPSC中是不穩(wěn)定的(11)。我們還發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)iPSC樣集落(PB轉(zhuǎn)染后第30天)，無(wú)論是由4種因子単獨(dú)重編程還是由4種因子加Rarg重編程的，僅存活于I. O μ g/mlPuro選擇，且GFP表達(dá)不可檢測(cè)(圖6E)，這表明在這些細(xì)胞中0ct4表達(dá)水平低。進(jìn)ー步的分析證實(shí)了它們的部分重編程狀態(tài)低水平的內(nèi)源多能性基因表達(dá)(圖1E)，在Nanog和Rexl啟動(dòng)子的差異甲基化的區(qū)域(DMR)中，保留了大量DNA甲基化(圖1F)。另ー方面，獲得了小量這樣的集落其對(duì)2. O μ g/ml Pirn)具有抗性，且在多能性基因表達(dá)、Nanog和Rexl啟動(dòng)子中的脫甲基化以及GFP表達(dá)方面與ES細(xì)胞相似(圖IE-F和圖6E)。令人驚訝的是，通過(guò)⑶437 (1-4天)處理所獲得的大多數(shù)集落表達(dá)GFP (圖1G)并且存活于2. O μ g/ml Puix)選擇。因此，調(diào)節(jié)RA信號(hào)傳導(dǎo)不僅極大增強(qiáng)重編程效率，而且還改善穩(wěn)定的0ct4表達(dá)所定義的iPSC質(zhì)量。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們使用對(duì)2. O μ g/ml Puro的抗性或GFP表達(dá)作為由0ct4-Puro-GFP MEF重編程的小鼠原代iPSC多能性質(zhì)量的替代標(biāo)準(zhǔn)。。 通過(guò)共表達(dá)Rarg和Lrh-I進(jìn)行快速重編程SF-I (Nr5aI)和LRH_1 (Nr5a2)是Nr5a類(lèi)固醇激素家族的2個(gè)成員。通過(guò)形成結(jié)合于RAREoct的異源ニ聚體，Sf-I和Rarg協(xié)同促進(jìn)和維持0ct4在EC細(xì)胞中的表達(dá)(29)。然而，Lrh-I而非Sf-I在ES細(xì)胞中表達(dá)，并且，在胚胎發(fā)育的移植后階段是必須的(35)。我們因此構(gòu)建了兩種PB載體PB-CAG-OCKS和PB-CAG-RL，其中4種Yamanaka因子(OCKS)、Rarg和Lrh-I (RL)分別通過(guò)T2A連接(圖7A)。這些因子的表達(dá)受CAG啟動(dòng)子的控制。將這兩種PB載體共轉(zhuǎn)染或單獨(dú)轉(zhuǎn)染到0ct4報(bào)道MEF中，用于重編程。共轉(zhuǎn)染OCKS和RL 4天后，立即出現(xiàn)2. O μ g/ml Purolr顯微ES樣集落。這些Purolr集落繼續(xù)生長(zhǎng)成大ES樣集落，并且通常從第7天到第10挑取它們用于擴(kuò)增和進(jìn)ー步表征(圖7B)。在轉(zhuǎn)染后第10天，與僅表達(dá)OCKS的對(duì)照相比，存在高達(dá)20多倍的由6種因子重編程的AP+集落(圖7C)。単獨(dú)的RL轉(zhuǎn)染在10天后不產(chǎn)生任何集落。以前利用基于病毒的強(qiáng)カ霉素誘導(dǎo)型載體進(jìn)行的研究表明，外源因子誘導(dǎo)的重編程是具有明確的中間步驟的逐漸過(guò)程，其中不同的細(xì)胞群可能變成iPSC(36，37)。在細(xì)胞進(jìn)入自我維持多能性狀態(tài)之前，經(jīng)常需要表達(dá)Yamanaka因子至少10-16天的時(shí)間(36，37)。為了確定在重編程中短暫需要6中外源因子，我們將CAG啟動(dòng)子轉(zhuǎn)換為四環(huán)素應(yīng)答元件(TRE)，以便這些因子的表達(dá)可以被強(qiáng)カ霉素(Dox)誘導(dǎo)(圖7A)。將兩種PB載體即PB-TRE-0CKS和PB-TRE-RL，以及表達(dá)反向四環(huán)素反式激活劑的PB_CAG_rtTA(圖7A)轉(zhuǎn)染到0ct4報(bào)道MEF中。將Dox添加到培養(yǎng)基中，并隨后在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)除去(圖2A)。4天的Dox處理足以獲得存活于獲得2. O μ g/ml嘌呤霉素的重編程細(xì)胞，其在缺少Dox的情況下繼續(xù)生長(zhǎng)成iPSC集落(圖2B-C)。相比之下，如果僅表達(dá)Yamanaka因子，則獲得2. O μ g/ml嘌呤霉素細(xì)胞需要至少12天(PB-TRE-OCKS)(圖2B)。因此，共表達(dá)Rarg/Lrh_l使重編程顯著加速。重要的是，根據(jù)它們對(duì)2. O μ g/ml Puix)的抗性和GFP表達(dá)，用這6種因子所產(chǎn)生的大多數(shù)iPSC的質(zhì)量很高(圖2D)。相比之下，Rarg或Lrh-I單獨(dú)和OCKS表達(dá)不顯著影響重編程動(dòng)力學(xué)和iPSC質(zhì)量(圖2D)。除了 0ct4報(bào)道系以外，我們還制備了 Rexl-GFP小鼠系，其中將GFP-IRES-Puro盒插入Rexl基因座中，使用這些Rexl-GFP MEF并利用Dox誘導(dǎo)型因子進(jìn)行重編程實(shí)驗(yàn)。Rex-I僅在ES細(xì)胞中表達(dá)，而不在EpiSC中表達(dá)(Brons et al. , 2007; Tesar et al.，2007)，因此代表完全重編程細(xì)胞的理想標(biāo)志物。利用4種Yamanaka因子、Lrhl和Rarg進(jìn)行4天Dox處理后，不依賴Dox的GFP陽(yáng)性集落再次出現(xiàn)。多能性基因如0ct4的完全激活是重編程以及體細(xì)胞克隆中的關(guān)鍵事件(38)。因此，在報(bào)道基因測(cè)定中，我們利用連接于0ct4啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)盒研究了 Rarg和Lrh-I的表達(dá)是否的確能快速激活0ct4表達(dá)(圖7D)。將攜帶各種cDNA的PB-CAG轉(zhuǎn)座子與報(bào)道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到MEF中，在2天后收獲MEF。OCKS或單獨(dú)的Rarg或Lrh-I的表達(dá)對(duì)熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)不具有實(shí)質(zhì)影響(圖2E)。然而，Rarg和Lrh-I在ES細(xì)胞中的共表達(dá)，將報(bào)道基因表達(dá)增加了 4-5倍(圖2E)，這與以前的生化發(fā)現(xiàn)相似，即Rarg和Sf-I協(xié)調(diào)激活0ct4在EC細(xì)胞中的表達(dá)(29)。因此，Rarg和Lrh-I的表達(dá)在6因子重編程系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)快速激活0ct4基因座，而OCKS可能在相對(duì)晚的階段參與重編程。進(jìn)一步表征來(lái)自MEF的用6種因子重編程的不依賴Dox的iPSC。這些iPSC表達(dá)通過(guò)免疫染色和qRT-PCR分析所檢測(cè)的適當(dāng)水平的多能性基因，并且在0ct4和Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域具有DNA脫甲基化(圖3A-C和圖8A-B)。此外，當(dāng)注射到Fl雜種小鼠中時(shí)，這些細(xì)胞在畸胎瘤中能分化成代表所有3個(gè)胚層的體細(xì)胞類(lèi)型(圖3D)。最后，一旦注射到胚泡 中，這些iPSC高效地有助于嵌合體中的種系(圖3E)。重要的是，大多數(shù)iPSC系不表達(dá)可檢測(cè)的外源因子(圖8C)，并且嵌合體不發(fā)展腫瘤(12個(gè)月，n=7)。因此，對(duì)2.0yg/ml Puro的抗性和GFP表達(dá)，是評(píng)價(jià)來(lái)自0ct4報(bào)道MEF的原代iPSC的合適標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)利用我們的6因子系統(tǒng)重編程的iPSC集落得到完全重編程，因此對(duì)于常規(guī)重編程而言不需要報(bào)道MEF。我們能容易地由野生型C57B6J MEF產(chǎn)生iPSC。此外，攜帶所有6種因子的cDNA的單獨(dú)的TO轉(zhuǎn)座子(OCKSRL)也有效地重編程MEF。在2i培養(yǎng)基中將MEF直接重編程為基態(tài)iPSC重編程MEF通常在含有血清或血清替代品的標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。這些培養(yǎng)基的復(fù)雜屬性不允許準(zhǔn)確確定單個(gè)化合物或生長(zhǎng)因子在重編程中的功能。在化學(xué)限定培養(yǎng)基中直接重編程體細(xì)胞，還會(huì)促進(jìn)治療性iPSC產(chǎn)生。因此，我們?cè)噲D在化學(xué)限定培養(yǎng)基N2B27-LIF中進(jìn)行重編程，N2B27-LIF能維持小鼠ES細(xì)胞的多能性(39)。用單獨(dú)的PB-TRE-OCKS或與PB-TRE-RL —起轉(zhuǎn)染MEF，并將其在明膠化平板中在具有Dox的N2B27-LIF培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)高達(dá)17天。早在表達(dá)6種因子后的第5天，便出現(xiàn)ES細(xì)胞樣集落，在第14-17天挑選所述集落，用于在添加兩種抑制劑即ro(ERKl/2抑制劑Η)0325901)和CH(GSK3抑制劑CHIR99021)的N2B27-LIF(2i/LIF培養(yǎng)基)中擴(kuò)增。在N2B27培養(yǎng)基中添加2i可選擇并維持基態(tài)小鼠和大鼠ES細(xì)胞(40，41)。在每次轉(zhuǎn)染中通過(guò)表達(dá)OCKS和RL，我們獲得平均50個(gè)iPSC集落，其中大多數(shù)集落(83%)能在2i/LIF中擴(kuò)增成系(圖4A)。相比之下，AP+集落直到轉(zhuǎn)染PB-TRE-0CKS后至少12天才出現(xiàn)，并且僅有少量AP+集落(28%)能擴(kuò)增成穩(wěn)定的系。接下來(lái)，我們?cè)噲D在2i/LIF培養(yǎng)基中將MEF直接重編程為iPSC。通過(guò)表達(dá)OCKS加RL而不是單獨(dú)的0CKS，基態(tài)iPSC在培養(yǎng)時(shí)顯著地快速出現(xiàn)(圖9A)，這表明，一些MEF，在表達(dá)6種因子后不久，就已處于重編程階段，它們?cè)?i/LIF培養(yǎng)基中，被進(jìn)一步促向基態(tài)多能性(11，36，37)。接下來(lái)，我們檢查了在2i/LIF中重編程的iPSC的質(zhì)量。這些iPSC表達(dá)適當(dāng)水平的多能性基因(圖4B-C)，并且在體外(圖4D)和在畸胎瘤(圖9B)中分化成所有3個(gè)胚層的體細(xì)胞類(lèi)型。因此，通過(guò)表達(dá)Rarg和Lrh-I調(diào)節(jié)視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)，將MEF快速重編程為基態(tài)或天然iPSC。
OCKS和RL能產(chǎn)生具有獨(dú)特特性的人類(lèi)iPSCOCKS加上RL通過(guò)有效誘導(dǎo)內(nèi)源0ct4表達(dá)將MEF迅速重編程為高質(zhì)量的iPSC的能力促使我們探討這些因子是否也在重編程人類(lèi)體細(xì)胞中發(fā)揮相似的作用。計(jì)算機(jī)分析確定，0ct4基因座處的RAREoct在幾種哺乳動(dòng)物基因組中是高度保守的(圖5A)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)也支持RAREoct在調(diào)節(jié)0ct4在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)的可能作用(42)。有意思的是，在小鼠基因組和人類(lèi)基因組中，在約30-40個(gè)基因座中鑒定了 RAREoct樣元件(表SI和S2)，但是0ct4基因座是唯一一個(gè)在兩個(gè)基因組中發(fā)現(xiàn)含有RAREoct位點(diǎn)的基因座，這表明了該元件在0ct4基因組中的功能意義。因此，我們探討了產(chǎn)生與小鼠ES細(xì)胞相似人類(lèi)iPSC的可能性。首先通過(guò)利用CAG啟動(dòng)子連續(xù)表達(dá)6種因子，我們產(chǎn)生了人類(lèi)iPSC。通過(guò)共表達(dá)PB轉(zhuǎn)座酶，將攜帶OCKS和
RL cDNA的PB-CAG轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座到人類(lèi)新生兒包皮真皮成纖維細(xì)胞(HDFn)中。早在轉(zhuǎn)染后10天，便在小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基中形成集落(M15-LIF)，有一些集落在形態(tài)上與小鼠ES細(xì)胞集落相似(例如，緊湊性提高的集落、高核質(zhì)比以及顯著的核仁)(圖10A)。在12-14天，挑選這些集落，并隨后利用標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞方案進(jìn)行培養(yǎng)(圖10A)。一旦用胰蛋白酶解離成單細(xì)胞懸浮液并接種于STO飼養(yǎng)細(xì)胞上，便有效形成次級(jí)集落，再接種效率高達(dá)70%。我們能由許多原代集落建立穩(wěn)定的系，其能在M15-LIF培養(yǎng)基中在飼養(yǎng)細(xì)胞上維持至少50代。在僅利用OCKS的對(duì)照中，原代集落在形態(tài)上不同于用OCKS加上RL所產(chǎn)生的那些集落(圖10A)。與以前的報(bào)道一致(7)，我們從來(lái)未能由這些OCKS集落在M15-LIF培養(yǎng)基中建立穩(wěn)定的系。除了它們能在常規(guī)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基中增值以外，這些人類(lèi)iPSC還表達(dá)關(guān)鍵的多能性基因(圖10B-C)，并且還能維持在2i/LIF培養(yǎng)基中，這證實(shí)了它們與基態(tài)小鼠ES細(xì)胞的相似性(40)(圖10A)。為了確定這些人類(lèi)iPSC的分化潛力，我們將其皮下注射到免疫低下的NSG小鼠(43)中。盡管利用CAG啟動(dòng)子連續(xù)表達(dá)外源因子，但是這些細(xì)胞形成具有代表所有3個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型的畸胎瘤(圖10D)。此外，即使在長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)后，這些iPSC保持了正常的核型(圖10E)。利用Y染色體多態(tài)性標(biāo)志物，我們還證實(shí)了 iPSC的HDFn來(lái)源(圖10F)。為了獲得不依賴外源因子表達(dá)的人類(lèi)iPSC，我們使用了 Tet-On系統(tǒng)，其中將6種因子的人類(lèi)cDNA克隆到PB-TRE質(zhì)粒中。將這些PB_TRE_cDNA質(zhì)粒與BP轉(zhuǎn)座酶和rtTA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HDFn細(xì)胞中。添加Dox，誘導(dǎo)外源因子表達(dá)(圖5B)。轉(zhuǎn)染后10-15天，出現(xiàn)含有ES細(xì)胞樣細(xì)胞的集落。將這些集落進(jìn)行胰蛋白酶處理，并再次接種到飼養(yǎng)平板中的無(wú)Dox的M15-LIF培養(yǎng)基中。隨后將不依賴Dox的次級(jí)集落在飼養(yǎng)細(xì)胞上在添加兩種抑制劑PD和CH的KSR-LIF培養(yǎng)基(KSR_2i_LIF)中擴(kuò)增成系(40，41)。根據(jù)一實(shí)驗(yàn)，我們建立了維持在KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中的5個(gè)不依賴Dox的iPSC系(圖5C)。與小鼠ES細(xì)胞相似，這些人類(lèi)iPSC易于擴(kuò)增，并且以I至4的拆分比，每隔3-4天進(jìn)行傳代。為了確定這些不依賴Dox的iPSC的多能性，我們檢查了關(guān)鍵多能性基因的表達(dá)。它們以可與人類(lèi)ES細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)內(nèi)源0ct4、Sox2和Nanog (圖和圖11A)，并且對(duì)于人類(lèi)ES細(xì)胞表面標(biāo)志物為陽(yáng)性染色(圖5E和圖11B)。重要的是，即使在RT-PCR分析中，外源因子的表達(dá)也是不可檢測(cè)的(圖11C)。最后，可以將不依賴Dox的人類(lèi)iPSC容易地在體外和體內(nèi)分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞(圖5F-G)。與在小鼠ES細(xì)胞中維持多能性依賴Lif/Jak/Stat途徑相反，將衍生于胚胎的常規(guī)人類(lèi)ES細(xì)胞培養(yǎng)于含有FGF2(堿性FGF)的培養(yǎng)基中，單獨(dú)的LIF不足以維持多能性(44，45)。不依賴Dox的人類(lèi)iPSC并不需要培養(yǎng)基中的FGF。實(shí)際上，它們生長(zhǎng)的很好，并且即使在存在FGF受體抑制劑SU54021的情況下，也在KSR_2i_LIF培養(yǎng)基中保持多能性基因表達(dá)(圖5H)。常規(guī)的ES細(xì)胞對(duì)JAK抑制劑(JAKi)具有抗性，但是在存在BMP4的情況下分化。相比之下，我們的人類(lèi)iPSC在存在BMP4的情況下增殖良好，但是如果將阻斷Stat3磷酸化的JAK添加到KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中，它們喪失0CT4和NANOG的表達(dá)，并且快速分化(圖5H)。最后，與人類(lèi)ES細(xì)胞相比，我們的人類(lèi)iPSC在KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中表達(dá)較低水平的譜系特異性基因，如PAX6、GATA6和S0X17 (圖5H)。為了確定不依賴Dox的人類(lèi)iPSC是否具有變成FGF依賴性的潛力，我們將培養(yǎng)基變成KSR-FGF2。與生長(zhǎng)于KSR-2i-LIF培養(yǎng)基相比，在傳代3次后，這些細(xì)胞仍然生長(zhǎng)良好，并且不表現(xiàn)出明顯的分化。它們?cè)谛螒B(tài)上與人類(lèi)ES細(xì)胞相似，并且表達(dá)適當(dāng)水平的多能性基因，如0CT4和NANOG (圖51)。然而，一旦將培養(yǎng)基變回KSR_2i_LIF，這些iPSC便變成分化的并且表達(dá)高水平的S0X17和S0X1，伴隨著0CT4和NANOG表達(dá)的喪失(圖51)，這與人 類(lèi)ES細(xì)胞的行為相似(44)。因此這些數(shù)據(jù)表明，生長(zhǎng)于KSR-2i-LIF培養(yǎng)基中的人類(lèi)iPSC具有轉(zhuǎn)變成與常規(guī)人類(lèi)ES細(xì)胞相似的細(xì)胞的潛力，但是反之不是這樣。因此，基于它們的生長(zhǎng)特性、信號(hào)傳導(dǎo)依賴性以及基因表達(dá)，利用我們的6因子平臺(tái)所產(chǎn)生的不依賴Dox的人類(lèi)iPSC，比常規(guī)人類(lèi)ES細(xì)胞更不成熟，并且與基態(tài)小鼠ES細(xì)胞相似(40，41)。因此，我們將這些人類(lèi)iPSC稱為桑格人類(lèi)iPSC (Sanger Human iPSC)或SH-iPSC。SH-iPSC與小鼠ES細(xì)胞相似的事實(shí)表明，它們可能可用于遺傳研究。在利用這些細(xì)胞進(jìn)行大量體外操作之前，我們利用光譜核型分析檢查了 SH-iPSC的基因組完整性。即使在大量的體外培養(yǎng)(20代)后，這些細(xì)胞仍然保持正常的核型(圖11D)，這表明，它們?cè)谶z傳上是穩(wěn)定的。因此我們進(jìn)行PB轉(zhuǎn)座，從而通過(guò)將PB-PGK-Neo轉(zhuǎn)座子和Pbase質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到SH-iPSC中將外源DNA引入這些細(xì)胞。由一次電穿孔，我們獲得約500，000個(gè)6418^集落，其占存活于電穿孔的細(xì)胞的約10%，轉(zhuǎn)座效率與利用小鼠ES細(xì)胞相當(dāng)(31)。在SH-iPSC中的有效PB轉(zhuǎn)座，為進(jìn)行基因組范圍的誘變篩選提供了機(jī)會(huì)。為了開(kāi)始探討這種可能性，我們將PB-SA-β geo基因捕獲轉(zhuǎn)座子和PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SH-iPSC中。SA-β geo盒整合到表達(dá)基因座中，能使β geo表達(dá)和捕獲事件評(píng)分為G418抗性。由一次電穿孔，我們回收了 22，000個(gè)64181^集落，其代表O. 3%的電穿孔幸存細(xì)胞。因?yàn)槲覀兊娜祟?lèi)iPSC系衍生于包皮成纖維細(xì)胞并且因此是XY，因此我們利用喪失HPRT活性的細(xì)胞中的6TG抗性，研究了 X染色體上HPRT基因座處的突變效率。在22，000個(gè)6418抗性集落中，我們獲得了 I個(gè)6-TG集落。該克隆的分子分析表明，PB插入內(nèi)含子2中并且干擾HPRT轉(zhuǎn)錄和剪接(圖11E)。因此，SH-iPSC適合基因操作和篩選?？梢詫⑽覀?因子重編程系統(tǒng)的獨(dú)特能力歸因于RA信號(hào)傳代和相關(guān)因子LRH-I在多能干細(xì)胞中的作用。與視黃酸的充分表征的促進(jìn)分化活性相比，RA信號(hào)傳導(dǎo)可以通過(guò)RAREoct正調(diào)節(jié)0ct4表達(dá)。高水平的RAR: RXR異源二聚體特異性結(jié)合RAREoct，其克服了 COUP-TF的抑制(28)。通過(guò)RA信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)0ct4表達(dá)的可選途徑是通過(guò)RAREoct內(nèi)的SF-I結(jié)合位點(diǎn)。RARG/LRH-1異源二聚體結(jié)合RAREoct，并且通過(guò)有效競(jìng)爭(zhēng)掉阻遏物協(xié)同激活0ct4表達(dá)(29)。這些類(lèi)固醇激素受體二聚體隨后將共激活劑如CBP/p300、P/CAF和SRC1/TIF2(25，46)募集到0ct4基因座，從而促進(jìn)進(jìn)一步的染色質(zhì)改造。因此，體細(xì)胞重編程中最關(guān)鍵的障礙之一，即內(nèi)源0ct4基因座的激活(47)，在外源因子表達(dá)之后即易于克月艮。有意思的是，注意到已經(jīng)證明，表達(dá)高水平LRH-I和低水平COUP-TF的細(xì)胞，如小鼠肝細(xì)胞(48)，具有較高的重編程效率(5)。我們的數(shù)據(jù)清楚地表明，激活0ct4基因座是早期重編程事件并且是關(guān)鍵的事件。已知通過(guò)表達(dá)4種Yamanaka因子激活0ct4基因座是不穩(wěn)定的，這在常規(guī)ES細(xì)胞培養(yǎng)基中導(dǎo)致許多部分重編程的集落(11)。利用0ct4報(bào)道MEF進(jìn)行重編程，允許直接觀察0ct4基因座激活。當(dāng)僅表達(dá)4種因子時(shí)，小量細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)中是GFP+，這表明這些細(xì)胞中Oct4激活。然而，在接下來(lái)的8天中，GFP+細(xì)胞數(shù)量并未實(shí)質(zhì)改變，這與4種因子介導(dǎo)的長(zhǎng)期重編程過(guò)程一致。相比之下，在表達(dá)6種因子的MEF中，從轉(zhuǎn)染后第3天起，GFP+以指數(shù)方式增加。而且，小量MEF在表達(dá)6種因子后(24小時(shí))幾乎立即獲得高水平的0ct4表達(dá)。然而，這種快速的0ct4激活并不能維持,并且在Yamanka因子未持續(xù)表達(dá)更多天的情況下,其可能失敗，這是因?yàn)閮H在Dox誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中在外源因子表達(dá)3-4天后才獲得自我維持的iPSC集落(圖2)。 Lrhl不足的ES細(xì)胞未表現(xiàn)出嚴(yán)重的多能性缺陷，因此其不是多能性線路(pluripotency circuit)的主要必須組分(35)。然而,其在ES細(xì)胞分化中對(duì)于0ct4表達(dá)的維持是必須的(35)。最近的證據(jù)還表明，Lrhl在典型的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的下游發(fā)揮作用，并且除了 0ct4外還調(diào)節(jié)其他多能性因子,如Nanog和Tbx3 (64)。Lrhl的這些關(guān)鍵功能,可能在其能在重編程中替代0ct4中發(fā)揮重要作用(10)。然而，我們的數(shù)據(jù)表明，這種替代可能是環(huán)境依賴性的，這是因?yàn)閱为?dú)的Lrhl以及4種Yamanaka因子的表達(dá)，在iPSC質(zhì)量或動(dòng)力學(xué)方面，并不顯著改善重編程。僅Rarg和Lrhl之間的協(xié)同相互作用深刻影響快速產(chǎn)生基態(tài)小鼠iPSC的重編程，并且能產(chǎn)生與基態(tài)小鼠ES細(xì)胞密切相似的人類(lèi)iPSC。有意思的是，盡管Rarg在包括MEF在內(nèi)的許多細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，但是其最高表達(dá)見(jiàn)于ES細(xì)胞中，MEF或人類(lèi)成纖維細(xì)胞中的內(nèi)源Rarg看起來(lái)并不足以與外源誘導(dǎo)的Lrhl合作來(lái)促進(jìn)快速且有效的重編程。最近的報(bào)告表明，通過(guò)重編程的次級(jí)成纖維細(xì)胞(iPSC-衍生的)獲得的人類(lèi)iPSC可以保持在添加有毛喉素的2i/LIF培養(yǎng)基中(49)。這些細(xì)胞看起來(lái)與基態(tài)小鼠ES細(xì)胞相似(40)，因此提供了基態(tài)或天然多能性存在于人類(lèi)中的獨(dú)立性證據(jù)。盡管他們的人類(lèi)iPSC可以變成不依賴Dox的，但是它們生長(zhǎng)緩慢，并且不能維持超過(guò)15-20代。另一最近的研究也描述了仍然依賴于外源因子表達(dá)的小鼠ES樣人類(lèi)iPCS(50)，其在某種程度上看起來(lái)與利用PB-CAG-cDNA獲得的PB-CAG人類(lèi)iPSC相似(圖10)。與這些報(bào)告相比，SH-iPSC直接由人類(lèi)原代成纖維細(xì)胞重編程，不依賴表達(dá)外源重編程因子，并且可以在含有2i/LIF的培養(yǎng)基中維持超過(guò)50代。此外，它們不依賴FGF，但是依賴LIF-JAK-STAT途徑。因此SH-iPSC與預(yù)想的基態(tài)人類(lèi)多能干細(xì)胞相似，并且對(duì)于人類(lèi)基因組的功能研究應(yīng)該是有用的。材料和方法質(zhì)粒載體的構(gòu)建為了制備 PB-TRE、PB-MSCV 和 PB-CAG 載體，由 pTight (Clontech)擴(kuò)增 Tet 應(yīng)答元件(TRE)，由 pMSCV-Neo (Clontech)擴(kuò)增 MSCV LTR，并由 pBluescript-CAG 載體擴(kuò)增 CAGG啟動(dòng)子(未發(fā)表的數(shù)據(jù))，并將其克隆到PB-bpA載體中(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Addgene)擴(kuò)增(引物位于補(bǔ)充表3中)4種小鼠和人類(lèi)Yamanaka因子的cDNA，并分別將其克隆到PB-TRE、PB-MSCV和PB-CAG轉(zhuǎn)座子載體中。由IMAGE克隆(Geneservice)擴(kuò)增小鼠和人類(lèi)Rarg、Lrhl以及Sf 1，并將其克隆到轉(zhuǎn)座子載體中。小鼠和人類(lèi)ES和iPSC培養(yǎng)通常將小鼠ES細(xì)胞和iPSC培養(yǎng)于M15培養(yǎng)基中敲除DMEM、15%胎牛血清(FBS, Hyclone)、IX谷氨酰胺-青霉素-鏈霉素(GPS, Invitrogen)、IX非必需氨基酸(NEAA, Invitrogen) >0. ImM β -疏基乙醇(3-ME, Sigma)以及 106U/ml LIF (Millipore)。將通過(guò)PB-CAG載體重編程的人類(lèi)iPSC培養(yǎng)于具有106U/ml人類(lèi)重組LIF的M15培養(yǎng)基中。將通過(guò)PB-TRE載體重編程的人類(lèi)iPSC維持DMEM/F12中，其具有IXGPS(Invitrogen)、20% 敲除血清替代品(Invitrogen)、IX NEAA、O. ImM β-疏基乙醇(β -ME, Sigma)以及兩種抑制劑 CHIR99021 (5 μ Μ)和 PD0325901 (I μ Μ)。
將人類(lèi)ES 細(xì)胞系 BG01V/h0G (來(lái)自 Invitrogen)和 Hl (來(lái)自 WiCell)培養(yǎng)于 hESC培養(yǎng)基中具有Glutamax (Invitrogen)的DMEM/F 12、20%敲除血清替代品(Invitrogen)、IX NEAA>O. ImM β -疏基乙醇(β -ME, Sigma)以及 4. Ong/ml FGF2 (Invitrogen)。用于重編程的MEF細(xì)胞和HDFn細(xì)胞的制備由12. 5d. p. c. 0ct4-IRES-Puro_Egfp胚胎制備MEF。為了減低胚胎與胚胎之間的差異，將來(lái)自具有相同基因型的幾個(gè)胚胎的MEF混合在一起，用于在MlO培養(yǎng)基中擴(kuò)增。在對(duì)MEF進(jìn)行計(jì)數(shù)、等分以及凍干之前，使其傳代一次。在電穿孔之前，將IXlO6個(gè)MEF接種到一個(gè)明膠化的15-cm組織培養(yǎng)板中。當(dāng)MEF匯合70-80%時(shí)，將它們用胰蛋白酶處理并收集用于電穿孔。MlO :敲除DMEM、10%胎牛血清(FBS, Hyclone)、1XGPS、IX非必需氨基酸(NEAA, Invitrogen)。HDFn細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen,并維持在補(bǔ)充了低血清生長(zhǎng)補(bǔ)充物(Invitrogen)的Media 106中。在計(jì)數(shù)、等分以及冷凍之前，使原代HDFn培養(yǎng)物傳代一次。在電穿孔之前，將5X105個(gè)HDFn細(xì)胞接種于3個(gè)T75組織培養(yǎng)瓶中。當(dāng)HDFn細(xì)胞融合70-80%時(shí)，將它們進(jìn)行胰蛋白酶處理并收集用于電穿孔。轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)利用Amaxa機(jī)器(Lonza)根據(jù)制造商的方案(程序A-023)進(jìn)行MEF轉(zhuǎn)染。在電穿孔后，將MEF接種于添加LIF的M15中的STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。對(duì)于Tet-On實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后24小小時(shí)，添加含有強(qiáng)力霉素(l.Oyg/ml)的M15，并每隔一天替換。在第7-第10天，將iPSC集落挑選到96孔板中，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件擴(kuò)增細(xì)胞。利用Amaxa機(jī)器根據(jù)制造商的方案(程序U-020)實(shí)現(xiàn)HDFn細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。電穿孔后，將HDFn細(xì)胞接種于添加了 hLIF的M15中的STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。對(duì)于Tet-On實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，添加含有強(qiáng)力霉素(2.0yg/ml)的M15，并每隔一天替換。通常在第10天挑選通過(guò)PB-CAG載體重編程的人類(lèi)iPSC集落，并在接種成24孔模式前用胰蛋白酶解離成單細(xì)胞懸浮液。通常在第30天(再接種后10天)挑選通過(guò)PB-TRE載體重編程的人類(lèi)iPSC集落，并在接種于24孔板之前，用胰蛋白酶解離成單細(xì)胞懸浮液。由次級(jí)集落建立穩(wěn)定的系，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件來(lái)維持。使用白細(xì)胞堿性磷酸酶試劑盒(Sigma)，通過(guò)堿性磷酸酶染色，觀察小鼠和人類(lèi)iPSC集落。
亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序利用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒(Qiagen),根據(jù)制造商的推薦,進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。PCR引物列于補(bǔ)充表5中。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T-easy (Promega)中。用針對(duì)各自啟動(dòng)子的M13正向引物和M13反向引物，對(duì)隨機(jī)選擇的克隆進(jìn)行測(cè)序。RT - PCR利用Rneasy微型試劑盒(Qiagen),分離RNA。隨后定量樣品，并用gDNA WipeOut處理。利用QuantiTect反向轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen),制備cDNA的第一鏈。對(duì)于每個(gè)RT-PCR反應(yīng)，我們使用了 50 - IOOng cDNA和補(bǔ)充表5所列的引物5。標(biāo)準(zhǔn)的PCR條件為94° C30s,60° C 30s,68° C30s ；X 30個(gè)循環(huán)。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR，我們使用了 Taqman基因表達(dá)測(cè)定。Taqman 探針也購(gòu)自 Applied Biosciences (補(bǔ)充表 Table 6)。在 9700HT 快速實(shí)時(shí) PCR相同(Applied Biosciences)中，進(jìn)行所有定量PCR。利用Δ Ct方法,相對(duì)于小鼠Gadph,測(cè)定小鼠基因表達(dá)。利用ACt方法，相對(duì)于人類(lèi)GADPH基因，測(cè)定人類(lèi)基因表達(dá)。 免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)將生長(zhǎng)于12孔飼養(yǎng)板中的iPSC用PBS洗滌，于4%PFA/PBS中在室溫下固定lOmin，用O. 3%Triton X-100在PBS中滲透lOmin，在5%驢血清中封閉lh，并添加一抗，于4° C過(guò)夜。Nanog(l:150，Abcam)、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81(l:10，由 Peter ff. Andrews博士惠贈(zèng))。將細(xì)胞在PBS中洗滌，并添加二抗(Alexa488IgG或IgM，1:1000 ；Alexa594IgG,I 1000)，并在室溫下孵育I小時(shí)。將生長(zhǎng)于96孔飼養(yǎng)板中的小鼠iPSC進(jìn)行胰蛋白酶處理，并重懸浮于M15中。將iPSC I, OOOrpm離心3分鐘，通過(guò)將板在組織上倒置，除去培養(yǎng)基。將iPSC重懸浮于PBS中，并通過(guò) Cytomics FC-500 (Beckman Coulter)進(jìn)行分析。將生長(zhǎng)于6孔板中的人類(lèi)iPSC進(jìn)行胰蛋白酶處理，并重懸浮于M15中。將iPSC 用 PBS 洗滌一次、離心，并與 SSEA-4-FITC、TRA-1-60-PE 或 TRA-1-81-FITC 抗體(BDBioscience) 一起孵育I小時(shí)。隨后洗漆iPSC,并將其重懸浮于PBS中，并通過(guò)CytomicsFC-500 (Beckman Coulter)進(jìn)行分析?；チ鲂纬蓪⑿∈骾PSC懸浮于MlO中，并將IXlO6個(gè)細(xì)胞皮下注射到Fl (129S5/C57B6)雜種小鼠的兩側(cè)背側(cè)面。切開(kāi)畸胎瘤，在磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定過(guò)夜，并在切片之前包埋于石蠟中。將人類(lèi) iPSCs(lX106)皮下注射到 NSG 小鼠(NOD. Cg-Prkdcscid I12rgtmlffjl/SzJ. The Jackson Laboratory)的兩側(cè)背側(cè)面。注射后8周，收獲畸胎瘤,用于固定和切片。用蘇木精和曙紅使切片染色。根據(jù)UK’ s 1986Animals Scientific Procedure Act (動(dòng)物科學(xué)步驟法案)和當(dāng)?shù)氐膫惱淼赖挛瘑T會(huì)規(guī)章(local institute ethics committeeregulations)進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。Splinkerette PCR按以前所述，進(jìn)行Splinkerette PCR，來(lái)確定PB基因組整合位點(diǎn)。用M13正向引物和反向引物，在兩個(gè)末端，對(duì)TA克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST確定PB插入位點(diǎn)。利用補(bǔ)充表4所述的引物，進(jìn)行除去外源因子的iPS系的基因組DNA PCR0統(tǒng)計(jì)分析將數(shù)據(jù)顯示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Excel 2008 (Microsoft)或Prism(Graphpad)進(jìn)行所有的統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例2在這里，我們報(bào)導(dǎo)，表達(dá)兩種新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rarg和Lrhl,以及4種Yamanaka因子，在少至3天內(nèi)快速激活內(nèi)源0ct4基因座，并且允許快速且有效地重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。所產(chǎn)生的iPS克隆，基于形態(tài)和分析分析，具有高質(zhì)量，并且能在體內(nèi)包括種系中分化成各種細(xì)胞類(lèi)型。當(dāng)應(yīng)用相同的策略重編程人類(lèi)新生兒包皮真皮成纖維細(xì)胞(HDFn)時(shí)，我們輕易獲得了依賴LIF但是不依賴FGF的人類(lèi)iPS細(xì)胞。此外，人類(lèi)iPS細(xì)胞增殖充分，并使其以單細(xì)胞密度在常規(guī)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下亞克隆，并在無(wú)任何可辨別的染色體異常的情況下進(jìn)行大量擴(kuò)增。因此，我們的新的iPS細(xì)胞平臺(tái)為在兩個(gè)哺乳動(dòng)物物種中實(shí)現(xiàn)全部的多能性提供了新的高效方法。對(duì)于探討人類(lèi)基因組功能，所產(chǎn)生的人類(lèi)iPS細(xì)胞具有極好的資源。Rarg顯性失活等位基因阻斷ES細(xì)胞分化 為了鑒定在基因突變時(shí)能夠阻斷ES細(xì)胞分化的基因，我們利用攜帶強(qiáng)CAG啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和一對(duì)剪接受體的PiggyBac DNA轉(zhuǎn)座子(PB)，在小鼠ES細(xì)胞中進(jìn)行基因篩選(Fig 12a)。將該轉(zhuǎn)座子插入到小鼠基因組中，可以上調(diào)插入位點(diǎn)附近的基因或者干擾它們，這取決于插入等位基因的結(jié)構(gòu)。為了有效排除培養(yǎng)物中的分化的ES細(xì)胞，我們將Puro-IRES-Egfp盒靶向Rexl基因座(Fig 12b)。因此，未分化的ES細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)中對(duì)嘌呤霉素(Puro)選擇會(huì)具有抗性并且是GFP+，而由于在分化后快速喪失Rexl表達(dá)，分化的細(xì)胞會(huì)被Puro選擇殺死并變成GFP_。用I. O μ M所有反式視黃酸(RA)將突變ES細(xì)胞的文庫(kù)分化4天，并隨后用嘌呤霉素進(jìn)行選擇(圖12c)。由獨(dú)立的突變ES細(xì)胞庫(kù),鑒定了幾個(gè)PurolrES細(xì)胞克隆。SplinkrettePCR分析在編碼Rarg、Pparg以及Gclc的基因中鑒定了 PB整合位點(diǎn)。對(duì)于Pparg，PB插入使全部的蛋白質(zhì)編碼序列過(guò)表達(dá)。相比之下，Rarg基因座具有4個(gè)獨(dú)立的PB插入，所有的插入都發(fā)現(xiàn)于內(nèi)含子9 (最后一個(gè)內(nèi)含子)中(圖12d)。這些PB插入截短了 Rarg，其失去外顯子10所編碼的氨基酸。過(guò)表達(dá)這種截短的Rarg證實(shí)了其阻斷RA所誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化的能力(圖12e)。這種截短的Rarg可能發(fā)揮野生型Rarg的顯性失活形式(Rarg-DN)的功能。全長(zhǎng)形式的Rarg和Rara (Rarg-FL和Rara-FL)的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了 RA所誘導(dǎo)的分化，然而所報(bào)道的Rara的顯性失活形式(Rara-DN) (20)，即使在高濃度RA的情況下，也能阻斷ES細(xì)胞分化。Rarg和Rara特異性拮抗劑⑶2665和Ro_41_5253也能阻斷ES細(xì)胞分化(圖12f)。因此這些數(shù)據(jù)證明了 Rarg和Rara在ES細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用。通過(guò)Rarg的信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)了重編程效率我們接下來(lái)測(cè)試在我們的篩選中所鑒定的基因是否在iPS細(xì)胞產(chǎn)生中發(fā)揮作用。為了直接評(píng)價(jià)iPS細(xì)胞的質(zhì)量，我們將IRES-Puro-Egfp盒靶向ES細(xì)胞中0ct4基因座的3’UTR，用于制備MEF細(xì)胞(圖6a) (57)。這些細(xì)胞在流式細(xì)胞術(shù)中是綠色的，并且在2 μ g/mL Puro中增殖良好(圖6b，且數(shù)據(jù)未顯示)。我們將4種Yamanaka因子單獨(dú)克隆到PB轉(zhuǎn)座子中，其中每一 cDNA的表達(dá)受MSCV的LTR(PB-MSCV-cDNAs，圖6c)的控制。隨后將這些4種轉(zhuǎn)座子和PB轉(zhuǎn)座酶(PBase)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF中。在3周內(nèi)，出現(xiàn)了與常規(guī)ES細(xì)胞的集落相似的iPS細(xì)胞集落。大多數(shù)iPS集落存活于1.0或1.5118/1111 Puro，但是很少數(shù)能生長(zhǎng)于2. Oyg/ml Puro中。此外，大多數(shù)iPS集落是GFP陰性的，這表明，這些細(xì)胞中的內(nèi)源0ct4基因座不表達(dá)至ES細(xì)胞中的水平。然而，生長(zhǎng)于2. O μ g/mL中的這些少數(shù)iPS集落的細(xì)胞，大部分是GFP陽(yáng)性的，其熒光強(qiáng)度與親代0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度相當(dāng)(圖13A)。RT-PCR和DMR測(cè)序證實(shí)，生長(zhǎng)于2. O μ g/mL Puro中的這些iPS克隆，在多能性基因表達(dá)和這些基因的啟動(dòng)子處的DNA甲基化方面，比I. O或I. 5 μ g/mL Puro所選擇的克隆，與常規(guī)ES細(xì)胞更相似(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表證明了許多以前的研究并與之一致，即4種Yamanaka因子所誘導(dǎo)的大多數(shù)iPS細(xì)胞僅是部分重編程的，并且內(nèi)源0ct4基因座并未完全激活。因此我們使用2. O μ g/mL或更高濃度的PuiO，聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)，來(lái)在隨后實(shí)驗(yàn)中定量評(píng)估iPS細(xì)胞質(zhì)量。接下來(lái)我們將全長(zhǎng)形式的Rarg、Rara> Pparg以及Gclc,以及顯性失活的Rarg和Rara克隆到PB-MSCV轉(zhuǎn)座子中，以便研究它們對(duì)Yamanaka因子所介導(dǎo)的重編程的影響。Pparg和Gclc的過(guò)表達(dá)看起來(lái)不影響Yamanaka因子介導(dǎo)的MEF的重編程(數(shù)據(jù)未顯示)。送遞Rarg-DN以及4種Yamanaka因子,產(chǎn)生了比對(duì)照稍微多的iPS集落(圖13B)。然而，顯著的是，Rarg全長(zhǎng)cDNA的表達(dá)使iPS集落的數(shù)量增加約100倍(圖13B和13C)。表達(dá)Rara-FL也顯著增強(qiáng)重編程效率，盡管程度比Rarg-FL低。相比之下，Rara-DN完全阻斷了 Yamanaka因子所誘導(dǎo)的重編程(圖13B)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明重編程過(guò)程中的視黃酸信 號(hào)傳導(dǎo)。與單獨(dú)的4種Yamanaka因子所誘導(dǎo)的低質(zhì)量iPS相似,添加Rarg-FL或Rara-FL過(guò)表達(dá)不明顯改善iPS細(xì)胞質(zhì)量，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)集落是GFP陰性的，并且僅少數(shù)集落存活于2. O μ g/mL Puro選擇。另一方面,來(lái)自過(guò)表達(dá)Rarg-DN的iPS克隆,在整個(gè)重編程過(guò)程中即使無(wú)任何選擇的情況下，具有與用2. O μ g/mL Puro所選擇的iPS克隆相當(dāng)?shù)南嗨频腉FP陽(yáng)性細(xì)胞百分比(圖13D)。表達(dá)Rarg-DN改善iPS細(xì)胞質(zhì)量，而Rara-DN過(guò)表達(dá)完全阻斷iPS過(guò)程，這一事實(shí)表明，RA信號(hào)傳導(dǎo)水平是重要的。因此我們測(cè)試了 Rarg的表達(dá)水平是否影響重編程效率。重編程效率的顯著降低與PB-MSCV-Rarg-FL DNA量的增加相關(guān)(圖13E)。而且利用較強(qiáng)的CAG啟動(dòng)子表達(dá)Rarg-FL將重編程效率降低至對(duì)照的水平，對(duì)照僅表達(dá)Yamanaka因子(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果證實(shí)，Rarg過(guò)表達(dá)對(duì)重編程的影響是劑量敏感性的。為了進(jìn)一步研究Rarg在iPS細(xì)胞中的作用，我們?cè)贛EF重編程中，聯(lián)合4種Yamanaka因子，測(cè)試了合成的Rarg特異性激動(dòng)劑⑶437。添加IOOnM的⑶437高達(dá)8天顯著增加iPS細(xì)胞集落的數(shù)量。此外，iPS細(xì)胞的質(zhì)量，如FACS所測(cè)量的，獲得顯著改善(圖13E)。然而，利用CD437處理細(xì)胞超過(guò)8天(第1_12天)大量降低iPS集落的數(shù)量。當(dāng)給予8天時(shí)Rara特異性激動(dòng)劑也可以改善重編程效率，但是對(duì)iPS克隆的質(zhì)量影響很小(圖13E)。這些結(jié)果表明，Rarg信號(hào)傳導(dǎo)在初始階段或早期階段促進(jìn)重編程，但是過(guò)度的Rarg信號(hào)傳導(dǎo)在后期階段對(duì)iPS細(xì)胞具有負(fù)面影響。盡管表達(dá)Rarg-FL或Rara-FL或利用它們的激動(dòng)劑改善重編程效率，但是它們看起來(lái)不縮短重編程時(shí)間，這是因?yàn)閕PS集落的形成仍然需要約3周的時(shí)間。Rarg和Lrhl協(xié)同促進(jìn)重編程為了探討Rarg信號(hào)傳導(dǎo)的下調(diào)是否是Rarg-DN iPS克隆更好質(zhì)量的主要原因，在具有或不具有5-Aza的情況下，我們用Rarg特異性拮抗劑⑶2665處理獨(dú)立地部分重編程的克隆。我們注意到，10 μ M⑶2665顯著改善部分重編程的克隆的質(zhì)量，但是當(dāng)與5-Aza —起使用時(shí)，其作用更明顯(圖14A)。然而，在處理4天后，該克隆仍然主要是GFP陰性的。這促使我們認(rèn)為，Rarg信號(hào)傳導(dǎo)的下調(diào)可能僅是Rarg-DN iPS細(xì)胞具有好得多的質(zhì)量的部分原因。在小鼠胚胎瘤細(xì)胞中(EC)，Rarg與孤兒受體Sfl (Nr5al)形成復(fù)合體，所述孤兒受體特異性結(jié)合0ct4啟動(dòng)子中的關(guān)鍵應(yīng)答元件RAREoct，并協(xié)同上調(diào)0ct4表達(dá)(59)。因?yàn)楸磉_(dá)Rarg極大地促進(jìn)iPS細(xì)胞產(chǎn)生，因此我們決定檢查Sfl是否也發(fā)揮相似的作用。因?yàn)镋Sfl通常不在小鼠ES細(xì)胞或早期小鼠胚胎中表達(dá)，因此我們還在實(shí)驗(yàn)中包括了其亞家族成員Lrhl (Nr5a2)，該成員在ES細(xì)胞和早期胚胎中都表達(dá)(62)。因此，我們將Sfl和LrhlcDNA分別克隆到PB-MSCV轉(zhuǎn)座子中，并與Yamanaka因子一起共轉(zhuǎn)染到MEF中。如圖14B所示，表達(dá)Lrhl顯著改善了重編程效率，但是其程度不如Rarg改善的程度。表達(dá)Sfl也增加iPS集落的數(shù)量，然而許多集落看起來(lái)是分化的(數(shù)據(jù)未顯示)。共表達(dá)Lrhl和Rarg不進(jìn)一步增加iPS集落的數(shù)量。另人驚訝的是，許多iPS在 早至轉(zhuǎn)染后10天而不是通常3周出現(xiàn)，其形態(tài)與野生型小鼠ES細(xì)胞幾乎不能區(qū)分(數(shù)據(jù)未顯不)O為了促進(jìn)在將來(lái)切除PB轉(zhuǎn)座子所攜帶的外源因子，我們制備了 PB-CAG_0ct4-2A-cMyc-2A-Klf4-2A-Sox (PB-CAG-0CKS)轉(zhuǎn)座子，其中 4 種 Yamanaka 因子用 T2A 肽序列連接，并由單個(gè)CAG啟動(dòng)子表達(dá)。PB-CAG-0CKS所誘導(dǎo)的一些iPS集落，在轉(zhuǎn)染后4_5天內(nèi)，在顯微鏡下可見(jiàn)。然而，這些集落中的細(xì)胞后來(lái)在形態(tài)上變成異質(zhì)的(圖7B)，并且顯然仍然不是完全重編程的，因?yàn)樵诘?0天挑選的大部分集落(90%)對(duì)2 μ g/mL是敏感的，并且含有低百分比的GFP陽(yáng)性細(xì)胞(圖2D)。這與以前的出版物一致，即如果僅使用Yamanaka因子，則iPS變成完全重編程的需要許多傳代。接下來(lái)，我們制備了 PB-CAG-Rarg-2A-LrhI (PB-CAG-RL)轉(zhuǎn)座子，來(lái)由單個(gè)啟動(dòng)子共表達(dá)Rarg和Lrhl。將PB-CAG-0CKS和PB-CAG-RL共轉(zhuǎn)染到MEF中4天后，在轉(zhuǎn)染后的4-5天內(nèi)，在顯微鏡下可見(jiàn)很小的ES樣集落。這些集落看起來(lái)在形態(tài)上是同質(zhì)的，并且在生長(zhǎng)方面與常規(guī)小鼠ES細(xì)胞非常相似(圖7B)。此外，與僅轉(zhuǎn)染了 PB-CAG-0CKS的對(duì)照相t匕，有大致多于7倍的iPS細(xì)胞集落。有意思的是，在第4-6天之間，我們經(jīng)常觀察到彼此并排形成的相同大小的2個(gè)、4個(gè)甚至8個(gè)很小的集落，在第8天時(shí)，其合并成I個(gè)或2個(gè)大集落，這反映了可能同時(shí)重編程來(lái)自一個(gè)親代MEF細(xì)胞的子細(xì)胞。有趣的是，幾乎所有這些集落對(duì)2 μ g/mL Puro選擇都具有抗性，并且由高百分比的GFP陽(yáng)性細(xì)胞組成(圖2D)，這表明由內(nèi)源0ct4基因座的強(qiáng)0ct4表達(dá)。為了研究能以多快激活內(nèi)源0ct4基因座，我們?cè)谵D(zhuǎn)染后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)MEF進(jìn)行Puro選擇。早至用PB-CAG-0CKS和PB-CAG-RL轉(zhuǎn)染后3天，選擇出Puro抗性iPS細(xì)胞集落(圖14C)，由此證實(shí)在該條件下0ct4基因座的快速激活。在僅用PB-CAG-0CKS轉(zhuǎn)染的對(duì)照MEF中，則僅在Puio選擇在第8天或以后開(kāi)始時(shí)出現(xiàn)Puio抗性集落。即使對(duì)于這些PuiO抗性集落而言，我們經(jīng)常在原代集落以及亞克隆過(guò)程中觀察到大部分細(xì)胞被殺死，這表明這些部分重編程的克隆的異質(zhì)性。為了確定建立完全重編程iPS克隆是否需要外源因子的持續(xù)表達(dá)，我們制備了 PB-TRE-0ct4-2A-cMyc-2A-Klf4-2A-Sox2(PB-TRE-0CKS)和PB-TRE-Rarg-2A-LrhI (PB-TRE-RL)構(gòu)建體，其中通過(guò)強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)了重編程因子的表達(dá)。將兩種PB轉(zhuǎn)座子構(gòu)建體，以及PB-CAG-rtTA載體和Pbase質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染到MEF中。轉(zhuǎn)染后6、8或10天，立即應(yīng)用DOX誘導(dǎo)，我們?cè)诘?0天應(yīng)用2 μ g/mL Puro選擇。在用DOX誘導(dǎo)僅6天的MEF中，獲得Pim)抗性集落(圖14D)，這表明這6種因子表達(dá)6天就足以將內(nèi)源0ct4基因座激活到高水平。相比之下，在僅用PB-TRE-0CKS和PB-CAG-rtTA轉(zhuǎn)染的MEF中，在相同的DOX誘導(dǎo)方案下，回收了非Puro抗性集落。因此，僅4種Yamanaka因子表達(dá)高達(dá)10天，不足以完全激活內(nèi)源0ct4基因座。為了進(jìn)一步證明內(nèi)源0ct4基因座的的快速激活，我們重復(fù)了 6因子Tet/On實(shí)驗(yàn)，但是僅在轉(zhuǎn)染后4天用DOX處理MEF。DOX除去后，立即應(yīng)用Puro選擇來(lái)選擇具有內(nèi)源0ct4激活的細(xì)胞。出現(xiàn)了幾個(gè)Puro抗性集落，當(dāng)擴(kuò)增時(shí)，其表現(xiàn)出優(yōu)異的ES細(xì)胞形態(tài)。這些結(jié)果清楚地表明，表達(dá)6種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致內(nèi)源0ct4基因座的快速激活，并且導(dǎo)致高質(zhì)量iPS細(xì)胞的產(chǎn)生。為了研究iPS細(xì)胞需要多少Rarg和Lrhl，我們將PB-CAG-OCKS以及攜帶由MSCV或CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Rarg-FL、Rarg-DN、Lrhl或Rarg_2A_Lrhl的PB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染到MEF中。
iPS質(zhì)量直接與所用的啟動(dòng)子相關(guān)是顯然的，這是因?yàn)镻B-MSCV-RL不顯著改善iPS質(zhì)量(Fig 14E)。單獨(dú)的Rarg或Lrhl，不管使用哪個(gè)啟動(dòng)子，都對(duì)iPS質(zhì)量無(wú)任何影響。然而，當(dāng)由MSCV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)，Rarg-DN能顯著改善iPS質(zhì)量。接下來(lái)我們制備了PB-CAG-0ct4-2A-cMyc-2A-Rarg-2A-Lrhl-Klf4-2A-Sox2 (PB-TRE-0CRLKS)，來(lái)由單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)所有6種轉(zhuǎn)錄因子。在相似的時(shí)間窗內(nèi)，這種構(gòu)建體從MEF產(chǎn)生相似數(shù)量的高質(zhì)量iPS細(xì)胞。因此我們將MCl-tk盒克隆到PB-CAG-0CRLKS中，從而形成PB-CAG-OCRLKS-MCl-tk轉(zhuǎn)座子。與利用PB-CAG-0CRLKS相似，許多iPS細(xì)胞集落在轉(zhuǎn)染到通常在第8天挑選的MEF中4-5天后是可見(jiàn)的。擴(kuò)增的iPS細(xì)胞對(duì)更昔洛韋(Ganc)敏感，這表明MCl-tk盒是功能性的。PB轉(zhuǎn)座子通過(guò)Pbase切自整合位點(diǎn)，并且在原處不留下足跡。因此我們通過(guò)用PL623轉(zhuǎn)染iPS細(xì)胞暫時(shí)表達(dá)Pbase，并且使所述細(xì)胞經(jīng)受Ganc選擇。通常，單次轉(zhuǎn)染通常獲得數(shù)百個(gè)Ganc抗性集落。這些Ganc抗性細(xì)胞的表征證實(shí)消除了這些細(xì)胞的PB轉(zhuǎn)座子，因此，這些細(xì)胞不含外源轉(zhuǎn)錄因子。6種因子所誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞是多能性的為了進(jìn)一步表征最初通過(guò)表達(dá)6種因子所產(chǎn)生的但是不含外源因子的iPS細(xì)胞，我們進(jìn)行RT-PCR來(lái)檢測(cè)這些細(xì)胞中多能基因的表達(dá)。iPS細(xì)胞以與親代0ct4-IRES-Puro-Egfp ES細(xì)胞表達(dá)水平相似的水平強(qiáng)烈表達(dá)小鼠ES細(xì)胞多能性標(biāo)志物(圖15A)。我們還檢測(cè)了關(guān)鍵多能性基因0ct4、Nanog以及Rexl的啟動(dòng)子中的DNA甲基化模式。如圖3C所示，啟動(dòng)子在這些細(xì)胞中完全脫甲基化。將6因子誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞皮下注射到129/C57B6雜種Fl小鼠中，來(lái)檢測(cè)它們的體內(nèi)分化潛力。所有小鼠在2周的時(shí)間內(nèi)發(fā)展了畸胎瘤，并且在一個(gè)月后處死小鼠，用于腫瘤取樣。在顯微鏡下，在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)了代表所有3個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型(圖15B)。此外，利用胚泡注射，很容易地獲得了高質(zhì)量嵌合體。當(dāng)將嵌合小鼠與白化病C57B6野生型小鼠回交時(shí)，鑒定了攜帶刺豚鼠毛色的種系傳遞幼鼠，這表明注射的iPS細(xì)胞的有效種系貢獻(xiàn)(圖3E)。利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量人類(lèi)iPS細(xì)胞通過(guò)有效誘導(dǎo)內(nèi)源0ct4表達(dá)快速重編程小鼠成纖維細(xì)胞，促使我們探討RARG和LRHl是否也能在人類(lèi)中改善重編程效率和質(zhì)量。通過(guò)比較人類(lèi)、小鼠和大鼠基因組序列，我們確定，RAR-SFl結(jié)合位點(diǎn)即RAREoct在所有3個(gè)物種中是高度保守的(圖5A)，這表明RARG-LRH1可能在人類(lèi)細(xì)胞中調(diào)節(jié)0ct4激活。我們構(gòu)建了攜帶6種人類(lèi)因子cDNA的PB-CAG轉(zhuǎn)座子。與使用小鼠cDNA相比，這些PB轉(zhuǎn)座子能由MEF快速產(chǎn)生高質(zhì)量小鼠iPS細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。接下來(lái)我們將含有6種人類(lèi)cDNA的I3B-CAG轉(zhuǎn)座子與PBase質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到人類(lèi)新生兒包皮真皮成纖維細(xì)胞(HDFn)中。然后將這些人類(lèi)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充了 bFGF的常規(guī)人類(lèi)ES培養(yǎng)基中或補(bǔ)充了人類(lèi)白血病抑制因子(hLIF)的常規(guī)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基(M15)中。我們?cè)谘a(bǔ)充了 bFGF的人類(lèi)ES培養(yǎng)基中鑒定了人類(lèi)ES細(xì)胞樣集落。令人驚訝的是，小鼠ES樣集落出現(xiàn)于添加了 hLIF的M15培養(yǎng)基(圖16A)中。因此，我們利用標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES方案處理了這些集落。通過(guò)胰蛋白酶處理，將人類(lèi)iPS集落解離成單細(xì)胞懸浮液，并再次接種到STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。能形成穩(wěn)定系的次級(jí)集落易于在M15+hLIF中從一半在第10天挑選的原代集落建立。在僅使用了 4種Yamanaka因子的對(duì)照組中，原代集落在形態(tài)上不同于用6種因子所產(chǎn)生的集落(圖16A)，我們從未能由在第10天挑選的集落建立穩(wěn)定的系。 ERK激酶和GSK3信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(2i)的抑制劑支持天然多能干細(xì)胞的體外生長(zhǎng)(40)，但是不引發(fā)如同EpiSC—樣的多能干細(xì)胞(57)。已經(jīng)成功地用2i培養(yǎng)基來(lái)從困難小鼠株系(40)和從大鼠胚泡(14，58)衍生ES細(xì)胞。因此我們測(cè)試了我們的人類(lèi)iPS細(xì)胞是否能存活于2i+hLIF培養(yǎng)基并且在2i+hLIF培養(yǎng)基中增殖。如圖16A所示，人類(lèi)iPS細(xì)胞在2i+hLIF培養(yǎng)基中增殖良好，并且能由STO飼養(yǎng)細(xì)胞上的單細(xì)胞形成ES樣集落。為了測(cè)定人類(lèi)iPS細(xì)胞的亞克隆效率，利用胰蛋白酶解離來(lái)自一個(gè)克隆的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將100或1000個(gè)細(xì)胞接種到M15+hLIF、20%KSR(敲除血清替代品)+hLIF或2i+hLIF培養(yǎng)條件。在這些條件下高達(dá)60%的細(xì)胞能再次形成集落(克隆效率)。盡管在2i+hLIF中所形成的集落通常更小，但是并未在這3種不同培養(yǎng)條件下的集落數(shù)量方面發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖16A)。我們挑選了次級(jí)集落，并在M15+hLIF或2i+hLIF中擴(kuò)增它們。擴(kuò)增的克隆生長(zhǎng)正常并且在兩種培養(yǎng)條件下保持未分化。當(dāng)解離并稀釋成單細(xì)胞密度時(shí)，它們能形成三代集落，這表明它們大量體外操作的強(qiáng)健性。我們的人類(lèi)iPS細(xì)胞在常規(guī)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基中健壯生長(zhǎng)，這一事實(shí)表明，人類(lèi)iPS細(xì)胞被與小鼠ES細(xì)胞中相同的核心分子調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)。即使在大量培養(yǎng)后，iPS細(xì)胞的基因組仍然保持完整，這可通過(guò)FISH分析確定(圖10E)。我們還通過(guò)檢查關(guān)鍵ES細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了人類(lèi)iPS細(xì)胞。如圖16B和16C所示，這些基因以高水平表達(dá)，并且DNA甲基化分析證實(shí)，關(guān)鍵的人類(lèi)多能性基因的啟動(dòng)子未甲基化。人類(lèi)iPS細(xì)胞的行為與小鼠ES細(xì)胞相似，并且因此對(duì)于人類(lèi)基因組的基因操作極具潛力。為了探討這種可能性，我們首先測(cè)試了將外源DNA引入這些細(xì)胞中的PB轉(zhuǎn)座。我們將PB-SB-PGK-Neo轉(zhuǎn)座子與Pbase質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染到人類(lèi)iPS細(xì)胞中(31)。由一次電穿孔，我們可以獲得約520，000個(gè)G418抗性集落，其由5%的幸存細(xì)胞組成。這種轉(zhuǎn)座效率與在小鼠ES細(xì)胞中觀察到的效率相當(dāng)(31)。我們隨后將PB-SB-SA-β geo捕獲轉(zhuǎn)座子和Pbase質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人類(lèi)iPS細(xì)胞中。SA-β geo盒允許在人類(lèi)iPS細(xì)胞中進(jìn)行基因捕獲，因此能在基因組的插入位點(diǎn)中斷基因表達(dá)。利用一次電穿孔，我們收獲了 9，OOO個(gè)G418抗性集落，其代表存活于電穿孔的O. 09%的細(xì)胞。我們的人類(lèi)iPS細(xì)胞系衍生于包皮成纖維細(xì)胞，因此都是雄性的。因?yàn)镠PRT活性的喪失能通過(guò)6TG抗性評(píng)分，我們因此研究了 HPRT基因座處PB-SB-SA-β geo轉(zhuǎn)座的突變效率。在9，000個(gè)G418抗性集落中，回收了 I個(gè)6-TG集落。討論有效激活內(nèi)源0ct4是體細(xì)胞重編程(3)和成功的核轉(zhuǎn)移(38)的最重要的已知條件之一。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，0ct4基因座逐步被幾層抑制沉默，其包括轉(zhuǎn)錄阻遏物的結(jié)合、組蛋白甲基化和脫甲基化以及DNA重新甲基化(47)。因此，將體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)需要除去這些0ct4表達(dá)抑制層中的每一個(gè)。已知2種Yamanaka因子即Klf4和cMyc除了其他功能外還參與染色質(zhì)改造(59)。以通過(guò)小分子抑制劑來(lái)進(jìn)行組蛋白去乙?；?、組蛋白甲基化或DNA甲基化為目標(biāo)的嘗試，也在一定程度上改善了重編程效率(51，35，13)。然而，并未研究如何促使轉(zhuǎn)錄阻抑物復(fù)合體如COUP-TF和GCNF與0ct4啟動(dòng)子分離并同時(shí)將轉(zhuǎn)錄激活劑結(jié)合于0ct4啟動(dòng)子。因此，利用目前的平臺(tái)的iPS細(xì)胞中0ct4表達(dá)并不能總是得到 適當(dāng)?shù)幕謴?fù)(60)。生物化學(xué)證據(jù)已經(jīng)表明，視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)0ct4啟動(dòng)子中的RA應(yīng)答元件(RARE)即RAREoct正調(diào)節(jié)0ct4表達(dá)(26)。RAR: RXR異源二聚體特異性結(jié)合RAREoct，并且在存在低濃度RA的情況下，部分負(fù)責(zé)激活0ct4轉(zhuǎn)錄(28)。在分化過(guò)程中，高濃度RA具有高得多的RAREoct親和性，其所誘導(dǎo)的孤兒受體ARP-1/C0UP-TFII和EAR-3/C0UP-TFI，從RAREoct取代RAR: RXR，并通過(guò)募集共阻遏物主動(dòng)沉默0ct4啟動(dòng)子(28)。RAR = RXR異源二聚體的過(guò)表達(dá)能克服COUP-TF對(duì)0ct4的抑制(28)。RAREoct含有與RAR識(shí)別位點(diǎn)重疊的SFl結(jié)合位點(diǎn)，這為RAR激活0ct4提供了另一機(jī)制。SFl和RAR可以形成特異性結(jié)合RAREoct的復(fù)合體并協(xié)同激活0ct4 (29)。有意思的是，RAR-SFl復(fù)合體的形成和其對(duì)0ct4的激活都不需要RA (29)。此外，已經(jīng)證明，SFl與COUP-TFI在幾個(gè)其他基因中競(jìng)爭(zhēng)相同的順式作用元件(61，62)。因此，RAR和SF1/LRH1復(fù)合體可能通過(guò)在結(jié)合RAREoct中拮抗COUP-TF而發(fā)揮0ct4表達(dá)的正調(diào)節(jié)劑的作用。綜合這些出版的生物化學(xué)數(shù)據(jù)和我們的觀察結(jié)果，我們提出了 Rarg和Lrhl在體細(xì)胞重編程中的工作模式。當(dāng)單獨(dú)表達(dá)Rarg時(shí)，因?yàn)長(zhǎng)rhl和Sfl通常不在MEF中表達(dá)，因此該機(jī)制主要募集RXR來(lái)結(jié)合RAREoct并激活內(nèi)源0ct4轉(zhuǎn)錄。然而，RAR: RXR異源二聚體與RAREoct相對(duì)低的結(jié)合親和性使得其難以與諸如COUP-TF和GCNF的阻遏物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。因此，0ct4要么并未完全被激活，要么激活并非是穩(wěn)定的。這解釋了 Rarg過(guò)表達(dá)增強(qiáng)重編程效率，但是并未改善iPS細(xì)胞質(zhì)量。共表達(dá)Rarg和Lrhl允許Rarg-Lrhl復(fù)合體解除阻遏物結(jié)合RAREoct并有效激活0ct4轉(zhuǎn)錄。隨后已知與RAR相互作用的共激活劑，如CBP/p300、P/CAF以及SRC1/TIF2(36)被募集到0ct4基因座，來(lái)促進(jìn)染色質(zhì)進(jìn)一步重塑。因此，Rarg-Lrhl復(fù)合體穩(wěn)定地占據(jù)0ct4啟動(dòng)子中的關(guān)鍵元件不僅上調(diào)內(nèi)源0ct4的轉(zhuǎn)錄水平,還促進(jìn)0ct4啟動(dòng)子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑。因此，體細(xì)胞重編程中最關(guān)鍵的障礙即內(nèi)源0ct4激活(47)，在重編程的早期階段得到克服，這顯著地加速了重編程過(guò)程并改善iPS細(xì)胞質(zhì)量。小鼠ES細(xì)胞系由預(yù)移植胚泡的內(nèi)細(xì)胞群(ICM)建立，并能對(duì)成體小鼠組織的所有譜系做貢獻(xiàn)。另一方面，小鼠EpiSC分離自移植后胚胎，即使當(dāng)將它們注射到免疫缺陷小鼠中時(shí)能產(chǎn)生畸胎瘤，它們也不能定殖胚泡的ICM。EpiSC可能代表不同的多能細(xì)胞類(lèi)型，其存在于小鼠胚胎發(fā)生的不同階段、位于不同的微環(huán)境中，并且因此響應(yīng)來(lái)自ES細(xì)胞的不同外來(lái)信號(hào)出3)。因?yàn)樾∈驟piSC是利用人ES細(xì)胞培養(yǎng)基衍生，現(xiàn)有的人類(lèi)ES和iPS細(xì)胞系可能代表干細(xì)胞層級(jí)更低級(jí)的另一引發(fā)的多能狀態(tài)出3)。引人注目的是，本文所報(bào)道的人類(lèi)iPS細(xì)胞系在小鼠ES培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)強(qiáng)健并且行為與小鼠ES細(xì)胞相似，這表示小鼠和人類(lèi)中天然多能干細(xì)胞的共同調(diào)節(jié)。綜述，我們?cè)诖藞?bào)道了在激活0ct4基因座中Rarg和Lrhl的協(xié)同相互作用導(dǎo)致小鼠和人類(lèi)體細(xì)胞的快速和有效重編程。所產(chǎn)生的小鼠和人類(lèi)iPS細(xì)胞質(zhì)量卓越，同時(shí)人類(lèi)iPS細(xì)胞與常規(guī)小鼠ES細(xì)胞高度相似，但是不同于現(xiàn)有人類(lèi)ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞。這些人類(lèi)iPS細(xì)胞生長(zhǎng)強(qiáng)健，擴(kuò)增這些細(xì)胞和對(duì)其進(jìn)行基因操作，會(huì)使得它們對(duì)于探討基因座功能和產(chǎn)生患者特異性、無(wú)突變且無(wú)外源因子的人類(lèi)iPS細(xì)胞而言有吸引力。材料和方法質(zhì)粒載體構(gòu)建
為了制備 PB-TRE、PB-MSCV 和 PB-CAG 載體，由 pTight (Clontech)擴(kuò)增 Tet 應(yīng)答元件(TRE)，由 pMSCV-Neo (Clontech)擴(kuò)增 MSCV LTR，并由 pBluescript-CAG 載體擴(kuò)增 CAGG啟動(dòng)子(未發(fā)表的數(shù)據(jù))并將其克隆到PB-bpA載體中(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Addgene)擴(kuò)增4種小鼠和人類(lèi)Yamanaka因子,并將其分別克隆到PB-TRE、PB-MSCV以及PB-CAG轉(zhuǎn)座子載體中。由IMAGE克隆(Geneservice)擴(kuò)增小鼠和人類(lèi)Rarg、Lrhl以及Sf I，并將其克隆到轉(zhuǎn)座子載體中。MEF 制備將12. 5d. p. c. 0ct4-IRES-Puro_Egfp胚胎斷頭、去內(nèi)臟、用O. 25%胰蛋白酶解離并接種于MlO (敲除DMEM，10%胎牛血清(FBS)、青霉素鏈霉素和以及glutamax和非必須氨基酸(NEAA))中。HEFn購(gòu)自Invitrogen并維持在補(bǔ)充了低血清補(bǔ)充物的Media106 (Invitrogen)中。轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)電穿孔后，將MEF接種于STO飼養(yǎng)板中的添加了小鼠LIF的Ml5 (敲除DMEM、15%FBS、青霉素-鏈霉素、glutamax、β-巰基乙醇(β ME)、ΝΕΑΑ)中。轉(zhuǎn)染后24h添加含有強(qiáng)力霉素(lug/mL)的M15，并每日更換。在第10日以96孔模式挑選iPS集落，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行維持。以相似的方式進(jìn)行HDFn轉(zhuǎn)染，除了將成纖維細(xì)胞接種于添加了人類(lèi)的M15中。轉(zhuǎn)染后24h添加含有強(qiáng)力霉素(2 μ g/mL)的M15，并在第10天以24孔模式挑選集落。擴(kuò)增產(chǎn)生次級(jí)集落的克隆，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行維持。Splinkerette PCR如所述，進(jìn)行確定PB基因組整合位點(diǎn)的Splinkerette PCR。用M13正向和反向引物對(duì)TA克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。利用BLAST，確定PB插入基因座。利用所述引物，對(duì)除去因子的PBiPS系的基因組進(jìn)行PCR。RT-PCRRNA利用Reasy微型試劑盒(Qiagen)來(lái)分離、定量，并用gDNAWipeOut處理，用QuantiTect反向轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)制備cDNA。對(duì)于每一 RT-PCR反應(yīng)，我們利用50 - IOOng 所列的 cDNA 和引物。標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 條件為94° C 30s、58_62。C 30s,72° C15 - 30s ；X 30 - 35 循環(huán)。免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)使細(xì)胞生長(zhǎng)于12飼養(yǎng)板。用PBS洗滌細(xì)胞、于25° C在4%PFA/PBS中固定lOmin、用O. 3%Triton X-IOO在PBS中于25。C滲透IOmin并在5%驢血清中封閉lh，并于4° C添加一抗過(guò)夜。在PBS中洗滌樣品，并于25° C添加二抗lh(cy3IgG，l:l，000;Alexa488IgGor IgM, 1:400;Alexa594IgG, 1:200)。體外分化測(cè)定解離人類(lèi)PB-iPS系，并用于通過(guò)在AggreWell 400平板(StemCellTechnologies)中的無(wú)hLIF的M15中聚集產(chǎn)生擬胚體。生長(zhǎng)14天后，將擬胚體接種 于Matrigel包被的蓋玻片或4室載玻片上。在再培養(yǎng)10天后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)。畸胎瘤形成將細(xì)胞系懸浮于含有10%FBS的DMEM中，并將100ml (IXlO6個(gè)細(xì)胞)皮下注射到用異氟烷麻醉的裸鼠(CByJ. Cg-Foxnlnu/J)兩側(cè)背側(cè)面。注射6周后，將畸胎瘤解剖、在10%的磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定過(guò)夜并包埋在石蠟中。切片用蘇木精和曙紅染色。圖例圖I.重編程中的RA信號(hào)傳導(dǎo)。A.通過(guò)piggyBac (PB)轉(zhuǎn)座進(jìn)行重編程的策略的示意圖。用PB-MSCV-cDNA轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染0ct4報(bào)道MEFt，并將其直接接種于STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。通常在3周內(nèi)出現(xiàn)ES樣集落。MlO和M15分別是MEF和ES細(xì)胞的培養(yǎng)基。B-C.表達(dá)Rara或Rarg以及4種Yamanaka因子顯著促進(jìn)重編程，同時(shí)通過(guò)表達(dá)Rara-DN抑制RA信號(hào)傳導(dǎo)阻斷重編程。iPSC通過(guò)堿性磷酸酶染色觀察集落。重編程對(duì)照為 PB-PGK-Neo 加 Yamanaka 因子。** P<0. 005 ；*** P<0. 0005。FL :全長(zhǎng) cDNA ；DN :顯性失活形式。D.在重編程中短暫需要RA信號(hào)傳導(dǎo)。在重編程的各種階段添加Rarg的激動(dòng)劑(⑶437)。第1-4天轉(zhuǎn)染后從第I天到第4天添加激動(dòng)劑。DMSO為⑶437的溶劑，將其添加于對(duì)照平板中。E-F.多能性基因的表達(dá)(E)和重編程細(xì)胞中Nanog和Rexl基因座處的DNA甲基化(F)。僅對(duì)2. O μ g/ml Puro選擇具有抗性的細(xì)胞是完全重編程的iPSC，而僅對(duì)I. O μ g/ml Puro具有抗性的細(xì)胞是部分重編程的。ES 0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細(xì)胞；MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp 報(bào)道 MEF 細(xì)胞。G.通過(guò) Rarg 激動(dòng)劑 CD437 改善 iPSC 質(zhì)量。利用流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)0ct4基因座表達(dá)GFP分析iPSC (第1-4天的⑶437)的質(zhì)量。 在圖I (D)的柱狀圖中，第一長(zhǎng)方塊表示第1-4天，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示第1-8天，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示第I - 12天，第4個(gè)長(zhǎng)方塊表示第4-8天且第5個(gè)長(zhǎng)方塊表示第4-12天。圖2. Rarg(R)和Lrh-1 (L)協(xié)同促進(jìn)重編程。A. Tet-Οη重編程策略的不意圖。用PB-TRE-cDNA轉(zhuǎn)座子、PB-CAG-rtTA以及PB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MEF，立即將其接種于STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，添加Dox (I. O μ g/ml)。轉(zhuǎn)染后4、6、8以及10天，從培養(yǎng)基中除去Dox，同時(shí)立即應(yīng)用嘌呤霉素選擇(2. O μ g/ml)來(lái)選擇0ct4基因座完全激活的細(xì)胞。嘌呤霉素在24小時(shí)內(nèi)殺死MEF和ES細(xì)胞。B. 6種因子(TRE-0CKS和TRE-RL)表達(dá)4天足以完全激活內(nèi)源0ct4表達(dá),用于獲得不依賴Dox的iPSC。相比之下,4種Yamanaka因子(TRE-OCKS)直到表達(dá)至少12天，才出現(xiàn)PurcZiPSC集落。C.轉(zhuǎn)染后6天的集落的圖像。比例尺10. O μ m。D.共表達(dá)Rarg和Lrh-I (RL)而不是單獨(dú)表達(dá)Rarg或Lrh-I改善了 iPSC質(zhì)量。在轉(zhuǎn)染后第10天，挑選單個(gè)iPSC集落，并使其生長(zhǎng)于96孔板中，用于在流式細(xì)胞術(shù)中表達(dá)GFP。_:ρ〈0.0005。E.在熒光素酶報(bào)道基因測(cè)定中Rarg和Lrh-I的協(xié)同相互作用激活0ct4啟動(dòng)子。將連接于0ct4啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)染到MEF中。48小時(shí)后測(cè)量熒光素酶活性。針對(duì)在轉(zhuǎn)染中使用PB-Neo質(zhì)粒的陰性對(duì)照，使熒光素酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。誤差條(bar)為平均值土 SD。圖3.不依賴Dox的小鼠iPSC的表征。A_B.多能性基因在小鼠iPSC中的強(qiáng)健表達(dá)。A.檢測(cè)0ct4和Nanog的iPS20_Al細(xì)胞的免疫染色。B.小鼠iPSC、親代MEF和野生型ES細(xì)胞中的0ct4、Nanog和Rexl的qRT-PCR。表達(dá)相對(duì)于Gapdh,并且針對(duì)親代0ct4報(bào)道小鼠ES細(xì)胞中的基因表達(dá)而標(biāo)準(zhǔn)化。Dox誘導(dǎo)6種因子(0CKS+RL)4天(Al)、6天(BI)或8天(Cl)產(chǎn)生所示的iPSC系。MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp報(bào)道MEF細(xì)胞；ES細(xì)胞0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入 ES 細(xì)胞。C. iPSC (iPS20_Al)中 0ct4 和 Nanog 的啟動(dòng)子激活完全脫甲基化。D.衍生自iPSC的畸胎瘤含有所有3個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型。圖版表示軟骨細(xì)胞(上部左側(cè))、角質(zhì)細(xì)胞(上部右側(cè))、腸樣上皮細(xì)胞(底部左側(cè))以及神經(jīng)細(xì)胞(底部右側(cè))。所有的照片均在相同的放大率下拍攝(x200)。E. iPSC對(duì)嵌合體中種系的貢獻(xiàn)。使嵌合體與野生型野生型C57BL6雌性(白化病者)雜交。種系傳遞幼鼠為刺鼠。 在圖3 (B)中的每一柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表不mESC,第二個(gè)長(zhǎng)方塊表不MiPS20-Al，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示MiPS20-B2，以及第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示MiPS20_Cl。Fig 4.在無(wú)血清、無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，將MEF重編程為基態(tài)iPSC。A.用PB-TRE-OCKS(4F)或PB-TRE-OCKS加PB-TRE-RU6F)重編程的AP+集落的數(shù)量。將轉(zhuǎn)染后的MEF接種于明膠化的6孔板(2xl05個(gè)/孔)的M15/LIF/Dox中，達(dá)I天，轉(zhuǎn)到N2B27/LIF/Dox中高達(dá)17天。B.利用qRT-PCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析。表達(dá)相對(duì)于Gapdh，并且針對(duì)野生型ES細(xì)胞而標(biāo)準(zhǔn)化。誤差條表示平均值土SD。C.用于Nanog和SSEA-I表達(dá)的iPSC(6F)的免疫染色。D. iPS(^6F)向代表3個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型的體外分化，這可以通過(guò)免疫染色來(lái)檢測(cè)?？贵wTuj、神經(jīng)元特異性III型微管蛋白；SMA，平滑肌α-肌動(dòng)蛋白；AFP，α-胎蛋白。在圖4(B)中的每一柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表不ES,第二個(gè)長(zhǎng)方塊表不4FiPS,第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示6F-iPS，且第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示MEF。圖5.不依賴Dox的獨(dú)特的人類(lèi)iPSC的產(chǎn)生和表征。A. RAREoct序列在幾種哺乳動(dòng)物中的保守性。B.利用Tet-0n6因子平臺(tái)重編程HDFn細(xì)胞。將PB_TRE_cDNA轉(zhuǎn)座子、PB-CAG-rtTA和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HDF中，將HDF接種于STO飼養(yǎng)細(xì)胞上。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，添加Dox (2. O μ g/ml)。Dox誘導(dǎo)通常持續(xù)15_20天。在轉(zhuǎn)染后高達(dá)30天,挑選集落用于擴(kuò)增?；蛘?，一旦除去Dox，立即將集落用胰蛋白酶進(jìn)行處理，并再次接種至新的飼養(yǎng)板，用于次級(jí)集落的形成。C.典型的人類(lèi)iPSC集落形態(tài)和AP染色。比例尺10.0μπι。D.親代HDFn、人類(lèi)iPSC以及HlhESC細(xì)胞中的多能性基因的qRT-PCR分析。HiPS15_5和-10是由一次轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的不依賴Dox的iPSC系。E.針對(duì)ES細(xì)胞表面標(biāo)志物和多能性因子的人類(lèi)iPSC的免疫染色。F.人類(lèi)iPSC的體外分化。抗體Tuj、神經(jīng)元特異性III型β -微管蛋白；SMA，平滑肌α -肌動(dòng)蛋白；AFP，α -胎蛋白。G.由人類(lèi)iPSC分化的畸胎瘤。左側(cè)圖版軟骨(中胚層)；中部圖版神經(jīng)組織(外胚層)；有纖毛的腺上皮(內(nèi)胚層)。所有照片均在相同的放大率下拍攝(x200)。H.通過(guò)基因表達(dá)(qRT-PCR)所測(cè)量的人類(lèi)iPSC的信號(hào)傳導(dǎo)依賴性。在存在FGF受體抑制劑(FGFRi)但是沒(méi)有添加JAK抑制劑(JAKi)的情況下，多能性基因的強(qiáng)健表達(dá)。用生長(zhǎng)于KSR-FGF2(bFGF)或KSR_2i_LIF培養(yǎng)基(2i/LIF)中的HlhESC細(xì)胞作為對(duì)照。I.生長(zhǎng)于不同條件下的人類(lèi)iPSC的基因表達(dá)變化。如果再次培養(yǎng)于2i/LIF培養(yǎng)基中，則適應(yīng)FGF的iPSC快速分化。這些細(xì)胞喪失0CT4和NANOG的表達(dá)，伴隨S0X17和SOXl的表達(dá)。相對(duì)于GADPH進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析。用生長(zhǎng)于FGF2中的HlhESC細(xì)胞的表達(dá)作為對(duì)照。誤差條為平均值土SD。在圖5(D)中的前3個(gè)柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表不HihESC,第二個(gè)長(zhǎng)方塊表不HiPS15-5，且第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10。在圖5(D)中第4個(gè)柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示HDFn，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示HihESC，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15_5，且第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10。在圖5(H)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示HlhESC細(xì)胞中的FGF2，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10中的2i/LIF，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15_10細(xì)胞中的2i/LIF至FGF2，第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15_10細(xì)胞中的FGF2至2i/LIF。在圖5(1)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示HlhESC細(xì)胞中的 FGF2，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示HlhESC細(xì)胞中的2i/LIF，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15_10中的2i/LIF，第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10細(xì)胞中的2i/LIF/BMP4，第五個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10細(xì)胞中的2i/LIF/JAKi，以及第六個(gè)長(zhǎng)方塊表示HiPS15-10細(xì)胞中的2i/LIF/FGFRi。圖6. A.攜帶轉(zhuǎn)錄因子cDNA的PB轉(zhuǎn)座子。PB piggyBac轉(zhuǎn)座子；TR PB的末端重復(fù)；MSCV :小鼠干細(xì)胞病毒的LTR ；CAG CAG啟動(dòng)子；TRE :四環(huán)素應(yīng)答元件；pA :聚腺苷酸化信號(hào)傳導(dǎo)序列。B. The 0ct4-IRES-Puro_Egfp敲入等位基因。將IRES-Puro-Egfp盒革巴向0ct4基因座的3’ UTR來(lái)監(jiān)測(cè)并選擇該基因座的激活。C. 0ct4-IRES-Puro-Egfp MEF細(xì)胞0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。在分析中僅靶向的ES細(xì)胞是綠色的。D.在轉(zhuǎn)染中攜帶Rarg的轉(zhuǎn)座子DNA量的增加降低OCKS的重編程效率。對(duì)照無(wú)任何PB-MSCV-Rarg的單獨(dú)的OCKS。E.存活于兩種嘌呤霉素濃度的重編程小鼠細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。大多數(shù)I. O μ g/ml Puror集落不表達(dá)GFP。另一方面，存活于2. O μ g/ml嘌呤霉素選擇的重編程細(xì)胞都是GFP+。利用生長(zhǎng)于96孔板的細(xì)胞直接進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。圖7. Rarg和Lrh-I協(xié)調(diào)促進(jìn)重編程。A. PB轉(zhuǎn)座子攜帶多個(gè)被編碼2A的DNA鏈接的cDNA，2A即口蹄疫病毒2A自切割肽。CAG :CAG啟動(dòng)子；pA :聚腺苷酸化信號(hào)傳導(dǎo)序列；rtTA:反向四環(huán)素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活劑(rtTA) ;TRE :四環(huán)素應(yīng)答元件。B.利用單獨(dú)的PB-CAG-0CKS (上部的2幅)或與PB-CAG-RL —起(底部的2幅)重編程的典型iPSC集落。轉(zhuǎn)染后10天采集圖像。C.轉(zhuǎn)染后10天的iPSC集落的堿性磷酸酶染色。6種因子(CAG-0CKS和CAG-RL)比僅利用4種Yamanaka因子(CAG-OCKS)多產(chǎn)生高達(dá)20多倍的集落(右幅)。D.用于熒光素酶報(bào)道基因的DNA構(gòu)建體的圖。460-bp的0ct4啟動(dòng)子DNA片段位于RAREoct位點(diǎn)的側(cè)翼，將其克隆于luc2編碼序列之前。圖8.小鼠iPSC多能性的表征。A.檢測(cè)SSEAl和Nanog的iPS20_Al細(xì)胞的免疫染色。B.內(nèi)源多能性基因在小鼠iPSC中的強(qiáng)健表達(dá)。用α-肌動(dòng)蛋白作為PCR對(duì)照，利用RT-PCR檢測(cè)表達(dá)。iPS20-Al、Bl以及Cl是DOX誘導(dǎo)6種因子(0CKS+RL)4天(Al)、6 天(BI)或 8 天(Cl)所產(chǎn)生的 3 種 iPS 細(xì)胞系。MEF 0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入MEF;ES :0ct4-IRES-Puro-Egfp敲入ES細(xì)胞。C.外源重編程因子在小鼠iPSC系中的表達(dá)的RT-PCR分析。對(duì)照在誘導(dǎo)外源因子表達(dá)的DOX存在的情況下生長(zhǎng)的小鼠iPSC ；ES,親代 0ct4-IRES-Puro-Egfp 敲入 ES 細(xì)胞。0ct4_cMyc-外源的、cMyc_Klf4_ 外源的、Klf4-Sox2-外源的，是檢測(cè)PB-TRE-OCKS構(gòu)建體中cDNA中連接片段的3個(gè)引物對(duì)。Rarg-Lrh-I-外源的是檢測(cè)PB-TRE-RL構(gòu)建體的側(cè)翼序列的引物對(duì)。在大多數(shù)iPSC系中，外源因子的表達(dá)是不可檢測(cè)的。圖9. MEF在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清的條件下的重編程。A. MEFh用PB-TRE-OCKS (4_因子)或PB-TRE-OCKS加PB-CAG-RL (6-因子)轉(zhuǎn)染，并接種于N2B27加具有DOX的LIF的培養(yǎng)基中，達(dá)所示天數(shù)。一旦挑選集落就將它們培養(yǎng)于2i/LIF培養(yǎng)基中。通過(guò)表達(dá)4因子同時(shí)用DOX處理8天，沒(méi)有獲得集落。在另一實(shí)驗(yàn)中，用2i/LIF培養(yǎng)基直接培養(yǎng)新鮮轉(zhuǎn)染的MEF0添加Dox高達(dá)17天，以便通過(guò)表達(dá)OCKS出現(xiàn)任何集落。然而，僅當(dāng)使用6種外源因子時(shí)獲得集落。B.蘇木色素和曙紅染色的畸胎瘤石蠟切片含有所有3個(gè)胚層的衍生物。上皮分化(伴隨角蛋白Perl的形成)和神經(jīng)分化(伴隨花飾狀物和神經(jīng)管的形成)顯示于上排圖中。內(nèi)胚層衍生物(箭頭所示)以沿杯狀細(xì)胞、腸上皮樣細(xì)胞以及潘氏細(xì)胞排列的 顆粒狀結(jié)構(gòu)表示。內(nèi)胚層衍生物由軟骨、免疫脂肪組織和肌肉組成。所有照片均在相同的放大率下拍攝(200x)。圖10.用6因子平臺(tái)(CAG啟動(dòng)子版本)產(chǎn)生獨(dú)特的人類(lèi)iPSC細(xì)胞。A.在M15加LIF培養(yǎng)基或在2i/LIF培養(yǎng)基中形成的人類(lèi)iPSC集落，其與常規(guī)小鼠ES細(xì)胞集落相似。上部左幅用4種Yamanaka因子重編程的典型集落；上部右幅利用6種因子重編程的iPSC集落。在轉(zhuǎn)染后10天采集圖像。底部左幅將原代iPSC集落之后的次級(jí)集落解離并再接種于飼養(yǎng)細(xì)胞上；底部右幅以單細(xì)胞密度亞克隆后的典型人類(lèi)iPSC集落。B.免疫染色所檢測(cè)的內(nèi)源多能性蛋白質(zhì)在人類(lèi)iPSC中的表達(dá)。C. RT-PCR所檢測(cè)的多能性基因在人類(lèi)iPSC中的表達(dá)。HiPSl-3和4、HiPS6-4和16是4種獨(dú)立的iPSC系。HDF :人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞；hESC:人類(lèi)ES細(xì)胞。D.在畸胎瘤中人類(lèi)iPSC向3個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型的分化。上部左幅具有偶然的花飾品狀物(箭頭)的神經(jīng)組織；上部右幅纖維肌性纖維(箭頭)；底部左幅寬松的間質(zhì)(箭頭)；底部右幅有纖毛的顆粒狀上皮(箭頭)。所有照片均以相同的放大率拍攝(x200)。E.大量傳代(>20代)后人類(lèi)iPSC的正常核型。上部圖DAPI ;底部圖MFISH。F.人類(lèi)iPSC的Y染色體基因分型證實(shí)了人類(lèi)iPSC的HDFn來(lái)源。用16種人類(lèi)Y染色體標(biāo)志物進(jìn)行基因分型。圖11.利用6因子Tet-On系統(tǒng)(不依賴Dox)所產(chǎn)生的獨(dú)特的人類(lèi)iPSC的表征。A.用人類(lèi)GADPH作為對(duì)照，人類(lèi)iPSC中基因表達(dá)的RT-PCR分析。HDF :人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞；hESC H1 人類(lèi) ES 細(xì)胞。B.人類(lèi) iPSC 的 SSEA-4、Tra-1-60 以及 Tra_l_81 表達(dá)的 FACS分析。左幅HDF對(duì)照，其不表達(dá)SSEA-4、TRA-l-60或TRA-1-81。C.人類(lèi)iPSC中外源因子表達(dá)的RT-PCR分析。對(duì)照生長(zhǎng)于誘導(dǎo)外源因子表達(dá)的DOX中的iPSC ；hESC H1人類(lèi)ES細(xì)胞。PCR擴(kuò)增后，2種系不具有明顯的外源0CT4、S0X2和MYC、KLF4表達(dá)。D.在大量的體外培養(yǎng)(>20代)后，人類(lèi)iPSC具有正常的核型。上部圖DAPI ;底部圖MFISH。E.將基因捕獲PB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子插入HPRT基因座，破壞了人類(lèi)iPSC中的HPRT活性。在HPRT基因座的內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了基因捕獲PB轉(zhuǎn)座子整合。底部圖PB轉(zhuǎn)座子和HPRT基因座DNA連接的序列。圖12. Rarg顯性失活等位基因阻斷ES細(xì)胞分化A.攜帶強(qiáng)CAG啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和一對(duì)剪接受體的PB轉(zhuǎn)座子的示意圖。
B. Rexl-Puro-IRES-Egfp 敲入小鼠 ES 細(xì)胞系的圖。C.小鼠ES細(xì)胞基因篩選的策略，來(lái)鑒定能夠阻斷視黃酸所誘導(dǎo)的ES細(xì)胞分化的突變體。D.基因篩選中所鑒定的Rarg基因座處的4個(gè)獨(dú)立的突變。E. RA誘導(dǎo)Rarg或Rara顯性形式的過(guò)表達(dá)所阻斷的ES細(xì)胞分化。F. RA誘導(dǎo)Rarg或Rara特異性拮抗劑所阻斷的ES細(xì)胞分化。在圖12(E)中每一柱狀圖中，如果存在，則第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示PB-MSCV-Rara-DN，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示PB-MSCV-Rarg-DN，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示PB-PGK-Neo，第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示PB-MSCV-Rara-FL，以及第五個(gè)長(zhǎng)方塊表示 PB-MSCV-Rarg-FL。在圖12(F)中的每一柱狀圖中，如果存在，則第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示單獨(dú)的RA，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示RA+Ro-41-5253以及第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示RA+CD2665。圖13. RA信號(hào)傳導(dǎo)在將小鼠MEF重編程為iPS細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。A. iPS細(xì)胞的較高質(zhì)量與存活于更高濃度的嘌呤霉素相關(guān)。B.過(guò)表達(dá)Rarg-FL顯著增加重編程效率。C. iPS細(xì)胞培養(yǎng)板顯示Rarg增強(qiáng)重編程效率。細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。D. Rarg-DN的過(guò)表達(dá)也改善iPS克隆的質(zhì)量但是降低重編程效率。E. Rarg的劑量影響重編程效率。F. Rarg或Rara特異性激動(dòng)劑增強(qiáng)重編程效率。G. Rarg特異性激動(dòng)劑改善iPS細(xì)胞的質(zhì)量。在圖13(F)的柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示第1-4天，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示第1_8天，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示第1-12天，第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示第4-8天，第五個(gè)長(zhǎng)方塊表示第4-12天，以及第六個(gè)長(zhǎng)方塊表示第8-12天。圖14. Rarg和Lrhl協(xié)同作用促進(jìn)重編程A. Rarg特異性拮抗劑處理能改善部分重編程的iPS克隆的質(zhì)量。B. Lrhl的過(guò)表達(dá)促進(jìn)重編程。C. Puro抗性iPS細(xì)胞集落非常早的出現(xiàn)顯示通過(guò)6種因子的MEF快速重編程。D.快速實(shí)現(xiàn)完全的重編程多能性需要Rarg和Lrhl的表達(dá)。E. Rarg和Lrhl表達(dá)的劑量對(duì)于iPS細(xì)胞很關(guān)鍵。在圖14(A)的柱狀圖中，在圖13(F)的柱狀圖中，第一個(gè)長(zhǎng)方塊表示第I天，第二個(gè)長(zhǎng)方塊表示第2天，第三個(gè)長(zhǎng)方塊表示第3天，以及第四個(gè)長(zhǎng)方塊表示第4天。圖15. 6種因子重編程的iPS細(xì)胞的高質(zhì)量A.利用Rarg和Lrhl所產(chǎn)生的小鼠iPS細(xì)胞具有ES細(xì)胞多能性標(biāo)志物的強(qiáng)健表達(dá)。B. 6因子所誘導(dǎo)的小鼠iPS細(xì)胞能對(duì)畸胎瘤中的所有譜系有貢獻(xiàn)。圖16.利用6種因子產(chǎn)生高質(zhì)量人類(lèi)iPS細(xì)胞A.在M15加hLIF培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的人類(lèi)iPS細(xì)胞集落(上部圖)。在2i加hLIF培養(yǎng)條件下擴(kuò)增的人類(lèi)iPS細(xì)胞集落(底部圖)。B.人類(lèi)iPS細(xì)胞表達(dá)高水平的0CT4和NANOG。C. RT-PCR分析證實(shí)了人類(lèi)iPS細(xì)胞種多能性基因的高水平表達(dá)。4_1、4_2、4_3以及4-5是人類(lèi)iPS細(xì)胞。ES :人類(lèi)ES細(xì)胞對(duì)照。參考文獻(xiàn)I. K. Takahashij S. Yamanakaj Cel1126，663 (Aug 25，2006).2. K. Okitaj T. Ichisakaj S. Yamanakaj Nature448，313 (Jul 19，2007) ·3. M. Wernig et al·，Nature 448, 318 (Jul 19, 2007).4. J. Hanna et al.，Cel1133，250 (Apr 18,2008).5. T. Aoi et al.，Science 321，699 (Aug I, 2008).6. M. Wernig et al. , Nat Biotechnol26，916 (Aug，2008) ·
7. K. Takahashi et al.，Celll31，861 (Nov 30, 2007).8. I. H. Park et al. , Nature 451，141 (Jan 10, 2008).9. J. Yu et al.，Science 318，1917 (Dec 21, 2007).10. J. C. Heng et al. , Cell stem cell6，167 (Feb 5) ·11. J. Silva et al. , PLoS biology 6，e253(0ct 21,2008).12. D. Huangfu et al. , Nat Biotechnol26，795 (Jul，2008) ·13. Y. Shi et al. ,Cell Stem Cell2，525 (Jun 5, 2008).14. J. K. Ichida et al. , Cell stem cell5, 491 (Nov 6,2009).15. A. Marson et al. , Cell stem cell3，132 (Aug 7, 2008).16. H. Hong et al. , Nature 460，1132 (Aug 27, 2009).17. J. Hanna et al.，Nature462，595 (Dec 3, 2009).18. J. Han et al. , Nature 463，1096 (Feb 25, 2010).19. M. J. Boland et al. , Nature 461，91 (Sep 3, 2009).20. L. Kang, J. Wang, Y. Zhang, Z. Kouj S. Gaoj Cell stem cel 15，135 (Aug 7, 2009).21. M. Stadtfeld et al. , Nature 465，175 (May 13).22. A. Meissnerj M. Wernigj R. Jaenisch，Nat Biotechnol25，1177 (Oct, 2007).23. M. Nakagawa et al.，Nature biotechnology26, 101 (Jan, 2008).24. J. Yuj J. A. Thomson, Genes & development 22，1987 (Aug 1，2008).25. K. Niederreitherj P. Dollej Nature reviews 9, 541 (Jul, 2008).26. E. Pikarskyj H. Sharirj E. Ben-Shushanj Y. Bergman, Mo I CellBioll4，1026 (Feb, 1994).27. I. Sylvester, H. R. Scholerj Nucleic Acids Res 22，901 (Mar 25,1994).28. E. Ben-Shushanj H. Sharir，E. Pikarsky，Y. Bergman, Mo I CellBioll5，1034 (Feb, 1995).29. E. Barneaj Y. Bergman, J Biol Chem275，6608 (Mar 3，2000).30. M. Wernigj A. Meissnerj J. P. Cassadyj R. Jaenischj Cell stem cell2，10 (Jan10，2008).31. W. Wang et al. ,Proc Natl Acad Sci USA105，9290 (Jul 8, 2008).32. H. Niwaj J. Miyazaki, A. G. Smith, Nat Genet24，372 (Apr, 2000) ·33. S. Tsai et al·，Genes & development 6，2258 (Dec，1992) ·34. M. Gianni, S. Zanottaj M. Teraoj S. Garattinij E. Garattinij Biochemical andbiophysical research communicationsl96, 252(Oct 15,1993).35. P. Gu et al.，Mol Cell Biol25, 3492 (May, 2005).36. M. Stadtfeldj N. Maherali, D. T. Breaultj K. Hochedlinger，Cell stemcell2，230(Mar6, 2008).37. T. Brambrink et al. , Cell stem cell2，151 (Feb 7,2008).38. M. Boianij S. Eckardtj H. R. Scholerj K. J. McLaughlin, Genes & development16，1209 (May 15，2002).39. Q. L Yingj J. Nichols, I. Chambers, A. Smith, Cell 115，281 (Oct 31，2003) ·40. Q. L Ying et al. , Nature 453，519 (May 22, 2008). 41. M. Buehr et al.，Celll35，1287 (Dec 26, 2008).42. H. M. Yang et al. , J Cell Biochem 101，1198 (Aug I, 2007).43. F. Ishikawa et al·，Blood 106，1565 (Sep I, 2005).44. J. A. Thomson et al.，Science (New York, N. Y 282，1145 (Nov 6, 1998).45. M. Amit et al. , Dev Biol 227，271 (Nov 15, 2000).46. T. Perlmannj R. M. Evans, Cell90，391 (Aug 8，1997) ·47. K. Hochedlingerj K. Plathj Development 136，509 (Feb, 2009).48. http://biogps. gnf. org/.49. J. Hanna et al., Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America, (May 4,2010).50. C. Buecker et al. , Cell stem cell6，535 (June 4，2010，2010) ·51. T. S. Mikkelsen et al. , Nature 454，49 (Jul 3, 2008).52. A. Meissnerj M. Wernigj R. Jaenisch，Nat Biotechnol25，1177 (Oct, 2007).53. M. J. Evans, Μ. H. Kaufman, Nature 292，154 (Jul 9，1981).54. A. G. Smith et al. , Nature 336，688 (Dec 15, 1988).55. I. G. Brons et al. , Nature 448，191 (Jul 12, 2007).56. P. J. Tesar et al. , Nature 448，196 (Jul 12, 2007).57. G. Guo et al.，Development 136，1063 (Apr，2009) ·58. P. Li et al.，Celll35，1299 (Dec 26, 2008).59. S. Yamanakaj Cell Stem Celllj 39 (Jun 7, 2007).60. N. Feldman et al. , Nat Cell Biol8, 188 (Feb, 2006).61. R. N. Yuj M. Itoj J. L Jameson, Mol Endocrinol 12，1010 (Jul, 1998) · 6 2 . K . Zeitoun，K . Takayama，M. D . Michael, S . E . Bulun，MolEndocrinoll3, 239(Feb, 1999).63. J. Nichols，A. Smith，Cell Stem Cell4，487 (Jun 5,2009).64. Wagner RTj Xu Xj Yi Fj Merrill BJj Cooney AJ. 2010. Canonical Wnt/beta-Catenin Regulation of Liver Receptor Homolog-1 (Lrh-I) MediatesPluripotency Gene Expression. Stem Cells.表I
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)體細(xì)胞的核重編程制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述體細(xì)胞與核重編程因子NRF接觸的步驟，所述因子包含下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑或拮抗劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑； (iii)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑； (iv)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物； (V)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述NRF包含視黃酸受體RAR家族成員的基因產(chǎn)物或編碼視黃酸受體RAR家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物或編碼Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述NRF包含Rarg和Lrhl基因產(chǎn)物和編碼此類(lèi)基因產(chǎn)物的多核苷酸。
4.權(quán)利要求I的方法，包含具有C末端截短的Rarg蛋白。
5.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的方法，其中所述NRF包含Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物或編碼Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物的多核苷酸或它們的等同物或替代物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述NRF還包含Klf家族基因的基因產(chǎn)物或編碼Klf家族基因的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述NRF還包括Sox家族的基因產(chǎn)物或編碼Sox家族的基因產(chǎn)物的多核苷酸。
8.前述權(quán)利要求中任ー項(xiàng)的方法，包括 (a)使體細(xì)胞與NRF接觸，所述NRF為下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑； (iii)視黃酸或參與視黃酸家族成員的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑； (iv)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物； (v)編碼上文(i)-(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸；以及然后 (b)任選地檢查從而確定所述體細(xì)胞是否已經(jīng)被重編程，以及 (c)使步驟(a)的產(chǎn)物與RA或RAR/RXR家族成員的拮抗劑接觸，或消除與所述NRF的接觸，從而維持多能性。
9.NRF，包括下述中的ー種或多種 (i)視黃酸受體RAR/RXR家族成員的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑或拮抗劑； (ii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑或拮抗劑； (iii)Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物； (iv)視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物；或其激動(dòng)劑； (v)參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物； (vi)編碼上文⑴至(iv)中任一基因產(chǎn)物的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的NRF，其用于將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9或10的NRF，其包含或編碼至少兩種基因產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求11的NRF，其包含或編碼RAR家族成員和Lrhl家族成員的基因產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求12的NRF，其包含或編碼RARG和Lrhl的基因產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求9-13的NRF，其還包含或編碼Oct家族基因和Myc家族基因的基因產(chǎn)物。
15.權(quán)利要求14的NRF，其還包含或編碼Klf家族基因的基因產(chǎn)物。
16.權(quán)利要求14或15的NRF，其還包含或編碼Sox家族的基因產(chǎn)物。
17.通過(guò)權(quán)利要求1-8所述的方法獲得的或可獲得的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
18.誘導(dǎo)性人類(lèi)多能細(xì)胞，其特征為下述中的至少ー種 表達(dá)ー種或多種多能性標(biāo)志物，如0ct4、Nanog、Rexl ； 不依賴FGF生長(zhǎng)； 籲在傳代后保持正常的核型，所述核型利用光譜核型分析進(jìn)行測(cè)量； 當(dāng)注射到小鼠中時(shí)能形成畸胎瘤；oct4、nanog或rexl中的一個(gè)或多個(gè)的啟動(dòng)子區(qū)脫甲基化； 細(xì)胞可以解離成能形成次級(jí)集落的活單細(xì)胞； 在M15+hLIF培養(yǎng)基和/或2i+LIF培養(yǎng)基中增殖； 外源重編程因子表達(dá)不存在或不顯著。
19.權(quán)利要求17或18的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述iPS細(xì)胞包含外源DNA序列。
20.權(quán)利要求19的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中當(dāng)所述外源DNA序列為外源重編程因子的序列吋，所述外源序列不表達(dá)。
21.權(quán)利要求17或18的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述iPS細(xì)胞不包含外源重編程因子。
22.權(quán)利要求17或18的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其利用權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的NRF產(chǎn)生，其中所產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在染色體中不具有KLF-4和/或S0X2插入。
23.通過(guò)分化權(quán)利要求17-22中任ー項(xiàng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的體細(xì)胞。
24.組織、器官或非人類(lèi)動(dòng)物，其包含通過(guò)分化權(quán)利要求17-22中任ー項(xiàng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞而衍生的體細(xì)胞。
25.藥物組合物，其包含權(quán)利要求9-16的核重編程因子或權(quán)利要求17-24的iPS細(xì)胞或其衍生的細(xì)胞或組織或器官以及藥學(xué)可接受賦形劑。
26.權(quán)利要求9-16的核重編程因子或權(quán)利要求17-24所述的iPS細(xì)胞或其衍生的細(xì)胞或組織或器官在醫(yī)藥中的用途。
27.在有需要的患者中預(yù)防疾病或治療疾病的方法，所述方法包括將藥學(xué)可接受量的下述之ー送遞給所述患者權(quán)利要求9-16的核重編程因子、權(quán)利要求17-23的細(xì)胞或權(quán)利要求24的組織或器官，任選地是以權(quán)利要求25的藥物組合物的形式。
28.權(quán)利要求9-16的核重編程因子、權(quán)利要求17-23的細(xì)胞或權(quán)利要求24的組織或器官，任選地以權(quán)利要求25的藥物組合物的形式，在制備用于治療有需要的患者的藥物中的用途。
29.權(quán)利要求27或權(quán)利要求28的體細(xì)胞的方法或用途，其中所述用于重編程的體細(xì)胞獲得自意圖得到治療的患者。
全文摘要
描述了重編程的體細(xì)胞、用于重編程的方法、用于體細(xì)胞的重編程因子以及治療因子和細(xì)胞的用途。所述的核重編程因子[NRF]包含下述中的一種或多種視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物或編碼視黃酸受體(RAR/RXR)家族成員的基因產(chǎn)物的多核苷酸，或其激動(dòng)劑或拮抗劑；Lrh1家族成員的基因產(chǎn)物或其激動(dòng)劑；視黃酸或參與視黃酸的合成或代謝的基因產(chǎn)物，或其激動(dòng)劑或拮抗劑；或參與視黃酸家族成員轉(zhuǎn)運(yùn)的基因產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102822345SQ201080050341
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者P·劉, W·王, J·楊 申請(qǐng)人:基因組研究有限公司