本發(fā)明涉及通過(guò)使干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)制備視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，通過(guò)該方法分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，使用通過(guò)該方法分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)篩選視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的方法，包含通過(guò)該方法分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的用于篩選視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的試劑盒，包含視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的用于治療青光眼或視神經(jīng)病變的藥物組合物，包括向疑似患有青光眼或視神經(jīng)病變的個(gè)體施用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟來(lái)治療青光眼或視神經(jīng)病變的方法，以及制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的方法。

發(fā)明背景

失明是缺失視知覺(jué)的醫(yī)學(xué)病況。數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的人，占世界人口的0.2％至0.5％，受到失明的影響，并且在個(gè)人、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)方面遭受巨大的損失。視網(wǎng)膜青光眼或視神經(jīng)病變是世界范圍內(nèi)失明的主要原因之一。青光眼是最常見(jiàn)的進(jìn)行性視神經(jīng)病變，導(dǎo)致不可逆的失明。大于40歲的人的青光眼的全球患病率高至約2％至3％。在全世界，在2010年估計(jì)有六千萬(wàn)人患有青光眼。青光眼的患病數(shù)預(yù)計(jì)在2020年增加到八千萬(wàn)(Quigley HA和Broman AT,Br J Ophthalmol 2006；90:262-267)。在社會(huì)上活動(dòng)頻繁的中年一代中青光眼的患病率為2％至3％，并且預(yù)計(jì)患者的數(shù)量將隨著人群年齡而顯著增加，這將變成社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，降低眼內(nèi)壓是臨床上應(yīng)用于青光眼治療的唯一方法，但已知青光眼患者的很大部分仍然進(jìn)展到失明。已知降低眼內(nèi)壓是僅能夠抑制青光眼進(jìn)展的保守性方法，并且所述青光眼的治療是不可能的。

同時(shí)，視神經(jīng)病變通常描述為由不同因素引起的視神經(jīng)異常，并包括視神經(jīng)炎、缺血性視神經(jīng)病變、毒性或缺陷性視神經(jīng)病變、遺傳性視神經(jīng)病變、視神經(jīng)萎縮等。其中，干細(xì)胞療法可對(duì)由視神經(jīng)退化和損傷引起的疾病有用。

具體地，青光眼由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的退化和損失引起。在通過(guò)眼睛之后，光在光感受器細(xì)胞中轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并且視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞將這些電信號(hào)傳導(dǎo)到腦的中央視神經(jīng)。

另一方面，干細(xì)胞/再生療法可以是青光眼和視神經(jīng)病變的最好療法。由單個(gè)細(xì)胞類型的退化和損失引起的疾病是干細(xì)胞療法的擅長(zhǎng)目標(biāo)。具體地，由于眼睛非常易于手術(shù)操作，并且已經(jīng)建立了多種手術(shù)程序，在將干細(xì)胞應(yīng)用至病變處沒(méi)有困難并且眼睛可以是開(kāi)發(fā)治療藥物的模型。

青光眼和視神經(jīng)病變的干細(xì)胞療法的目標(biāo)是：1)用新的RGC替換退化的受損RGC(細(xì)胞替換療法，神經(jīng)再生)，2)誘導(dǎo)對(duì)退化的受損RGC的抗炎癥、抗細(xì)胞死亡、神經(jīng)保護(hù)和血管保護(hù)的治療效果，作為干細(xì)胞療法的旁分泌效應(yīng)，以及3)使用用于治療青光眼的干細(xì)胞來(lái)選擇和開(kāi)發(fā)新藥，目前尚未開(kāi)發(fā)出針對(duì)青光眼的直接治療劑。該療法可導(dǎo)致使用患者來(lái)源的多能干細(xì)胞的個(gè)性化干細(xì)胞療法。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的高效再生在治療組合物或治療藥物模型的開(kāi)發(fā)中是十分重要的。具體地，問(wèn)題在于不能在體外制備因疾病而退化或受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，因此，不可能使用正常或異常視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)開(kāi)發(fā)青光眼或視神經(jīng)病變的新藥。因此，如果從干細(xì)胞產(chǎn)生大量視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，則可能產(chǎn)生用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相關(guān)疾病如青光眼和視神經(jīng)病變的疾病模型，因此可以容易地開(kāi)發(fā)針對(duì)這些疾病的藥物。特別是，產(chǎn)生從患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的RGC(iPSC-RGC)使得可能開(kāi)發(fā)能夠預(yù)防或抑制視神經(jīng)退化的新藥。此外，本發(fā)明人在之前的專利中公開(kāi)了從干細(xì)胞分化視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法(韓國(guó)專利第10-1268741號(hào)(2013.05.22.)和WO2011/043591(2011.04.14))。然而，根據(jù)上述文件中公開(kāi)的方法，僅約6％的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。因此，仍然需要開(kāi)發(fā)能夠最大化分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化方法。發(fā)明公開(kāi)

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明人試圖產(chǎn)生從人胚胎干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但它們表現(xiàn)不足的分化。因此，本發(fā)明人做出很多努力以開(kāi)發(fā)能夠從干細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的新方法。因此，他們開(kāi)發(fā)了在5周時(shí)間的短時(shí)間段內(nèi)在化學(xué)定義的培養(yǎng)環(huán)境下以高產(chǎn)率將人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，所述方法沒(méi)有基因植入或與視網(wǎng)膜組織的共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法開(kāi)發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在數(shù)量上是起始人胚胎干細(xì)胞的約200倍，并且視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)干細(xì)胞具有出色的神經(jīng)生理功能，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的是提供通過(guò)將干細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體)活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑并向其添加IGF1R活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)將未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其包括在含有IGF1R活化劑和Shh(音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的是提供篩選成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的方法，其包括(a)用死亡抑制劑候選物或增殖促進(jìn)劑候選物處理通過(guò)上述方法獲得和分離的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)當(dāng)與非候選物處理組比較，所述候選物抑制成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡或促進(jìn)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖時(shí)，確定所述候選物是成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑。

本發(fā)明的又一目的是提供根據(jù)本發(fā)明的上述方法制備的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的是提供篩選成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的試劑盒，其包含成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的是提供治療青光眼或視神經(jīng)病變的藥物組合物，其包含成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的又一目的是提供治療青光眼或視神經(jīng)病變的方法，其包括向疑似患有青光眼或視神經(jīng)病變的個(gè)體施用成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。

本發(fā)明的又一目的是提供制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的方法，其包括(a)在包含IGF1R活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和向其添加IGF1R活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

有利效果

根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以高產(chǎn)率從干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并且通過(guò)本方法獲得的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以用于諸如青光眼或視神經(jīng)病變的疾病的治療劑的選擇測(cè)試，還可用于細(xì)胞療法。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微照片。

(A)未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞絮狀物(30代)：從第29代細(xì)胞培養(yǎng)5天后。細(xì)胞呈未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞的典型細(xì)胞絮狀物，特征為與鄰近的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞明確分離并具有光滑的表面和均勻的形態(tài)。

(B)懸浮聚集物，其中在從圖1(A)的未分化的人胚胎干細(xì)胞絮狀物分離后所述懸浮聚集物在超低吸附平板培養(yǎng)4天。懸浮聚集物具有球形形態(tài)，并且一個(gè)懸浮聚集物由約292±53個(gè)細(xì)胞組成。

(C)至(F)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微照片。

(C)誘導(dǎo)分化后第14天的細(xì)胞：將懸浮聚集物轉(zhuǎn)移至聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板并將它們?cè)谄渲信囵B(yǎng)10天后的細(xì)胞形態(tài)，即，在誘導(dǎo)未分化的人胚胎干細(xì)胞的分化之后第14天。觀察到細(xì)胞從懸浮聚集物分離并經(jīng)歷分化，并且具有分化早期的形態(tài)學(xué)特征，具有較少的細(xì)胞質(zhì)和既圓又大的細(xì)胞核。

(D)誘導(dǎo)分化后第17天的細(xì)胞：誘導(dǎo)未分化的人胚胎干細(xì)胞的分化之后第17天的細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞分化，伴隨活性增殖，處于活性增殖和分化的細(xì)胞絮狀物形成圓形花狀玫瑰花樣結(jié)構(gòu)。

(E)誘導(dǎo)分化后第22天的細(xì)胞：隨著分化進(jìn)展，細(xì)胞變得更富含細(xì)胞質(zhì)，并且它們的細(xì)胞核大小比圖1(D)中的細(xì)胞核更小。觀察到細(xì)胞絮狀物分化為具有短或長(zhǎng)神經(jīng)元軸突的神經(jīng)元。

(F)誘導(dǎo)分化后第39天的細(xì)胞：大部分細(xì)胞分化為神經(jīng)元。隨著分化進(jìn)展至神經(jīng)元，與圖1(E)中誘導(dǎo)分化后第22天的細(xì)胞相比，細(xì)胞顯示相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但具有成熟的神經(jīng)元性狀。神經(jīng)細(xì)胞體形成多個(gè)簇，其通過(guò)長(zhǎng)神經(jīng)元軸突彼此連接。

*顯微鏡視野：(A)至(F)(左側(cè)：40倍放大倍數(shù)；右側(cè)：100倍放大倍數(shù))。

圖2顯示從人新生兒包皮BJ-1成纖維細(xì)胞重編程的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的特征。

(A)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的相差顯微鏡圖像：從第6代細(xì)胞培養(yǎng)6天后的細(xì)胞系。干細(xì)胞特征為與作為飼養(yǎng)細(xì)胞的鄰近的小鼠胚胎體細(xì)胞明確分離并具有光滑的表面和均勻的形態(tài)。(B)和(C)為顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞特征的堿性磷酸酶、Nanog和SSEA-4染色結(jié)果。(D)為評(píng)估從成纖維細(xì)胞生成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性的畸胎瘤測(cè)定的結(jié)果。在從成纖維細(xì)胞生成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞植入免疫抑制的SCID小鼠的背部表面之后10周，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞發(fā)育成畸胎瘤，具有三種胚層——外胚層(左側(cè)：神經(jīng)組織)，中胚層(中間：軟骨)和內(nèi)胚層(右側(cè)：消化系統(tǒng))，顯示多能性。

*比例尺：(A)、(B)、(C):200μm。

圖3為顯示根據(jù)本發(fā)明從人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的示意圖。參照視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胚胎學(xué)發(fā)育，在每個(gè)階段考慮化學(xué)定義的培養(yǎng)基、細(xì)胞體外粘附和分化因子?；谛∈蟮呐咛W(xué)發(fā)育的階段和期間來(lái)計(jì)劃胚胎學(xué)發(fā)育的階段和期間。

圖4為顯示根據(jù)本發(fā)明的從人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的示意圖，其根據(jù)在誘導(dǎo)分化后第14天至第17天處理Wnt3a 3天的方案進(jìn)行(稱為方案A)。該方案為本發(fā)明的方案的原型。指出各個(gè)分化階段的細(xì)胞類型和分化標(biāo)志物，并且在圖1給出根據(jù)該方案分化的細(xì)胞的照片。

圖5為顯示根據(jù)本發(fā)明的從人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的示意圖，其根據(jù)在誘導(dǎo)分化后第11天至第14天處理Wnt3a 3天的方案進(jìn)行(稱為方案B)。

圖6為顯示根據(jù)本發(fā)明的從人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的示意圖，其根據(jù)在誘導(dǎo)分化后第11天至第17天處理Wnt3a 6天的方案進(jìn)行(稱為方案C)。

圖7顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第17天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)觀察到對(duì)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)志物Rax和Pax6均為陽(yáng)性的細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有對(duì)這兩種標(biāo)志物為陽(yáng)性的特征。

(B)觀察到未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)志物Math5。與全部細(xì)胞(DAPI染色的)相比，幾乎100％的細(xì)胞為Math5陽(yáng)性的。

(C)在幾乎所有細(xì)胞觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Brn3B。這表明細(xì)胞成為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的命運(yùn)由Math5決定，然后它們開(kāi)始分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

(D)所有細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物之一Brn3A(綠色染色：核染色)和對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)特異的Tuj1(紅色染色：也被稱為β-微管蛋白III)均為陽(yáng)性。

(E)約20％的細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型的標(biāo)志物Islet-1(紅色：核染色)和神經(jīng)元軸突特異性標(biāo)志物NF200(綠色)均為陽(yáng)性。

*比例尺：A:50μm；B:200μm&50μm；C至E:100μm&50μm。

全部細(xì)胞的核染色：DAPI(藍(lán)色染色)。

圖8顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天檢查標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。

圖9顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)仍然觀察到在圖7中觀察到的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物(A)Pax6、(B)Brn3B和(C)Brn3A。

(D)幾乎所有細(xì)胞對(duì)Brn3A(綠色：細(xì)胞核)和Tuj1(紅色：細(xì)胞質(zhì)染色，軸突和樹(shù)突均被染色)均為陽(yáng)性。與圖7的第17天的細(xì)胞相比，神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的數(shù)量和厚度增加。觀察到軸突棘突和環(huán)，細(xì)胞之間的突觸相互作用，以及樹(shù)突樹(shù)和棘突。

(E)觀察到對(duì)Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)均為陽(yáng)性的細(xì)胞。與圖7的第17天的細(xì)胞相比，軸突的數(shù)量增加并觀察到成熟形式。

(F)Brn3B(綠色)和Tuj1(紅色)：大部分細(xì)胞絮狀物對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性染色Brn3B和Tuj1均為陽(yáng)性。

(G)Brn3B(綠色)和Thy1.2(紅色)：觀察到Brn3B的核染色和Thy1.2的細(xì)胞質(zhì)染色，它們是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特征。

(H)Brn3A(綠色)和Thy1.2(紅色)：觀察到Brn3B的核染色和Thy1.2的細(xì)胞質(zhì)染色，它們是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特征。

(I)Map2(綠色)：觀察到包括樹(shù)突的細(xì)胞質(zhì)染色。

(J)通過(guò)使抗體與誘導(dǎo)分化后第39天的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的溶解產(chǎn)物反應(yīng)而獲得的免疫印跡結(jié)果表明視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性蛋白。

*比例尺：A至C:50μm；D:200μm,50μm&20μm；E:100μm,50μm&20μm；F:200μm&100μm；G:20μm；H:100μm；I:50μm。

全部細(xì)胞的核染色：DAPI(藍(lán)色)。

圖10顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第59天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)觀察到對(duì)Brn3A(綠色：細(xì)胞核)和Tuj1(紅色：細(xì)胞質(zhì)染色，軸突和樹(shù)突均被染色)均為陽(yáng)性的細(xì)胞。與圖8的第39天的細(xì)胞相比，軸突和樹(shù)突的數(shù)量和厚度增加。

(B)Tuj1：觀察到軸突棘突和環(huán)，細(xì)胞之間的突觸相互作用，以及樹(shù)突樹(shù)和棘突。

(C)NF200：觀察到樹(shù)突棘突和軸突環(huán)。

(D)突觸蛋白1：在突觸前囊泡中觀察到功能成熟斑點(diǎn)和樹(shù)突形式的參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的代表性蛋白突觸蛋白1，表明發(fā)生與其他神經(jīng)元的突觸相互作用以傳導(dǎo)細(xì)胞之間的神經(jīng)電刺激。

(E)Map2/Vglut1：圖(D)的突觸蛋白1指示的突觸前囊泡的大部分為谷氨酸能囊泡(Vglue1：紅色)。觀察到Vglut1以及Map2陽(yáng)性的樹(shù)突(綠色)的存在。產(chǎn)生谷氨酸能興奮性神經(jīng)元。

(E)Map2/Vgat：圖(D)的突觸蛋白1指示的突觸前囊泡的一小部分為GABA能囊泡(Vgat：紅色)。觀察到Vgat以及Map2陽(yáng)性的樹(shù)突(綠色)的存在。

(G)PSD-95/Map2：在突觸后囊泡中觀察到蛋白形成，并且興奮性突觸標(biāo)志物PSD-95沿樹(shù)突分布(Map2)。

(H)突觸蛋白1/PSD-95：通過(guò)超高分辨率顯微鏡的生理突觸：觀察到突觸前突觸蛋白1與突觸后興奮性PSD-95之間的突觸?？赏ㄟ^(guò)突觸前和突觸后囊泡復(fù)合體的并置鑒定生理突觸。具有引起作為“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”的電生理學(xué)特征的自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)的神經(jīng)遞質(zhì)，指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能成熟。

*比例尺:A:100μm；B:100μm&20μm；C:20μm；D:50μm&20μm；E:20μm；F:20μm；G:50μm&1μm；H:2μm&0.5μm。

細(xì)胞的核染色：DAPI(藍(lán)色)。

圖11顯示根據(jù)方案B的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A

(D),(E)Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)

(F)NF200

(G)Brn3A,Tuj1

(H)Tuj1

(I)突觸蛋白1/Tuj1

*比例尺:A至I:50μm.圖11H的核染色：DAPI(藍(lán)色)。

圖12顯示根據(jù)方案C的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)Math5

(B)Pax6

(C)Brn3B

(D)Brn3A

(E)Brn3A,Tuj1

(F)Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)

(G)TrkB：觀察到成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體標(biāo)志物TrkB的表達(dá)。

(H)突觸蛋白1/PSD-95

*比例尺:A至H:50μm。

圖13顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞系H7分化后第39天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A

在幾乎所有細(xì)胞中觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特征標(biāo)志物。

(D)Brn3A(綠色：細(xì)胞核)和Tuj1(紅色：細(xì)胞質(zhì)染色，軸突和樹(shù)突均被染色)。

(E),(F)Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)

(G)突觸蛋白1(綠色)，Tuj1(紅色)：突觸前標(biāo)志物突觸蛋白1沿Tuj1陽(yáng)性軸突分布。

(H)突觸蛋白1/PSD-95：突觸前標(biāo)志物突觸蛋白1和突觸后標(biāo)志物PSD-95彼此接近，指示H7細(xì)胞系通過(guò)方案A分化為具有成熟電生理學(xué)功能的“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”，與H9細(xì)胞系類似。

*比例尺:A:50μm；B,C:100μm；D:200μm；E:200μm&20μm；F:100μm；G:20μm；H:20μm。

圖13(E)的核染色：DAPI(藍(lán)色)。

圖14顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后第39天檢查細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。

(A)Math5

(B)Pax6

(C)Brn3B

(D)Brn3A

(E)NF200

(F)Brn3A(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)

(G)Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)：觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型之一。

(H)NF200,Islet-1

(I)Brn3A,Tuj1

(J)Tuj1:觀察到成熟神經(jīng)元的軸突的分化。

(K)突觸蛋白1(綠色)，Tuj1(紅色)：突觸前標(biāo)志物突觸蛋白1沿Tuj1陽(yáng)性軸突分布。

(L)突觸蛋白1/PSD-95：突觸前標(biāo)志物突觸蛋白1和突觸后標(biāo)志物PSD-95彼此接近，表明人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過(guò)方案A分化為具有成熟電生理學(xué)功能的“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”，與H9細(xì)胞系類似。

*比例尺:A至C,E to H,J,L:50μm；D,I:100μm；K:20μm。

圖15顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的強(qiáng)烈規(guī)則尖峰的動(dòng)作電位序列，指示產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞獲得成熟的電生理學(xué)特征。通常，隨著神經(jīng)元成熟，動(dòng)作電位響應(yīng)于電流注入從單個(gè)短尖峰轉(zhuǎn)變成多個(gè)持續(xù)尖峰。

(B)人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電壓門(mén)控鈉通道：對(duì)從保持電位-80mV階梯去極化至+40mV的電流響應(yīng)重疊。通過(guò)應(yīng)用河豚毒素(TTX)完全阻斷快速活化和未活化的鈉內(nèi)向電流。

(C)在誘導(dǎo)分化后第39天未與其他視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中檢測(cè)到自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)，表明在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間形成功能性興奮性突觸。

圖16顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第59天的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)鉀電流：4-氨基吡啶(4-AP)阻斷鉀外向電流的快速活化部分。

(B)在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的強(qiáng)烈規(guī)則尖峰的動(dòng)作電位序列。與誘導(dǎo)分化后第39天的尖峰數(shù)量相比，尖峰數(shù)量增加。

(C)步階電流注入(pA)誘發(fā)的尖峰的數(shù)量的曲線圖：尖峰的數(shù)量與注入電流的強(qiáng)度成比例地增加。

谷氨酸能突觸前囊泡的染色圖像(Vglut1)在樹(shù)突(Map2陽(yáng)性)中分布。

(E)自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)：AMPA受體拮抗劑CNQX阻斷sEPSC的出現(xiàn)。形成谷氨酸能興奮性突觸。

圖17顯示根據(jù)方案B的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第96天的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的尖峰動(dòng)作電位序列。

(B)觀察到自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)。AMPA受體拮抗劑CNQX阻斷sEPSC的出現(xiàn)。形成谷氨酸能興奮性突觸。

圖18顯示根據(jù)方案C的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第66天的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的尖峰動(dòng)作電位序列。

(B)觀察到自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)。形成谷氨酸能興奮性突觸。

圖19顯示根據(jù)方案B的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9分化后第39天的在供應(yīng)排除IGF-1、Shh和RA(視黃酸)的分化培養(yǎng)基時(shí)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)在誘導(dǎo)分化后第96天在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的強(qiáng)烈規(guī)則尖峰的動(dòng)作電位序列。

(B)在誘導(dǎo)分化后第96天在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)。形成谷氨酸能興奮性突觸。

圖20顯示根據(jù)方案A的誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化后第39天的電生理學(xué)分析的結(jié)果。

(A)在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到響應(yīng)于步階電流注入(pA)的強(qiáng)烈規(guī)則尖峰的動(dòng)作電位序列，表明產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞獲得成熟的電生理學(xué)特征。

(B)鉀電流：4-氨基吡啶(4-AP)阻斷鉀外向電流的快速活化部分。

圖21顯示通過(guò)其他Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和Shh受體活化劑的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化。

除上述不同方法中使用的Wnt3a之外，根據(jù)方案A的時(shí)間計(jì)劃表使用2μM Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑BIO(6-溴靛玉紅-3’-肟)、50ng/mL Norrin、1μM Shh受體活化劑purmorphamine、和500nM視黃酸(RA)誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)分化后第39天細(xì)胞中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物Islet-1(紅色：細(xì)胞核)和NF200(綠色：軸突)的免疫熒光染色結(jié)果與Wnt3a和Shh的免疫熒光染色結(jié)果一致。

*比例尺:A,C,D:100μm；B:50μm。

圖22顯示在用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方案A分化方法中使用的Wnt3a、Shh和RA的效果的分析結(jié)果。根據(jù)分化計(jì)劃表處理各個(gè)因子，在誘導(dǎo)分化后第39天，使用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光測(cè)定。

*比例尺:50μm。

圖23顯示在繼代培養(yǎng)之后，人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微照片。細(xì)胞為在細(xì)胞系建立之后第16代的細(xì)胞，即，從第15代細(xì)胞培養(yǎng)3天的細(xì)胞。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的繼代培養(yǎng)的細(xì)胞顯示體外的神經(jīng)元形態(tài)。

(A)用培養(yǎng)基1繼代培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)

(B)用培養(yǎng)基2繼代培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)

用培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2繼代培養(yǎng)的細(xì)胞均顯示特征為細(xì)胞質(zhì)延長(zhǎng)、長(zhǎng)神經(jīng)突(neuritis)和階段透明細(xì)胞體的獨(dú)特神經(jīng)元形態(tài)。

*左側(cè)：相差顯微鏡，100倍放大倍數(shù)；右側(cè)：200倍放大倍數(shù)。

圖24顯示檢查人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果。細(xì)胞為細(xì)胞系建立后第17代的細(xì)胞，并且在第16代細(xì)胞傳代之后第3天進(jìn)行免疫熒光染色。在幾乎所有細(xì)胞中觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特征標(biāo)志物。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A/Tuj1

(D)突觸蛋白1/Tuj1

(E)NF200

(F)KI67

(G)Thy1.2

(H)NMDAR1

(I)TrkB

*比例尺:A至I:50μm.核染色：DAPI(藍(lán)色)。

圖25顯示人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)鈣的顯微鏡成像，表明這些細(xì)胞具有神經(jīng)元功能。將第15代的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)3天。用1μM fluor-4處理細(xì)胞并用1mM谷氨酸鹽刺激，然后觀察時(shí)間差異圖像。結(jié)果是在許多活細(xì)胞中檢測(cè)到鈣。從黑(最低)到白(最高)的系列圖像光譜代表鈣濃度。在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)鈣響應(yīng)于谷氨酸鹽刺激(箭頭)而顯著增加。

最佳實(shí)施方式

為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明的一方面提供通過(guò)將干細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體)活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑并向其添加IGF1R活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

視網(wǎng)膜是脊椎動(dòng)物的中央神經(jīng)系統(tǒng)中研究最深入的器官之一，已經(jīng)探查詳細(xì)形態(tài)、神經(jīng)元的突觸連接和視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生理學(xué)現(xiàn)象數(shù)十年。相比之下，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)發(fā)育及其多種功能機(jī)制尚未被澄清。

其中，“視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)”是脊椎動(dòng)物的視網(wǎng)膜中存在的輸出神經(jīng)元，并且他們的軸突形成視神經(jīng)并向大腦發(fā)送圖像。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是神經(jīng)元，即，作為神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)單元的神經(jīng)細(xì)胞，并具有多個(gè)樹(shù)突和單個(gè)長(zhǎng)纖維狀軸突。樹(shù)突互相形成突觸，以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的電活動(dòng)和傳導(dǎo)流入細(xì)胞體的電刺激。軸突具有多個(gè)含有微?；蚰遗莸姆种У哪┒耍漤憫?yīng)于神經(jīng)刺激釋放神經(jīng)遞質(zhì)。突觸是神經(jīng)元之間沖動(dòng)傳導(dǎo)的點(diǎn)。稱為神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)穿過(guò)突觸間隙，并維持神經(jīng)沖動(dòng)。在發(fā)育期間，從多能視網(wǎng)膜祖細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。例如，在小鼠中，在胚胎(E)第11.5天開(kāi)始視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育并持續(xù)至出生后(P)第0天，并在E14.5達(dá)到峰值。已知主要擴(kuò)張期為E14.5至E17.5，其取決于動(dòng)物而可變，但不限于此。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能為將視覺(jué)信息從視網(wǎng)膜的多種細(xì)胞傳導(dǎo)至大腦的視神經(jīng)中心。穿過(guò)眼睛的光在光受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并且產(chǎn)生的電信號(hào)通過(guò)視網(wǎng)膜的多種神經(jīng)元傳導(dǎo)至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能為接收這些信號(hào)并將它們傳導(dǎo)至大腦的視神經(jīng)中心。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育受分層基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，并且發(fā)育和分化由主要轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以根據(jù)分化程度劃分為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

“未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”是指獲得視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和蛋白與遺傳標(biāo)志物特征的細(xì)胞(Barres,et al.,Neuron.1988；1:791-803.)?！俺墒煲暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”是指在獲得“未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”的上述特征之后處于作為神經(jīng)元的成熟狀態(tài)的細(xì)胞。即，它們具有以下形態(tài)學(xué)特征：軸突生長(zhǎng)、樹(shù)和環(huán)；樹(shù)突樹(shù)、分支和環(huán)；樹(shù)突棘突；突觸結(jié)等，以及作為興奮性神經(jīng)特征的突觸前或突觸后蛋白形態(tài)和多種受體的特征蛋白和遺傳標(biāo)志物?！俺墒煲暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”的電生理學(xué)特征是自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)的形成，表明能夠在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間形成突觸連接的功能成熟(PfriegerBarres,Science.1997；277:1684-7.)。

“未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”是指從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的早期的細(xì)胞。這些未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是注定從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞成為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞，或注定成為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞，但缺乏成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征。在本發(fā)明中，未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和早期視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可互換地使用。

“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞”是指從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的晚期的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，或已經(jīng)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有產(chǎn)生高頻動(dòng)作電位的生理學(xué)特征和具有長(zhǎng)軸突的形態(tài)學(xué)特征，但不限于此。

可以通過(guò)鑒定對(duì)各個(gè)細(xì)胞特異的標(biāo)志物的表達(dá)水平及其形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征(例如，電化學(xué)特征)來(lái)確定視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞還是成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

首先，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育和分化中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子如下：參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子為ATOH7(Math5)，Brn3家族(Brn3A,Brn3B,and Brn3C)，和Isl1(Islet-1)。

ATOH7，也被稱為Math5，是參與決定視網(wǎng)膜祖細(xì)胞至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的因子，并且對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形成十分重要。因此，Math5優(yōu)選在未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)。

此外，已知在基因網(wǎng)絡(luò)中ATOH7下游的POU4F2和POU4F1(分別又被稱為Brn3B和Brn3A)和Isl1(Islet-1)對(duì)于RGC的誕生不是必需的，但已知它們對(duì)于RGC分化和存活是必需的。已知它們?cè)谝暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化早期表達(dá)，也在成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)。

具體地，Brn3家族參與RGC分化、RGC樹(shù)突分支和發(fā)育期間RGC的軸突投射的調(diào)節(jié)。在Brn3家族中，Brn3B是在RGC發(fā)育早期表達(dá)的因子，并且是最早期的RGC標(biāo)志物之一，在RGC的軸突生長(zhǎng)和存活中作為重要因子。

在小鼠中，Brn3A的表達(dá)在胚胎(E)第12.5天開(kāi)始，在大鼠中，Brn3A在92.2％的RGC群體中表達(dá)。已知Brn3B在RGC的軸突形成中起作用，而已知Brn3A參與樹(shù)突形成。

Isl1是在視網(wǎng)膜發(fā)育期間表達(dá)的同源結(jié)構(gòu)域LIM蛋白。Isl1基因在RGC出生后即刻活化，并且在胚胎(E)第14.5天之前其表達(dá)與POU4F2的表達(dá)相同。首先，Isl1是RGC分化和存活所必需的因子，并且其表達(dá)由ATOH7支配。Isl1表達(dá)在完全分開(kāi)的細(xì)胞中在小鼠胚胎(E)第11.5天開(kāi)始，并且已知Isl1在一些Brn3B陽(yáng)性RGC細(xì)胞中與Brn3B共表達(dá)。

上述轉(zhuǎn)錄因子在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生成中起重要作用，因此未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可表達(dá)(1)Math5和/或(2)選自Brn3B、Brn3A和Islet1中的一種，特別是兩種和更特別是三種。此外，與視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中這些標(biāo)志物基因的表達(dá)相比，這些標(biāo)志物基因的表達(dá)可以增加，但不限于此。

此外，未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以是表達(dá)NF200或/和Tuj1的那些細(xì)胞。NF200是被稱為神經(jīng)絲200kDa的蛋白，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化早期表達(dá)。還已知Tuj1在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化早期表達(dá)。因此，這兩種基因可用于區(qū)分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，具體地，區(qū)分未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但不限于此。此外，對(duì)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異的標(biāo)志物基因?yàn)門(mén)hy1.2、TrkB、NMDAR1、Map2、Vglut1、PSD-95、突觸小泡蛋白和突觸蛋白1。這些基因是已知在成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)志物基因。

因此，成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可表達(dá)選自Brn3B、Brn3A、Islet-1、NF200、Tuj1、Thy1.2、TrkB、NMDAR1、Map2、Vglut1、PSD-95、突觸小泡蛋白和突觸蛋白1中的一種，特別是兩種，更特別是4、5、6、7、8、9和10種標(biāo)志物基因。此外，與視網(wǎng)膜祖細(xì)胞或未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相比，成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可表現(xiàn)這些基因的高表達(dá)，但不限于此。

本發(fā)明的方法為能夠以高產(chǎn)率使視網(wǎng)膜祖細(xì)胞經(jīng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其特征在于在含有Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以將它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，然后將未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在不含Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以將它們分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。即，本發(fā)明的技術(shù)特征是通過(guò)在不同的分化階段用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑處理干細(xì)胞來(lái)決定干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的命運(yùn)，以及通過(guò)移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑來(lái)將60％至95％或更多的多種視網(wǎng)膜細(xì)胞群體分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。本發(fā)明首次開(kāi)發(fā)了誘導(dǎo)向成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞高效分化的方法。

本發(fā)明的方法的詳細(xì)描述在下文給出。

在本發(fā)明的方法中，步驟(a)是在含有IGF1R活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以將它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。步驟(a)可進(jìn)行1天至10天，但不限于此。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“視網(wǎng)膜祖細(xì)胞”是指能夠分化成為存在于視網(wǎng)膜中的細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的多能祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征在于表達(dá)選自Rax、Pax6、Chx10、Otx2、Sox2、Lhx2、Six3、Six6和Mitf中的一種、兩種或三種或更多種標(biāo)志物，并且特別地，特征在于表達(dá)Rax和Pax6中的一種或兩種，但不限于此。

如上文提到的與視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞能夠分化成為多種類型的視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞等)和視網(wǎng)膜色素上皮，特征為諸如Crx、恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)、紅綠視蛋白(red/green opsin)、藍(lán)視蛋白、外周蛋白2、PDE6B、SAG、Islet1/NF200、Prox1、PKC-a、Hu C/D、GFAP、ZO-1和RPE65的標(biāo)志物為陽(yáng)性表達(dá)。然而，這些標(biāo)志物的表達(dá)水平和陽(yáng)性率在視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中變得比在成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮中更弱，但不限于此。

用于將視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基的特征在于含有IGF1R活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。此外，用于將視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基除IGF1R活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑之外還可含有，但不限于，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。此外，培養(yǎng)基可以為除上述材料之外還包含1％B27補(bǔ)充物和1％N2補(bǔ)充物的DMEM/F12培養(yǎng)基，但不限于此。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“IGF1R活化劑”是指活化酪氨酸激酶受體家族的成員IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)受體(IGF1R)的物質(zhì)。活化的IGF1R與胰島素受體底物(IRS)相互作用。進(jìn)而，IGF1R活化的IRS充當(dāng)兩條途徑的活化劑：由PI3k、Akt和mTOR組成的一條途徑；由Raf、MEK和ERK組成的另一條途徑(Ryan&Goss,Oncologist.2008；13:16-24)。IGF-1和IGF-2落入IGF1R活化劑的范圍。IGF-1具有與胰島素相似的分子結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞死亡，但不限于此。

在本發(fā)明中可以不受限制地使用任意IGF1R活化劑，只要其活化IGF1R。示例為IGF-1或IGF-2，并且特別是IGF-1，但不限于此。

用于將視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基包含量為具體地0.01ng/mL至100ng/mL，更具體地0.1ng/mL至50ng/mL，更具體地1ng/mL至20ng/mL，和最具體地10ng/mL的IGF1R活化劑。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”是指活化Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，已知Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在胚胎發(fā)生期間調(diào)節(jié)多種過(guò)程，包括決定細(xì)胞命運(yùn)，組織重建，未分化的細(xì)胞的極性、形態(tài)、附著和生長(zhǎng)，以及維持和增殖。任意活化劑可以不受限制地包括在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，只要其傳導(dǎo)Wnt介導(dǎo)的或β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一系列過(guò)程，其通過(guò)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一引發(fā)物Wnt與其受體結(jié)合開(kāi)始，或由細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶標(biāo)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定介導(dǎo)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑為以下，但不特別限于此。

1)通過(guò)直接添加Wnt蛋白：Wnt為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一引發(fā)物，屬于分泌糖蛋白家族。已經(jīng)鑒定出19種Wnt：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16b。

2)通過(guò)增加β-連環(huán)蛋白的水平：大多數(shù)細(xì)胞通過(guò)增加β-連環(huán)蛋白水平而響應(yīng)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。即去磷酸化的β-連環(huán)蛋白水平的增加(或穩(wěn)定)表示β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。

3)通過(guò)蓬亂蛋白(dishevelled)的磷酸化或Wnt相關(guān)受體即LRP尾的磷酸化。

4)通過(guò)使用GSK3(糖原合酶激酶3)抑制劑：鋰(Li)、LiCl、二價(jià)Zn、BIO(6-溴靛玉紅-3’-肟)、SB216763、SB415286、QS11水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛紅-3’-肟、TDZD-8和Ro31-8220甲磺酸鹽。

5)通過(guò)阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑，例如Axin和APC，或通過(guò)使用RNAi。

6)使用Wnt途徑的活化劑，例如norrin和R-spondin2：Norrin結(jié)合Frizzled4受體，而R-spondin2與Frizzled8和LRP6相互作用。

7)通過(guò)基因轉(zhuǎn)移，包括轉(zhuǎn)染：可以使用Wnt超表達(dá)構(gòu)建體或β-連環(huán)蛋白超表達(dá)構(gòu)建體。

在本發(fā)明中，可以使用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑而不受限制，只要其能夠活化Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它們具體為Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16b；增加β-連環(huán)蛋白水平的物質(zhì)；GSK3抑制劑，如鋰、LiCl、二價(jià)鋅、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛紅-3’-肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸鹽；Axin抑制劑、APC抑制劑、norrin或R-spondin 2，且更具體地Wnt3a、Wnt1、Wnt5a、Wnt11、norrin、LiCl、BIO或SB415286，但不限于此。

除了LiCl、BIO和SB415286，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑可以0.01ng/mL至500ng/mL的量使用，具體地以0.1ng/mL至200ng/mL的量使用，和更具體地以1ng/mL至100ng/mL的量使用。在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑中，培養(yǎng)基中LiCl的含量為0.1mM至50mM，具體地0.5mM至10mM，更具體地1mM至10mM；培養(yǎng)基中BIO的含量為0.1μM至50μM，具體地0.1μM至10μM，更具體地0.5μM至5μM；培養(yǎng)基中SB415286的含量為0.1μM至500μM，具體地1μM至100μM，更具體地5μM至50μM。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑”是指能夠抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一組物質(zhì)。BMP屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白，其屬于TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)超家族，并且參與胎兒早期分化、胎兒組織形成和成體組織的動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞外分泌的BMP與I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，啟動(dòng)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。II型受體磷酸化I型受體。然后，磷酸化的I型受體磷酸化細(xì)胞內(nèi)底物Smad蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。由受體調(diào)節(jié)的Smad蛋白被稱為R-Smad(受體調(diào)節(jié)的Smad)，并且Smad-1、2、3、5和8屬于R-Smad。它們可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)共同伴侶(Co-Smad)Smad-4。它們遷移入細(xì)胞核并在其中累積，在那里它們充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并參與靶基因表達(dá)的調(diào)控(Yamamoto&Oelgeschlager,Naturwissenschaften.2004；91:519-34)。BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑指這樣的物質(zhì)，其阻斷細(xì)胞外BMP與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。BMP信號(hào)途徑抑制劑的實(shí)例包括頭蛋白(Noggin)、腱蛋白(chordin)、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC(與DAN和Cerberus相關(guān)的蛋白)、DAN(在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中差異篩選選出的基因aberrative)、dante、卵泡抑素、USAG-1(子宮敏感性相關(guān)基因1)、dorsomorphin和硬化蛋白(sclerostin)。通過(guò)抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，頭蛋白在神經(jīng)誘導(dǎo)和背腹神經(jīng)外胚層或中胚層中起重要作用。同樣，頭蛋白結(jié)合BMP(BMP-2、BMP-4和BMP-7)，并阻斷這些BMP與其受體的結(jié)合(Yanagita,Cytokine Growth Factor Rev.2005；16:309-17)。

在本發(fā)明中，可以利用任意BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，只要其能夠抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其實(shí)例可包括頭蛋白、腱蛋白、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC、DAN、dante、卵泡抑素、USAG-1(子宮敏感性相關(guān)基因1)、dorsomorphin和硬化蛋白，但不限于此。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，使用頭蛋白。

在本發(fā)明中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的含量為0.01ng/mL至100ng/mL，具體地0.1ng/mL至50ng/mL，更具體地0.5ng/mL至20ng/mL，和最具體地10ng/mL，但不限于此。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”是指能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。FGF是參與包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化在內(nèi)的有絲分裂、血管生成、骨形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)誘導(dǎo)的因子。迄今已鑒定出FGF家族的22個(gè)成員。FGF受體家族(FGFR)有4個(gè)成員。它們的mRNA結(jié)合至可選的剪接受體變體以活化FGF受體?；罨腇GFR通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中Ras/Raf/MeK途徑介導(dǎo)信號(hào)以活化MAP激酶，MAP激酶進(jìn)而誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Bottcher&Niehrs,Endocr Rev.2005；26:63-77)。FGF家族的FGF2也被稱為堿性FGF(bFGF)，主要與FGFR 1b、FGFR 1c、FGFR2c、FGFR 3c和FGFR 4Δ結(jié)合，并強(qiáng)烈活化FGFR 1c和FGFR 3c。FGFR1c和FGFR 3c的活化劑以及FGF1、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17和FGF19可以用作替代物，但不限于此。

在本發(fā)明中，可以不受限制地利用任意FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑劑，只要其能夠刺激FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其實(shí)力可包括FGFR 1c或FGFR3c的活化劑、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17或FGF19，但不限于此。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，使用FGF2。

在本發(fā)明中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的含量為0.01ng/mL至100ng/mL，具體地0.1ng/mL至50ng/mL，更具體地1ng/mL至20ng/mL，和最具體地5ng/mL，但不限于此。

此外，步驟(a)的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可以通過(guò)以下來(lái)獲得：(a’)在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞以使它們分化成為懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞：IGF1R活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑；以及(b’)在通過(guò)向步驟(a’)的培養(yǎng)基添加FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮聚集形式的步驟(a’)的眼區(qū)前體細(xì)胞以使它們分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。

可以不受特別限制地使用任意干細(xì)胞，只要它們能夠分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，并且干細(xì)胞可以選自骨髓干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNT)。

可以通過(guò)將這些干細(xì)胞在含有IGF1R活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)使它們分化為眼區(qū)前體細(xì)胞。在這方面，IGF1R活化劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑及其濃度與上述用于誘導(dǎo)分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中相同。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑”是指阻斷細(xì)胞外Wnt蛋白與膜蛋白Frizzled受體或共受體LRP之間的相互作用或者抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子。在本發(fā)明中，可以不受限制地利用任意Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑劑，只要其抑制Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的實(shí)例包括Dkk(Dickkopf)家族(Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4)，其是共受體LRP的Wnt拮抗劑，Wise，Wnt拮抗劑(sFRP：分泌型Frizzled相關(guān)蛋白)家族，F(xiàn)rizzled-CRD結(jié)構(gòu)域，WIF-1(Wnt抑制因子-1)，IWP-2，IWP-3，IWP-4，cerberus，Wnt抗體，顯性負(fù)作用的Wnt蛋白，Axin的超表達(dá)，GSK(糖原合成酶激酶)的超表達(dá)，顯性負(fù)作用的TCF，顯性負(fù)作用的蓬亂蛋白和酪蛋白激酶抑制劑(CKI-7、D4476等)，但不限于此。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，使用Dkk-1。

此外，除了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑之外，還可以通過(guò)抑制參與Wnt途徑的每一成分來(lái)抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如RNAi。

在培養(yǎng)基中，用于使干細(xì)胞經(jīng)眼區(qū)前體細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的含量為0.01ng/mL至10,000ng/mL，但不限于此。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“眼區(qū)前體細(xì)胞”是指表達(dá)在胚胎發(fā)育期間前腦神經(jīng)板的眼區(qū)祖細(xì)胞中存在的特異標(biāo)志物(眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子；Zuber,et al.,Development,2003；130:5155-67)的細(xì)胞。眼區(qū)前體細(xì)胞特征在于表達(dá)選自Six3、Rax、Pax6、Otx2、Lhx2和Six6中的一種、兩種或三種或更多種標(biāo)志物，但不限于此。

眼區(qū)前體細(xì)胞具有懸浮聚集物的形態(tài)。在這方面，懸浮聚集物是指胚胎干細(xì)胞絮狀物在沒(méi)有飼養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和血清的非貼壁平板中培養(yǎng)至少1天時(shí)所產(chǎn)生的培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞團(tuán)。取決于所用培養(yǎng)基的組成，眼區(qū)前體細(xì)胞可以表達(dá)眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子。

此外，步驟(a’)可進(jìn)行1天至30天，步驟(b’)可進(jìn)行5天至15天，但不限于此。

在本發(fā)明中，其中步驟(b’)的眼區(qū)前體細(xì)胞的懸浮聚集物在包被有選自以下的細(xì)胞外基質(zhì)的平板上貼壁生長(zhǎng)：聚-D-賴氨酸、層粘連蛋白、聚L賴氨酸、基質(zhì)膠、瓊脂、聚鳥(niǎo)氨酸、明膠、膠原蛋白、纖維連接蛋白和玻璃粘連蛋白。

每個(gè)貼壁的懸浮聚集物的細(xì)胞群是最高效的細(xì)胞的數(shù)量。眼區(qū)前體細(xì)胞的懸浮聚集物可以由200個(gè)細(xì)胞至400個(gè)細(xì)胞組成，但不限于此。

此外，步驟(a’)的培養(yǎng)基可以是除IGF1R活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑之外還包含10％knockout血清替代物和1％B27補(bǔ)充物的DMEM/F12培養(yǎng)基。

此外，步驟(b’)的培養(yǎng)基可以是除上述IGF1R活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑之外還包含1％B27補(bǔ)充物和1％N2補(bǔ)充物的DMEM/F12培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的方法中，步驟(b)是培養(yǎng)在步驟(a)中分化的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以通過(guò)步驟(b)分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

為了高效分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，步驟(b)中使用的培養(yǎng)基特征在于不含有步驟(a)的培養(yǎng)基中含有的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。

更具體地，步驟(b)可以是在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞的步驟，更具體地，在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑并向其添加Shh(音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑而制備的培養(yǎng)基中。

此外，步驟(b)可包括(i)通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑在含有IGF1R活化劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(ii)在通過(guò)從步驟(i)的培養(yǎng)基移除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑并向其添加Shh(音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

同時(shí)，本文所用的術(shù)語(yǔ)“移除”可以解釋為使用不包含待移除的對(duì)象的培養(yǎng)基。此外，術(shù)語(yǔ)“其組成不包含X的培養(yǎng)基”是指不包含X的所有培養(yǎng)基。

此外，培養(yǎng)基可以為除上述物質(zhì)之外還包含1％B27補(bǔ)充物和1％N2補(bǔ)充物的DMEM/F12培養(yǎng)基，但不限于此。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“Shh(音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”是指誘導(dǎo)或活化Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。已知Shh是與胚胎發(fā)生期間多種過(guò)程的調(diào)控相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，所述過(guò)程包括決定細(xì)胞命運(yùn)、極化、形態(tài)、增殖和分化(Bertrand&Dahmane,Trends Cell Biol.2006；16:597-605)。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及兩種跨膜蛋白，即Ptc(Patched)和Smo(Smoothened)。在不存在Shh的情況下，Ptc與Smo相互作用并抑制Smo。相反地，在存在Shh的情況下，Shh結(jié)合Ptc，Smo不再被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的Ci/Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核并作用為靶基因的轉(zhuǎn)錄活化劑。對(duì)Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑沒(méi)有給予具體限定，只要其能增強(qiáng)Shh介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例可包括屬于刺猬蛋白家族(例如Shh)的蛋白，Ptc對(duì)Smo抑制功能的抑制劑，Smo受體活化劑，Shh受體活化劑(例如Hg-Ag，purmorphamine等)，增加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)，Ci/Gli蛋白細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑和通過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的Shh超表達(dá)構(gòu)建體或Ci/Gli超表達(dá)構(gòu)建體。

在本發(fā)明中，可以使用任意Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，只要其能夠活化Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其實(shí)例可包括Shh，Smo受體活化劑，Ptc對(duì)Smo抑制功能的抑制劑，增加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)，Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑，和Shh受體活化劑，Hg-Ag或purmorphamine，但不限于此。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的更具體的實(shí)例可包括Shh和purmorphamine。

在本發(fā)明中，用于誘導(dǎo)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)基中Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的含量為0.1ng/mL至5,000ng/mL，具體地1ng/mL至2,500ng/mL，更具體地10ng/mL至1,000ng/mL，和最具體地250ng/mL，但不特別限于此。

步驟(b)可進(jìn)行1天至200天。

為高效分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，方法可以還包括步驟(c)：將步驟(b)中培養(yǎng)的細(xì)胞在通過(guò)向步驟(b)的培養(yǎng)集中添加RA(視黃酸)而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“RA(視黃酸)”是指親脂性分子維生素A的代謝產(chǎn)物。存在兩類RA：全反式視黃酸和9-順式視黃酸。RA被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)其分別結(jié)合RAR(視黃酸受體)和RXR(類視色素X受體)，并參與靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，但不限于此。

用于本發(fā)明的方法的RA可以是反式視黃酸和順式視黃酸，待使用的RA濃度可以為0.5ng/mL至10,000ng/mL，具體地5ng/mL至5,000ng/mL，更具體地50ng/mL至2,000ng/mL，和更具體地500ng/mL，但不特別限于此。

步驟(c)可進(jìn)行1天至120天，但不限于此。

本發(fā)明的方法可以還包括步驟(d)：在通過(guò)從步驟(c)的培養(yǎng)基中移除選自IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA中的一種或多種，兩種或更多種，或三種，更具體地通過(guò)全部移除IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，盡管經(jīng)歷成熟期的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在沒(méi)有IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，它們顯示與在含有所有這些組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相當(dāng)?shù)某墒於取?/p>

此外，本發(fā)明的方法可以還包括確定在上述步驟之后的所需細(xì)胞例如，步驟(a)之后的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，是否分化的步驟，或確定步驟(b)、(c)或(d)之后的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否分化的步驟。

可以通過(guò)測(cè)量細(xì)胞特異性的標(biāo)志物基因的表達(dá)和/或通過(guò)鑒定形態(tài)學(xué)特征和/或生理學(xué)特征來(lái)確定所需細(xì)胞的分化，特別是未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化。

可以通過(guò)測(cè)量標(biāo)志物基因的mRNA或蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)志物基因表達(dá)的測(cè)量，并且可以使用多種領(lǐng)域內(nèi)已知方法進(jìn)行表達(dá)水平的測(cè)量。

可以在本發(fā)明中不受限制地使用分析標(biāo)志物基因表達(dá)的mRNA水平的任意技術(shù)，只要其是領(lǐng)域內(nèi)公知的分析mRNA的方法。其實(shí)例可以包括逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Rnase保護(hù)測(cè)定，Northern印跡和DNA芯片測(cè)定。

可以在本發(fā)明中不受限制地使用分析標(biāo)志物基因表達(dá)的蛋白水平的任意技術(shù)，只要其是領(lǐng)域內(nèi)公知的分析蛋白的方法。其實(shí)例可以包括免疫印跡、ELISA、放射免疫測(cè)定、放射免疫擴(kuò)散法、Ouchterlony免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、FACS和蛋白芯片測(cè)定。

與分化前的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的分化的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)以下特征：(1)Brn3B的表達(dá)水平增加；(2)Brn3A的表達(dá)水平增加；(3)Islet1的表達(dá)水平增加；(4)NF200的表達(dá)水平增加；(5)TuJ1的表達(dá)水平增加；(6)Thy1.2的表達(dá)水平增加；(7)TrkB的表達(dá)水平增加；(8)NMDAR1的表達(dá)水平增加；(9)Map2的表達(dá)水平增加；(10)Vglut1的表達(dá)水平增加；(11)PSD-95的表達(dá)水平增加；(12)突觸小泡蛋白的表達(dá)水平增加；以及(13)突觸蛋白1的表達(dá)水平增加。

可以利用針對(duì)由基因編碼的蛋白的抗體或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法如RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的增加或降低。隨著它們表現(xiàn)出更多的特征，分化的細(xì)胞被定義為更接近成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。優(yōu)選地，成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)，具體地2個(gè)或更多個(gè)，更具體地3個(gè)或更多個(gè)，更具體地4個(gè)或更多個(gè)和最具體地5個(gè)或更多個(gè)特征。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法分化后，多于大約40％、60％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞群具有所期望的特征。更高的比例是更優(yōu)選的，但不限于此。

本發(fā)明的另一方面提供了使未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法，其包括在含有IGF1R活化劑和Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。

未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與上文所述相同。

未應(yīng)用于使未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法的培養(yǎng)基特征為不包含Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。

在該方法中，IGF1R活化劑可以具體地以0.01ng/mL至100ng/mL的量使用，更具體地以0.1ng/mL至50ng/mL的量使用，更具體地以1ng/mL至20ng/mL的量使用，和最具體地以10ng/mL的量使用，但不特別限于此。

在該方法中，Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑可以具體地以0.1ng/mL至5,000ng/mL的量使用，更具體地以1ng/mL至2,500ng/mL的量使用，更具體地以10ng/mL至1,000ng/mL的量使用，和最具體地以250ng/mL的量使用，但不特別限于此。

此外，培養(yǎng)基可以為除上述物質(zhì)之外還包含1％B27補(bǔ)充物和1％N2補(bǔ)充物的DMEM/F12培養(yǎng)基，但不限于此。

方法可以還包括在通過(guò)包含IGF1R活化劑和Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中添加RA(視黃酸)而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。此處，“添加”可以解釋為用包含上述物質(zhì)和之前的培養(yǎng)基組成的新鮮培養(yǎng)基替換之前的培養(yǎng)基，以及向培養(yǎng)基添加物質(zhì)。

此處，RA與上述相同，并且待使用的RA的濃度可以是0.5nM至10,000nM，更具體地5nM至5,000nM，更具體地50nM至2,000nM，和更具體地500nM，但不特別限于此。

方法可以還包括以下步驟：在通過(guò)從上述培養(yǎng)基中移除選自IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA中的一種或多種，更具體地通過(guò)全部移除IGF1R活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本發(fā)明的又一方面提供了根據(jù)本發(fā)明的上述方法制備的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

方法、未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與上述相同。

本發(fā)明的又一方面提供了篩選成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的方法，其包括(a)用成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑候選物或增殖促進(jìn)劑候選物處理通過(guò)上述分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法獲得和分離的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)當(dāng)與非候選物處理組比較，所述候選物抑制成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡或促進(jìn)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖時(shí)，確定所述候選物是成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑。

分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法和成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與上述相同。

步驟(a)是用成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑候選物或增殖促進(jìn)劑候選物處理通過(guò)上述分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的方法獲得和分離的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。

待被候選物處理的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以是，但不特別限于此，通過(guò)向來(lái)自健康人或患者的干細(xì)胞應(yīng)用本發(fā)明的方法分化的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

本文所用術(shù)語(yǔ)“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑”是指能夠抑制成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡的物質(zhì)。具體地，死亡抑制劑可包括與未應(yīng)用死亡誘導(dǎo)條件的細(xì)胞相比，能夠減少應(yīng)用成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)條件的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡的物質(zhì)。死亡抑制劑的類型不受特別限制，并且死亡抑制劑包括化合物、蛋白質(zhì)、肽和核酸。

本文所用術(shù)語(yǔ)“成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖促進(jìn)劑”是指能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖的物質(zhì)。具體地，增殖促進(jìn)劑可包括與未應(yīng)用增殖促進(jìn)劑的細(xì)胞相比，能夠增加應(yīng)用增殖促進(jìn)劑的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖的物質(zhì)。增殖促進(jìn)劑的類型不受特別限制，并且增殖促進(jìn)劑包括化合物、蛋白質(zhì)、肽和核酸。

本發(fā)明的方法可包括步驟(b)：當(dāng)與非候選物處理組比較，所述候選物抑制成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡或促進(jìn)成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖時(shí)，確定所述候選物是成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑。此外，成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑可以是青光眼或視神經(jīng)病變的治療劑。

本文所用術(shù)語(yǔ)“青光眼”是指伴隨視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失的視神經(jīng)損傷。

本文所用術(shù)語(yǔ)“視神經(jīng)病變”是指由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其構(gòu)成視網(wǎng)膜的軸突的逐漸損失引起的視覺(jué)障礙導(dǎo)致的疾病。視神經(jīng)病變包括視神經(jīng)炎、缺血性視神經(jīng)病變、毒性或缺陷性視神經(jīng)病變、遺傳性視神經(jīng)病變、和視神經(jīng)萎縮。

如上所述，青光眼和視神經(jīng)病變是伴有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失的疾病，因此能夠抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡或促進(jìn)其增殖的物質(zhì)可以用作青光眼或視神經(jīng)病變的治療劑。

本發(fā)明的又一方面提供了篩選成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的試劑盒，其包括通過(guò)上述本發(fā)明的方法制備的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。此外，該試劑盒可用于篩選青光眼或視神經(jīng)病變的治療劑。

成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、死亡抑制劑和增殖促進(jìn)劑與上述相同。

試劑盒可包括領(lǐng)域內(nèi)已知的能夠篩選視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡抑制劑或增殖促進(jìn)劑的多種工具和/或試劑，以及成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。如果需要，試劑盒可以還包括用于混合各種組分的管，帶孔板和描述其使用的說(shuō)明書(shū)。

可以用于該方法的實(shí)驗(yàn)程序、試劑和反應(yīng)條件可以是領(lǐng)域內(nèi)公知的那些，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。

本發(fā)明的又一方面提供了用于治療青光眼或視神經(jīng)病變的藥物組合物，其包含通過(guò)上述本發(fā)明的方法制備的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、青光眼和視神經(jīng)病變與上述相同。

用于本發(fā)明的治療組合物，在體外誘導(dǎo)從干細(xì)胞如人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化，大量增殖和分化為熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，然后向具有上述疾病的患者施用。治療組合物可以配制成領(lǐng)域內(nèi)通常的劑型，例如可注射制劑。組合物可以利用手術(shù)方法直接植入視網(wǎng)膜位置，或者可以通過(guò)靜脈注射并移至視網(wǎng)膜位置。本發(fā)明的治療組合物還可包含免疫抑制劑以抑制對(duì)植入物的免疫排斥反應(yīng)。組合物還可包含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的治療組合物的施用劑量可根據(jù)患者的嚴(yán)重程度，施用的途徑、方法和頻率，治療的時(shí)間段，患者的年齡、性別和疾病嚴(yán)重程度而變化，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的多種因素容易地確定。

本發(fā)明的又一方面提供了治療青光眼或視神經(jīng)病變的方法，其包括向疑似患有青光眼或視神經(jīng)病變的個(gè)體施用通過(guò)本發(fā)明的方法制備的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的步驟。

方法、成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、青光眼和視神經(jīng)病變與上述相同。

可以向任意動(dòng)物施用本發(fā)明的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，動(dòng)物可包括家畜，如牛、豬、羊、馬、狗、小鼠、大鼠、貓等，以及人和靈長(zhǎng)目。

本文所用術(shù)語(yǔ)“施用”是指通過(guò)合適的途徑向疑似患有青光眼或視神經(jīng)病變的個(gè)體引入本發(fā)明的組合物，包括分化的細(xì)胞的移植。使本發(fā)明的組合物能夠到達(dá)目的組織的任何給藥途徑都可以用于本發(fā)明中。優(yōu)選視網(wǎng)膜內(nèi)注射。

本發(fā)明的又一方面提供了制備成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體)活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；以及(b)在通過(guò)從步驟(a)的培養(yǎng)基移除Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和向其添加IGF1R活化劑而制備的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

培養(yǎng)基可以還包含Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑或RA(視黃酸)或以上二者。

此外，該方法可以還包括分離自包含IGF1R活化劑和Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，然后在(i)包含L-谷氨酰胺、巰基乙醇、和胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒-X的培養(yǎng)基,或(ii)包含L-谷氨酰胺、巰基乙醇、FGF2、IGF-1和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)基可以是包含L-谷氨酰胺、巰基乙醇、和胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒-X的IMDM培養(yǎng)基,或包含L-谷氨酰胺、巰基乙醇、FGF2、IGF-1和EGF的IMDM培養(yǎng)基。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用包含IMDM、15％FBS、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM巰基乙醇、和1％胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒-X的培養(yǎng)基1,和包含IMDM、15FBS、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM巰基乙醇、5ng/mL FGF2、10ng/mL IGF-1和5ng/mL人重組EGF的培養(yǎng)基2。

發(fā)明的實(shí)施方式

下文中，將參照實(shí)施例詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅為示例目的，本發(fā)明不意欲被這些實(shí)施例限制。

實(shí)施例1：干細(xì)胞的培養(yǎng)

<1-1>人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

人胚胎干細(xì)胞(hESC)系H9(WA09，正常核型XX)和H7(WA07，正常核型XX)購(gòu)自WiCell Research Institute(Madison,WI)。

通過(guò)在以下培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)使人胚胎干細(xì)胞發(fā)生未分化的增殖(H9細(xì)胞：第26-41代；H7細(xì)胞：第23-32代)：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen,Grand Island,NY)液體，20％(v/v)KnockOut血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和4ng人重組FGF2(人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,Invitrogen)]，所述飼養(yǎng)細(xì)胞例如輻射過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF,Global Stem,Gaithersburg,MD)或絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts,Millipore,Billerica,MA)。

每天更換培養(yǎng)基，每隔6或7天手動(dòng)或用膠原酶V(膠原酶IV，Invitrogen)以1:15至1:18的比例對(duì)未分化的干細(xì)胞(圖1A)進(jìn)行傳代，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞上。在人胚胎干細(xì)胞傳代期間，用未分化的人胚胎干細(xì)胞特有的抗原OCT-4和SSEA-4(Chemicon,Temecula,CA)在固定的時(shí)間間隔進(jìn)行免疫化學(xué)染色，以監(jiān)測(cè)分化的程度。去除所發(fā)現(xiàn)的已進(jìn)行分化的細(xì)胞。同時(shí)，定期用MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒(Lonza,Rockland,ME)監(jiān)測(cè)胚胎干細(xì)胞系中支原體污染物的存在，該污染物能對(duì)人胚胎干細(xì)胞的分化造成不利影響。

<1-2>人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的生成和培養(yǎng)

通過(guò)使用附加體質(zhì)粒載體將干細(xì)胞基因(SOX2、KLF4、OCT4、L-MYC、LIN28、和p53的小發(fā)夾RNA)轉(zhuǎn)染進(jìn)BJ1成纖維細(xì)胞(新生兒包皮成纖維細(xì)胞，ATCC)來(lái)制備人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Okita,Natmethod 2011；8:409)。通過(guò)在以下培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)使人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞發(fā)生未分化的增殖(第5-9代)：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen,Grand Island,NY，USA)液體，20％(v/v)KnockOut血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和4ng人重組FGF2(Invitrogen)]，所述飼養(yǎng)細(xì)胞例如輻射過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF,Global Stem,Gaithersburg,MD，USA)或絲裂霉素處理的小鼠SNL細(xì)胞(SNL 76/7細(xì)胞系,ECACC,Porton Down,UK)。

每天更換培養(yǎng)基，每隔6或7天手動(dòng)或用膠原酶IV(Invitrogen)以1:12至1:15的比例對(duì)未分化的干細(xì)胞(圖2A)進(jìn)行傳代，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞上。在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代期間，用未分化的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞特有的抗原堿性磷酸酶(Sigma-Aldrich)、NANOG(Abcam,Cambridge,MA)和SSEA-4(Chemicon,Temecula,CA)在固定的時(shí)間間隔進(jìn)行免疫化學(xué)染色(圖2B和2C)，以監(jiān)測(cè)分化的程度。去除經(jīng)鑒定已進(jìn)行分化的細(xì)胞。為評(píng)估未分化的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能性，進(jìn)行畸胎瘤測(cè)定。將1×10⁷個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞植入免疫抑制的模型rd/SCID小鼠的背部表面之后10周，移除由此形成的畸胎瘤，然后H&E染色(圖2D)。

同時(shí)，定期用MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒(Lonza,Rockland,ME)監(jiān)測(cè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中支原體污染物的存在，該污染物能對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化造成不利影響。

實(shí)施例2：從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向眼區(qū)前體細(xì)胞的分化

首先，從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離通過(guò)實(shí)施例1的方法培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)移至6孔超低吸附平板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)。

向6孔超低吸附平板中的人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞添加能誘導(dǎo)向眼區(qū)前體細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12，10％KnockOut血清替代物，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，0.1mM巰基乙醇，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1ng/mL重組頭蛋白(R&D Systems)，1ng/mL重組Dkk-1(重組Dickkopf-1,R&D Sytstems)和5ng/mL重組IGF-1(重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-1,R&D Systems)]。在第3天吸去培養(yǎng)基，然后用新鮮培養(yǎng)基替換，培養(yǎng)細(xì)胞4天至5天以在培養(yǎng)基中生成懸浮聚集物形式的眼區(qū)前體細(xì)胞(圖1B，3)。

實(shí)施例3：從眼區(qū)前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化

將實(shí)施例2中產(chǎn)生的眼區(qū)前體細(xì)胞(懸浮聚集物)以每孔53±8個(gè)細(xì)胞的密度(292±53個(gè)細(xì)胞/懸浮聚集物)接種至6孔聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板(BD Biosciences)，并以每孔30±5個(gè)細(xì)胞的密度接種至12孔聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板，并以每孔12±4個(gè)細(xì)胞的密度接種至8孔聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板，然后提供能誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL Dkk-1，10ng/mL頭蛋白，10ng/mL IGF-1和5ng/mL FGF2](方案A)(圖3和4)，培養(yǎng)10天，以產(chǎn)生視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(圖1C)。通過(guò)供應(yīng)本培養(yǎng)基7天進(jìn)行方案B(圖5)和方案C(圖6)。

實(shí)施例4：從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的分化

將實(shí)施例3中所產(chǎn)生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在誘導(dǎo)向未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL頭蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重組Wnt3a(重組Wnt3a，R&D Systems)]中培養(yǎng)3天，從而產(chǎn)生未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(圖1D，3至5)。通過(guò)供應(yīng)本培養(yǎng)基6天進(jìn)行方案C(圖6)。

實(shí)施例5：從未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化：步驟1

通過(guò)供應(yīng)分化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/ml重組Shh(重組音猬因子氨基末端肽,Shh,R&D Systems)]5天誘導(dǎo)實(shí)施例4中產(chǎn)生的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(圖1E，3至6)。

實(shí)施例6：從未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化：步驟2

通過(guò)供應(yīng)分化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/ml Shh，500nM全反式視黃酸(RA,Sigma-Aldrich)]17天使實(shí)施例5中產(chǎn)生的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟(圖1E，3至6)。在實(shí)施例2-6中，每隔2或3天將所有培養(yǎng)基更換成新鮮的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在37℃下5％CO₂的環(huán)境中培養(yǎng)(圖1F，3至6)。本視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞直至第120天分化。

實(shí)施例7：細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的測(cè)定

<7-1>細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)的免疫化學(xué)染色和鑒定

利用如下的免疫化學(xué)染色法檢測(cè)實(shí)施例3至6中所獲得的細(xì)胞的分化。

在與用于向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化相同的條件下，在8孔聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的載片(BD Biosciences,Bedford,MA)中培養(yǎng)眼區(qū)前體細(xì)胞(懸浮聚集物)。用4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定每步中充分培養(yǎng)的細(xì)胞，之后用含有3％BSA(Jackson Immunoresearch Laboratory,Bar Harbor,ME,USA)和0.25％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS封閉非特異性反應(yīng)。

在封閉90分鐘之后，在4℃下利用表1中給出的對(duì)每個(gè)分化步驟的細(xì)胞特異的抗體過(guò)夜孵育每個(gè)分化步驟的載片。在使用前，這些抗體在含有1％BSA和0.25％Triton X-100的PBS溶液中稀釋。用PBS將每步載片上培養(yǎng)的細(xì)胞洗滌三次，每次5分鐘，并用與Cy3偶聯(lián)的種特異性二抗(1:800,Jackson Immunoresearch Laboratory)或與Alexa488偶聯(lián)的種特異性二抗(1:500,Invitrogen)在室溫下孵育2小時(shí)(表1)。適于作為一抗和二抗的標(biāo)準(zhǔn)材料用來(lái)檢測(cè)非特異性染色或抗體間的相互作用。然后，用PBS將細(xì)胞洗滌三次，每次5分鐘，用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)復(fù)染并在Vectashield(Vector Laboratories)中封片，隨后在落射熒光顯微鏡(Nikon Eclipse,E800,Tokyo,Japan)和共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM510,Carl Zeiss,Inc,Thornwood,NY,USA)下顯像。從在400倍放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇的20個(gè)顯微鏡視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并評(píng)價(jià)對(duì)每種抗體的陽(yáng)性應(yīng)答。在評(píng)價(jià)至少三次之后，確定對(duì)抗體的陽(yáng)性應(yīng)答。

<7-2>細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)和鑒定

在誘導(dǎo)分化后第17天和第39天通過(guò)0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)分離細(xì)胞。用Cytofix/Cytoperm緩沖溶液(Biosciences)固定細(xì)胞，并用Perm/Wash緩沖溶液(BD Biosciences)洗滌。細(xì)胞與一抗在4℃反應(yīng)30分鐘，并與二抗在4℃反應(yīng)20分鐘(表1)。通過(guò)FACSCalibur(BDBiosciences)和FlowJo軟件(Treestar)分析反應(yīng)樣品。

<7-3>通過(guò)免疫印跡的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的鑒定

在誘導(dǎo)分化后第39天用包含蛋白酶抑制劑的蛋白提取緩沖溶液溶解培養(yǎng)的細(xì)胞。使用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量總蛋白濃度。將等量的蛋白加樣至聚丙烯酰胺凝膠(任意kD Mini-PROTEAN TGX預(yù)制聚丙烯酰胺凝,Bio-Rad,Hercules,CA)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(Milipore,Billerica,MA)。將該膜與一抗(表1,Brn3B 1:1,000,Brn3A1:1,000,Tuj1 1:1000,NF200 1:1,000,肌動(dòng)蛋白1:2,000)和二抗(HRP-偶聯(lián)的二抗，羊抗小鼠或抗兔IgG,1:2,000稀釋,Santa Cruz,CA)反應(yīng)，然后使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Amersham ECL,GE Healthcare Lifetechnology,Piscataway,NJ)檢測(cè)反應(yīng)的蛋白。

表1

*ICF:免疫細(xì)胞熒光染色

作為鑒定分化相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)的結(jié)果，在誘導(dǎo)分化后第17天的實(shí)施例4的方案A獲得的細(xì)胞的標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖2A)顯示視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)志物Rax-和Pax6陽(yáng)性的細(xì)胞分別為95.8±1.4％和93.8±0.7％(圖7A)。同時(shí)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Math5、Brn3B-和Brn3A陽(yáng)性的細(xì)胞分別為95.2±1.2％、96.8±0.6％和97.5±0.9％。在小鼠中，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞早期表達(dá)的Math5已知從胚胎(E)第11天至出生后第1天可檢測(cè)，并且Brn3B和Brn3A已知在胚胎發(fā)育期間視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的時(shí)間可檢測(cè)并持續(xù)它們一生。此外，這些標(biāo)志物在大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中共表達(dá)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型的標(biāo)志物Islet-1可檢測(cè)為16.4±2.7％。在誘導(dǎo)分化后第17天，免疫熒光染色結(jié)果和陽(yáng)性率與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。在大多數(shù)細(xì)胞的核中，Math5和Brn3B被強(qiáng)烈染色(圖7B和7C)。Brn3A(核染色)陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)對(duì)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物Tuj1為陽(yáng)性(98.2±0.4％)(表2A，圖7D)，指示它們分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其為神經(jīng)元的一種。對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突中表達(dá)的NF200陽(yáng)性的細(xì)胞的約1/5對(duì)Islet-1為陽(yáng)性，Islet-1為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型的標(biāo)志物(表2A，圖7E)。全部視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的1/3報(bào)告為Islet-1陽(yáng)性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。尚未觀察到軸突和樹(shù)突樹(shù)、環(huán)和棘突的成熟特征。

在誘導(dǎo)分化后第39天實(shí)施例6的方案A獲得的細(xì)胞的標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(表2B，圖8)表明Pax6-陽(yáng)性細(xì)胞為82.3±3.5％。已知Pax6在視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中表達(dá)，并且在分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之后也持續(xù)表達(dá)(圖9A)。Math5-,Brn3B(圖9B,9F,9G)-,和Brn3A(圖9C,9D,9H)-陽(yáng)性細(xì)胞分別為77.3±2.7％,84.7±0.8％,89.9±2.3％。似乎Math5在細(xì)胞分化后降低。在誘導(dǎo)分化后第17天Islet-1陽(yáng)性細(xì)胞為16.4±2.7％，并在誘導(dǎo)分化后第39天增加至32.8±7.1％，指示全部視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的1/3為Islet-1陽(yáng)性(圖9E)。同時(shí)，在誘導(dǎo)分化后第17天細(xì)胞增殖標(biāo)志物KI67-陽(yáng)性細(xì)胞從81.0±3.5％顯著降低至18.4±3.5％。免疫熒光染色結(jié)果表明，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到軸突環(huán)和棘突，以及樹(shù)突樹(shù)、環(huán)和棘突，指示成熟(圖9F至9I)。該成熟在誘導(dǎo)分化后第59天進(jìn)一步進(jìn)展(圖10)。

免疫印跡分析的結(jié)果也表現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Brn3B和Brn3A以及神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NF200和Tuj1的強(qiáng)烈表達(dá)，與免疫化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相同(圖9J)。

表2

在根據(jù)實(shí)施例5和實(shí)施例6的方案B(圖5)和方案C(圖6)的誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化后第39天，鑒定標(biāo)志物蛋白表達(dá)。細(xì)胞標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(表3A和3B)表明對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Math5、Brn3B和Brn3A以及神經(jīng)元軸突和樹(shù)突標(biāo)志物Tuj1和NF200陽(yáng)性的細(xì)胞與原型方案A的細(xì)胞類似，但亞型標(biāo)志物Islet-1陽(yáng)性細(xì)胞在方案B和C中降低至12.4±2.5％和7.8±1.6％。另一方面，通過(guò)免疫熒光染色檢查細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果是，與方案A相比，根據(jù)方案B分化的細(xì)胞顯示與根據(jù)方案A的細(xì)胞類似的軸突和樹(shù)突陽(yáng)性率和成熟度，但較低的具有電功能的突觸前和突觸后囊泡陽(yáng)性率(圖11)。根據(jù)方案C分化的細(xì)胞表現(xiàn)突觸前和突觸后囊泡的頻繁產(chǎn)生，但相對(duì)較低的軸突和樹(shù)突成熟度(圖12)。

表3

除H9之外，人胚胎干細(xì)胞系H7和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞也根據(jù)實(shí)施例6的方案A分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化后第39天，進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果是，Math5-、Brn3B-和Brn3A-陽(yáng)性的人胚胎干細(xì)胞H7百分比分別為95.0％,90.2％和94.4％，與H9細(xì)胞系相同(表4A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示軸突和樹(shù)突的成熟特征和具有電功能的突觸前和突觸后囊泡的頻繁產(chǎn)生(圖13)。

Math5-、Brn3B-和Brn3A-陽(yáng)性的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞百分比分別為73.0％、61.4％和77.0％，比H9細(xì)胞系相對(duì)較低(表4B)。免疫熒光染色結(jié)果顯示軸突和樹(shù)突的成熟特征和具有電功能的突觸前和突觸后囊泡的頻繁產(chǎn)生(圖14)。

表4

實(shí)施例8：從人多能干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電生理學(xué)性質(zhì)和功能的測(cè)試

通過(guò)以1mL/min至1.5mL/min的速率向記錄室注入人工腦脊髓液在32±1℃進(jìn)行完整細(xì)胞電壓記錄和電流鉗記錄。人工腦脊髓液由125mM NaCl、25mM NaHCO₃、2.5mM KCl、1.25mM NaH₂PO₄、2mMCaCl₂、1mM MgCl₂、20mM葡萄糖、1.2mM丙酮酸鹽和0.4mM Na-抗壞血酸組成，并在pH 7.4用95％O₂和5％CO₂飽和。使用具有3.5MΩ至4.5MΩ尖端電阻的貼片吸管。完整細(xì)胞配置之后的系列電阻為10MΩ至15MΩ。使用EPC-10放大器(HEKA,Lambrecht-Pfalz,Germany)進(jìn)行記錄，并且在記錄時(shí)使用包含143mM K-葡萄糖鹽、7mM KCl,15mM HEPES、4mM MgATP、0.3mM NaGTP、4mM Na-抗壞血酸和0.1mM EGTA的吸管溶液，并用KOH將pH值調(diào)至7.3。在-70mV的保持電位記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)。為鑒定自發(fā)性突觸后電流的模式，向?qū)嶒?yàn)室的水浴溶液(Sigma-Aldrich)中注入6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX,50μM),D-(-)-2-氨基-5-膦?；焖?AP5,50μM)和(+)-荷包牡丹堿(50μM)。CNQX阻斷AMPA受體，AP5阻斷NMDA受體并且荷包牡丹堿阻斷GABA受體。Na⁺電流被河豚毒素(TTX,1μM)阻斷，并且K⁺電流被4-氨基吡啶(4-AP,1mM)(Sigma-Aldrich)阻斷。

<8-1>從人多能干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電生理學(xué)性質(zhì)的測(cè)試

為測(cè)試根據(jù)本發(fā)明分化的人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電性質(zhì)，首先評(píng)估根據(jù)方案A分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化后第39天動(dòng)作電位的評(píng)估中，觀察到響應(yīng)于步階電流注入的強(qiáng)烈規(guī)則尖峰的動(dòng)作電位序列(圖15A)。完整細(xì)胞貼片鉗記錄的結(jié)果顯示電壓門(mén)控鈉通道的存在，其被河豚毒素阻斷(圖15B)。因此，確認(rèn)了人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化為電可興奮的細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化后第59天動(dòng)作電位的評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)于步階電流注入的動(dòng)作電位比誘導(dǎo)分化后第39天的動(dòng)作電位更成熟(圖16B)。報(bào)道了在胚胎發(fā)育期間，神經(jīng)元在數(shù)天內(nèi)發(fā)育成熟纖維細(xì)胞(firing cell)。在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)相同過(guò)程(Connors et al.1982；McCormick&Prince,1987)。在根據(jù)方案B(圖17A)和方案C(圖18A)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(圖20)中也觀察到類似結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的方案分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞顯示隨時(shí)間增加的電成熟和功能。

<8-2>從人多能干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的電生理學(xué)功能的測(cè)試

根據(jù)本發(fā)明從人多能干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成功能性興奮性突觸。突觸發(fā)生是神經(jīng)網(wǎng)膜發(fā)育中的關(guān)鍵步驟。使用可視化突觸前和突觸后蛋白定位的超高分辨率顯微鏡檢測(cè)人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的生理突觸的形成。突觸被定義為通過(guò)MAP2染色檢測(cè)的樹(shù)突周圍發(fā)現(xiàn)的數(shù)百納米直徑的區(qū)域，其中對(duì)突觸前和突觸后部分特異的蛋白并置。使用針對(duì)突觸前和突觸后蛋白的抗體鑒定突觸：使用針對(duì)興奮性谷氨酸能突觸后蛋白PSD-95(谷氨酸能突觸后密度蛋白95)和突觸前蛋白突觸蛋白1的抗體。從多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的PSD-95中心沿樹(shù)突或在其100nm范圍內(nèi)豐富，并與突觸前囊泡突觸蛋白1并置，但不重疊(圖10G和10H)。還在從另一人胚胎肝細(xì)胞系H7(圖13G和13H)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(圖14K和14L)來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這些，指示人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的生理突觸的形成。

同時(shí)，電生理學(xué)地評(píng)估細(xì)胞之間形成的生理突觸。在誘導(dǎo)分化后第39天未與其他視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中檢測(cè)到自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)(圖15C)，指示在人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間功能性興奮性突觸的形成。此外，當(dāng)在誘導(dǎo)分化后第59天評(píng)估時(shí)，sEPSC的頻率和尖峰的深度增加(圖16E)，暗示神經(jīng)元成熟隨時(shí)間進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)sEPSC被CNQX阻斷，表明它們是AMPA介導(dǎo)的興奮性谷氨酸能神經(jīng)元之一。在根據(jù)方案B(圖17B)和方案C(圖18B)分化的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中觀察到類似結(jié)果。

實(shí)施例9：從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜光受體細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化的方案之間的比較

本發(fā)明人在之前的專利中公開(kāi)了從干細(xì)胞分化視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法(韓國(guó)專利第10-1268741號(hào)(2013.05.22.)和WO2011/043591(2011.04.14))。

根據(jù)上述文檔中公開(kāi)的方法，從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞到光受體細(xì)胞的分化最大為約80％。然而，它們到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化部分進(jìn)展至僅約6％。

<9-1>從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜光受體細(xì)胞的分化

以與實(shí)施例1至3中相同的方式進(jìn)行從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向眼區(qū)前體細(xì)胞和視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化。

在誘導(dǎo)分化后第13天，通過(guò)供應(yīng)向光受體細(xì)胞前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL頭蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重組Wnt3a(重組Wnt3a，R&DSystems)]5天，使實(shí)施例3中所產(chǎn)生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為光受體細(xì)胞前體細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化后第18天，向光受體細(xì)胞前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基中加入250ng/mL重組Shh(重組音猬因子氨基末端肽，Shh,R&DSystems)，然后使細(xì)胞分化5天成為光受體細(xì)胞。在誘導(dǎo)分化后第21天，向光受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入500nM視黃酸(RA)，并培養(yǎng)29天以使產(chǎn)生的光受體細(xì)胞成熟。在光受體細(xì)胞的培養(yǎng)持續(xù)至第29天之后的情況下，持續(xù)供應(yīng)包含Wnt3a、Shh和RA的培養(yǎng)基。在通過(guò)該方法產(chǎn)生的細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果中，光受體細(xì)胞為80％或更多，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為約6％。

<9-2>從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化

以與眼區(qū)前體細(xì)胞的分化相同的方式進(jìn)行人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化，和以與光受體細(xì)胞的分化相同的方式進(jìn)行向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化，除了在誘導(dǎo)分化后第14天開(kāi)始供應(yīng)50ng/mL重組Wnt3a 3天，然后移除。在移除Wnt3a之后供應(yīng)Shh和RA。即，在開(kāi)始分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之后，當(dāng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化和成熟時(shí)，在每個(gè)階段需要移除了Wnt3a和添加了Shh和RA的培養(yǎng)基。

在通過(guò)該方法產(chǎn)生的細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果中，沒(méi)有觀察到光受體細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物Crx和Ret-P1。

實(shí)施例10：從未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化：步驟2

可以使用實(shí)施例6的分化方法使實(shí)施例6中獲得的成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟，但它們也可以使用通過(guò)在誘導(dǎo)分化后第39天從上述分化培養(yǎng)基中移除IGF-1、Shh和視黃酸而制備的培養(yǎng)基成熟。在誘導(dǎo)分化后第96天進(jìn)行電生理學(xué)分析以評(píng)估成熟度(圖19)。此外，在誘導(dǎo)分化后第32天以相同方式使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟，并且因此，它們表現(xiàn)出與在包含IGF-1、Shh和視黃酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相似的成熟度。

實(shí)施例11：通過(guò)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Shh受體活化劑的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化

以與實(shí)施例1至3中相同的方式進(jìn)行從人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向眼區(qū)前體細(xì)胞或視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化。

在誘導(dǎo)分化后第14天，在包含2μM BIO(6-溴靛玉紅-3’-肟)或50ng/mL Norrin作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑代替50ng/mL重組Wnt3a的分化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL頭蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重組Wnt3a(R&DSystems)]中，使實(shí)施例3中所產(chǎn)生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞培養(yǎng)并分化為未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞3天。在誘導(dǎo)分化后第17天，在包含1μMpurmorphamine作為Shh受體活化劑代替250ng/mL Shh的分化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27補(bǔ)充物(Invitrogen)，1％N2補(bǔ)充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/mL重組Shh(R&D Systems)]中，使因此產(chǎn)生的未成熟的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)并分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞5天。在誘導(dǎo)分化后第22天，使用通過(guò)向上述分化培養(yǎng)基中添加500nM視黃酸(RA)而制備的培養(yǎng)基使成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟39天。

使用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物Islet-1和NF200進(jìn)行通過(guò)該方法產(chǎn)生的細(xì)胞的免疫熒光測(cè)定，結(jié)果與使用Wnt3a和Shh的結(jié)果一致(圖21)。

實(shí)施例12：在方案A分化方法中使用Wnt3a、Shh和RA的效果

為檢查在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生期間在方案A分化方法中使用的Wnt3a、Shh和RA各自的效果，根據(jù)方案A的分化計(jì)劃表處理各個(gè)因子，并且在誘導(dǎo)分化后第39天，使用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光測(cè)定(圖22)。

在誘導(dǎo)分化后第14天至第17天處理1μg/mL Wnt3a拮抗劑Dkk1代替Wnt3a，根據(jù)分化時(shí)間表處理Shh和RA，然后是免疫熒光測(cè)定。結(jié)果是，很難產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，因?yàn)闆](méi)有加入Wnt3a，并且視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的內(nèi)源Wnt3a被Dkk1抑制(所有標(biāo)志物陽(yáng)性率：小于2％)(圖22(A))。

但根據(jù)各自的分化計(jì)劃表處理Shh和RA而不處理Wnt3a時(shí)，通過(guò)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的內(nèi)源Wnt3a的作用產(chǎn)生少量的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(所有標(biāo)志物陽(yáng)性率：約10％至15％)(圖22(B))。

當(dāng)僅處理Wnt3a而不處理Shh和RA時(shí)，由于Wnt3a的作用而產(chǎn)生80％或更多的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。然而，由于缺乏Shh，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的直徑生長(zhǎng)和成束被推遲(參見(jiàn)NF200染色)。此外，由于缺乏RA，沒(méi)有觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突觸發(fā)生和樹(shù)突棘發(fā)育(參見(jiàn)TUJ1染色)(圖22(C))。

當(dāng)處理Wnt3a和Shh而不處理RA時(shí)，由于Wnt3a的作用而產(chǎn)生80％或更多的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，也觀察到Shh的作用。然而，由于缺乏RA，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突觸發(fā)生和樹(shù)突棘發(fā)育被抑制(參見(jiàn)TUJ1染色)(圖22(D))。

當(dāng)處理Wnt3a和RA而不處理Shh時(shí)，由于Wnt3a的作用而產(chǎn)生80％或更多的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但由于缺乏Shh，NF200陽(yáng)性的軸突的直徑生長(zhǎng)和成束被推遲(參見(jiàn)NF200染色)。

這些結(jié)構(gòu)表明Wnt3a的處理在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵作用。還證實(shí)了當(dāng)根據(jù)計(jì)劃表適當(dāng)處理RA和Shh時(shí)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以良好分化。

實(shí)施例13：人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞系

從干細(xì)胞向成熟器官細(xì)胞的分化需要長(zhǎng)時(shí)間，依賴于專家的時(shí)間和努力并需要多種試劑。如果處于分化的最終階段或中間階段的細(xì)胞被建立為細(xì)胞系，可以顯著降低這種分化時(shí)間。即，如果需要成熟細(xì)胞，不是從干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，而是從建立的細(xì)胞系誘導(dǎo)分化，從而在短時(shí)間內(nèi)制備成熟細(xì)胞。為此目的，本發(fā)明人嘗試從最終分化階段的成熟細(xì)胞建立細(xì)胞系并最終成功。干細(xì)胞的分化伴隨著不對(duì)稱分裂。即，細(xì)胞分裂后的兩個(gè)子細(xì)胞具有不同的細(xì)胞命運(yùn)：原始干細(xì)胞的一個(gè)副本以及編程為分化為非干細(xì)胞命運(yùn)的第二子細(xì)胞。本發(fā)明的特征在于進(jìn)行分化的成熟細(xì)胞的繼代培養(yǎng)，使成熟的分化細(xì)胞由于環(huán)境改變而死亡和增殖具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞系的建立。具體地，建立同時(shí)具有原始分化的細(xì)胞和干細(xì)胞的性質(zhì)的中間階段細(xì)胞系是重點(diǎn)。

在誘導(dǎo)分化后第32天和第39天通過(guò)0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)分離細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞以1.5×10⁴至1.6×10⁴/cm²的密度接種在含有一種下述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、盤(pán)或平板上。下述兩種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2)在細(xì)胞增殖能力，傳代次數(shù)和時(shí)間方面彼此相同。細(xì)胞在5％二氧化碳(CO₂)和37℃下培養(yǎng)，每2天至每3天更換下述培養(yǎng)基。每3天至每4天用0.05％胰蛋白酶處理以1:6至1:10的比例對(duì)增殖的細(xì)胞進(jìn)行傳代。

培養(yǎng)基1:[IMDM(Invitrogen),15％FBS,1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich),1％胰島素/運(yùn)鐵蛋白/硒-X(Invitrogen)]。

培養(yǎng)基2:[IMDM(Invitrogen),15％FBS,1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0.1mM巰基乙醇(Sigma-Aldrich),5ng/mL FGF2,10ng/mL IGF-1,5ng/mL人重組EGF(人重組表皮生長(zhǎng)因子Peprotech,Rocky Hill,NJ)]。

細(xì)胞培養(yǎng)至第20代(p20)，培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2中傳代的所有細(xì)胞在體外顯示神經(jīng)元形態(tài)(圖23)。將第15代至第17代(p15至p17)的人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系用于評(píng)估它們的細(xì)胞特性和神經(jīng)元功能。通過(guò)實(shí)施例7的方法進(jìn)行使用針對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的免疫熒光測(cè)定，通過(guò)活細(xì)胞Ca²⁺成像評(píng)估神經(jīng)元功能。

對(duì)于鈣成像，用Tyrode's溶液(119mM NaCl,2.5mM KCl,2mMCaCl₂,2mM MgCl₂,25mM HEPES,30mM葡萄糖,pH 7.4)洗滌在18mm蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞兩次或三次，然后添加1μM Fluo-4-AM(Lifetechnologies,Carlsbad,CA,USA)在37℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)15分鐘后，用Tyrode's溶液洗滌細(xì)胞10分鐘。通過(guò)使用安裝有40倍(1.0NA)油鏡和EMCCD(iXon887,Andor Technologies,Belfast,Northern Ireland)的Olympus IX-71倒置顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)每0.5秒獲得時(shí)間差異圖像，持續(xù)30分鐘。從第10張圖像畫(huà)面，用1mM谷氨酸鹽刺激細(xì)胞。刺激之后，用Tyrode's溶液浸泡細(xì)胞。

免疫熒光測(cè)定的結(jié)果顯示表達(dá)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Math5(98.9％),Brn3B(52.4％)和Brn3A(99.7％)，還表達(dá)功能標(biāo)志物Thy1.2(86.1％),TrkB(44.0％)和NMDAR-1(97.0％)。還強(qiáng)烈表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1(100％)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突標(biāo)志物NF200(98.5％)。同時(shí)，還觀察到細(xì)胞增殖標(biāo)志物KI67(49.2％)，指示細(xì)胞系具有細(xì)胞增殖能力(圖24)。

通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣成像測(cè)試視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系的神經(jīng)元功能。用1μM fluor-4處理傳代的細(xì)胞并用1mM谷氨酸鹽刺激。結(jié)果是，大部分活細(xì)胞表現(xiàn)響應(yīng)于谷氨酸鹽刺激的細(xì)胞質(zhì)鈣水平顯著增加，指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系具有神經(jīng)元功能(圖25)。

基于以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明可以不同具體方式實(shí)施而不改變其技術(shù)精神或基本特征。因此，應(yīng)理解上述實(shí)施方案在所有方面不是限制性的，而是示例性的。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求定義而非由之前的描述定義，因此權(quán)利要求意欲包括落入權(quán)利要求邊界和范圍內(nèi)的所有改變和修改，或這些改變和修改的等同物。