本發(fā)明涉及一種蛋黃抗體的提純滅活方法，屬于生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：蛋黃抗體是指蛋黃中的免疫球蛋白(igy)。母雞在細胞分裂產(chǎn)蛋過程中會將血液中的免疫球蛋白轉(zhuǎn)移至雞蛋，如血液中的iga、igm會在輸卵管中與其他蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成雞蛋的蛋白部分，igg會經(jīng)蛋黃薄膜轉(zhuǎn)移至蛋黃內(nèi)部。由于蛋黃的igg與哺乳類的igg在相對分子質(zhì)量、等電點、細胞膜上fc受質(zhì)的鍵結(jié)構(gòu)上存在著相異點，因而被特定稱為igy。igy是一種7s免疫球蛋白，其相對分子質(zhì)量約為180kd，含兩個亞單位，即67～70kd的重鏈和22～30kd的輕鏈。雞蛋黃中igy的純度高，含量大，具有較強的耐熱、耐酸性和特異性，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)量高，成本低，并且具有動物種系發(fā)生學(xué)距離的優(yōu)勢，更適于生產(chǎn)特異性抗體。目前，igy常作為免疫學(xué)診斷工具，用于測定類風(fēng)濕因子、補體和血液循環(huán)中的免疫復(fù)合物，以減少假陽性反應(yīng)，同時還可用于igg亞類和病毒的檢測，此外還能作為免疫預(yù)防和治療劑。蛋黃中蛋白質(zhì)與脂肪的比例約為1:2，其中大部分蛋白是脂蛋白，存在于蛋黃顆粒中，不溶于水，只有α、β、γ免疫球蛋白是水溶性蛋白。而igy是一種γ球蛋白，因此igy的分離純化首先要去除卵黃中的脂類，再從水溶性蛋白中分離出igy，從而有效避免脂類氧化變質(zhì)及黏稠注射困難等問題。目前，從蛋黃中提取igy的方法包括氯仿法、聚乙二醇置換法、水稀釋法、辛酸法、硫酸銨法、層析法等，這些方法高效、經(jīng)濟，但又各有優(yōu)缺點。如氯仿法操作簡便、省時，除脂效果佳，但氣味較大，存在有機物殘留，且成本相對較高。聚乙二醇是一種非離子型水溶性聚合物，親水性較強，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，可利用抗體蛋白的親水和疏水特性分離得到蛋黃抗體，且不會引起蛋白變性，收率高、成本低，但同時澄清度和純度也較低。親硫性混合模式吸附層析是將混合模式吸附應(yīng)用到親硫?qū)游鲋校ㄟ^親硫?qū)游鑫絼┮牒s環(huán)，改變親硫?qū)游鱿鄬我坏奈阶饔?，增強吸附劑與抗體的結(jié)合能力，從而提高對抗體的特異性吸附，該方法操作簡單，收率高、成本低，但同時也存在吸附劑通用性差的缺點，針對某一分離對象需要制備專一的吸附劑和建立相應(yīng)的試驗條件。硫酸銨法與其他方法相比提取率低、澄清度低、純度低。并且，現(xiàn)有技術(shù)中制備蛋黃抗體的高免蛋大多為非spf蛋，在生產(chǎn)過程中極易染上傳染性致病菌和病毒，而這些致病微生物若被帶入到蛋黃抗體內(nèi)，將會帶來嚴重的微生物傳播問題。公開號cn102492035a的發(fā)明專利公開了一種卵黃抗體的制備方法，包括：無菌取出高免蛋的卵黃，在卵黃中按比例加入聚乙二醇溶液，充分混合后靜置，取上層清液；在上層清液中按比例加入甲醛溶液滅活，即得卵黃抗體。該方法操作簡單，制備成本低，但得到的卵黃抗體純度也較低，并且滅活抗體只能誘發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫，細胞免疫作用甚微。因此，開發(fā)一種新型的蛋黃抗體提純滅活技術(shù)尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種蛋黃抗體的提純滅活方法。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種蛋黃抗體的提純滅活方法，包括以下步驟：1)在蛋黃中加入緩沖液和聚乙二醇，使聚乙二醇的終濃度為10％～15％，混勻后離心，取沉淀；2)在沉淀中加入緩沖液和酸化水，使體系ph值為4.2～5.0，混勻后靜置，取上清液；3)在上清液中加入正辛酸，使其終濃度為0.1％～0.3％，混勻后靜置，取上清液；4)上清液過濾除菌，再超濾濃縮，得濃縮液；5)濃縮液采用親硫性混合模式吸附技術(shù)純化，得到提純的蛋黃抗體。步驟1)中緩沖液為濃度0.01mol/l、ph7.2的pbs緩沖液，其加量為蛋黃體積的2.5～3.5倍。步驟1)中聚乙二醇的相對分子量為4000～8000，優(yōu)選聚乙二醇6000。步驟1)中離心的參數(shù)為：轉(zhuǎn)速3000～4000rpm，時間5～15min。步驟2)中緩沖液為濃度0.01mol/l、ph7.2的pbs緩沖液，其加量為將沉淀還原至原蛋黃體積。步驟2)中酸化水的溫度為1～4℃，其加量為蛋黃體積的5～7倍。酸化水可采用ph值4.0～4.5的鹽酸溶液，將體系ph值調(diào)至4.2～5.0即可。步驟2)中靜置的溫度為2～8℃，時間12～20h。步驟3)中先將上清液加熱至18～26℃，再加入正辛酸。步驟3)中靜置的溫度為18～26℃，時間12～20h。步驟4)中過濾除菌為：上清液依次經(jīng)孔徑0.45μm、0.22μm的濾膜過濾。步驟4)中超濾濃縮為：采用截留分子量30～50kd的超濾膜濃縮30～50倍體積。步驟5)中親硫性混合模式吸附的技術(shù)參數(shù)為：吸附劑為mep-hypercel吸附劑(購自pallbiosepra公司，主要用于抗體的分離純化)，上樣平衡液為0.05mol/lph8.9tris-hcl緩沖液，洗脫液為0.02mol/lph4.2檸檬酸鈉緩沖液，清洗液為0.1mol/l氫氧化鈉溶液。步驟5)中蛋黃抗體經(jīng)提純后，還需進行滅活處理。滅活的操作為：在提純的蛋黃抗體中加入終濃度為0.1％～0.2％的甲醛溶液，于20～30℃下一次滅活12～20h；在一次滅活的溶液中加入凍干保護劑，凍干后用60co照射滅活，即可。60co照射的劑量為10～15kgy。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將peg置換、酸化水萃取、辛酸抽提和親硫性混合模式吸附層析技術(shù)相結(jié)合用于提純蛋黃抗體，能顯著提高抗體提純效果。其中聚乙二醇是一種非離子型水溶性聚合物，高濃度不會引起蛋白質(zhì)變性，向蛋黃中加入一定量的聚乙二醇，能將蛋白質(zhì)聚集留在沉淀中，且作用時間短，不影響離心處理，離心后沉淀用緩沖液重懸，即可進行酸化處理。酸化水萃取主要是分離蛋黃液中的親水性部分和疏水性部分，將蛋黃用酸化水做一定倍數(shù)稀釋后，igy主要存在于上清液中，抽取上清液備用。辛酸抽提是利用igy的特殊化學(xué)性質(zhì)，在低離子強度、ph4.2～4.5酸性條件下，辛酸與絕大多數(shù)的卵黃蛋白發(fā)生反應(yīng)，生成不可逆的沉淀，而igy不發(fā)生反應(yīng)，留在上清液中，離心除去沉淀，收集上清液，濃縮，濃縮液再進行親硫性混合模式吸附層析。親硫性混合模式吸附層析主要是利用生物大分子與固定相表面存在的某種特異性吸附作用進行選擇性分離的方法，該方法采用美國pallbiosepara公司開發(fā)的hcic介質(zhì)mep-hypercel分離純化抗體。將這四種抗體提純方法有序組合能夠提高抗體收率和純度，降低制品對機體的副作用和應(yīng)激反應(yīng)。本發(fā)明將甲醛滅活與60co輻照滅活技術(shù)相結(jié)合，能有效殺滅卵黃中傳染性致病菌和病毒，保證蛋黃抗體無外源細菌和病毒污染。該技術(shù)安全可靠，解決了經(jīng)蛋垂直傳播病原和蛋黃腐敗所致細菌的污染問題，并且能保留病原體表面的保護性抗原成分，激發(fā)機體免疫系統(tǒng)啟動全面防御，保障蛋黃抗體的活性。本發(fā)明中蛋黃抗體提純滅活技術(shù)的工藝簡單、操作方便，產(chǎn)品收率高、純度好，保存期長，使用安全可靠、無殘留，制備成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。具體實施方式下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實施例1抗小鵝瘟凍干蛋黃抗體的提純滅活方法，包括以下步驟：1)取100枚小鵝瘟高免蛋，對雞蛋進行消毒、熏蒸，手工打蛋分離出蛋黃；2)在蛋黃中加入3倍體積的濃度0.01mol/l、ph7.2的滅菌pbs緩沖液，攪勻后加入無菌聚乙二醇6000，邊加邊攪拌，使其終濃度為12％，繼續(xù)攪拌30分鐘，3500rpm離心10min，取沉淀；3)將沉淀用pbs緩沖液(同上)還原至原蛋黃體積，再加入6倍體積預(yù)冷至2℃、ph4.0的酸化水(鹽酸溶液)，攪勻，4℃靜置16h，抽取上清液；4)將上清液加熱至22℃，并向其中加入終濃度為0.2％的正辛酸，充分混勻后于22℃靜置16h，抽取上清液；5)上清液先經(jīng)0.45μm、0.22μm濾器過濾除菌，濾液再經(jīng)截留分子量為50kd的超濾膜濃縮40倍，得濃縮液；6)濃縮液采用親硫性混合模式吸附層析技術(shù)純化，層析柱裝30mlmep-hypercel吸附劑，以0.05mol/lph8.9tris-hcl緩沖液為上樣平衡液，0.02mol/lph4.2檸檬酸鈉緩沖液為洗脫液，0.1mol/l氫氧化鈉溶液為清洗液，上樣平衡液、洗脫液的流速均為1ml/min，清洗液的流速為2ml/min，得到提純的蛋黃抗體；7)在提純的蛋黃抗體中加入終濃度為0.15％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，25℃靜置16h，每20分鐘攪拌一次；經(jīng)無菌檢測、中和效價檢測合格后，依次加入終濃度為5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分攪拌后無菌定量分裝，分裝后迅速凍干；將凍干的蛋黃抗體用60co照射滅活，照射劑量為12kgy，得到抗小鵝瘟凍干蛋黃抗體。實施例2抗豬偽狂犬病毒凍干蛋黃抗體的提純滅活方法，包括以下步驟：1)取100枚豬偽狂犬病毒高免蛋，對雞蛋進行消毒、熏蒸，手工打蛋分離出蛋黃；2)在蛋黃中加入2.5倍體積的濃度0.01mol/l、ph7.2的滅菌pbs緩沖液，攪勻后加入無菌聚乙二醇4000，邊加邊攪拌，使其終濃度為15％，繼續(xù)攪拌30分鐘，3000rpm離心15min，取沉淀；3)將沉淀用pbs緩沖液(同上)還原至原蛋黃體積，再加入5倍體積預(yù)冷至1℃、ph4.2的酸化水(鹽酸溶液)，攪勻，2℃靜置20h，抽取上清液；4)將上清液加熱至18℃，并向其中加入終濃度為0.1％的正辛酸，充分混勻后于18℃靜置20h，抽取上清液；5)上清液先經(jīng)0.45μm、0.22μm濾器過濾除菌，濾液再經(jīng)截留分子量為50kd的超濾膜濃縮30倍，得濃縮液；6)濃縮液采用親硫性混合模式吸附層析技術(shù)純化，層析柱裝30mlmep-hypercel吸附劑，以0.05mol/lph8.9tris-hcl緩沖液為上樣平衡液，0.02mol/lph4.2檸檬酸鈉緩沖液為洗脫液，0.1mol/l氫氧化鈉溶液為清洗液，上樣平衡液、洗脫液的流速均為1ml/min，清洗液的流速為2ml/min，得到提純的蛋黃抗體；7)在提純的蛋黃抗體中加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，20℃靜置20h，每20分鐘攪拌一次；經(jīng)無菌檢測、中和效價檢測合格后，依次加入終濃度為5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分攪拌后無菌定量分裝，分裝后迅速凍干；將凍干的蛋黃抗體用60co照射滅活，照射劑量為10kgy，得到抗豬偽狂犬病毒凍干蛋黃抗體。實施例3抗番鴨細小病毒凍干蛋黃抗體的提純滅活方法，包括以下步驟：1)取100枚番鴨細小病毒高免蛋，對雞蛋進行消毒、熏蒸，手工打蛋分離出蛋黃；2)在蛋黃中加入3.5倍體積的濃度0.01mol/l、ph7.2的滅菌pbs緩沖液，攪勻后加入無菌聚乙二醇8000，邊加邊攪拌，使其終濃度為10％，繼續(xù)攪拌30分鐘，4000rpm離心5min，取沉淀；3)將沉淀用pbs緩沖液(同上)還原至原蛋黃體積，再加入7倍體積預(yù)冷至4℃、ph4.5的酸化水(鹽酸溶液)，攪勻，8℃靜置12h，抽取上清液；4)將上清液加熱至18℃，并向其中加入終濃度為0.1％的正辛酸，充分混勻后于18℃靜置20h，抽取上清液；5)上清液先經(jīng)0.45μm、0.22μm濾器過濾除菌，濾液再經(jīng)截留分子量為30kd的超濾膜濃縮50倍，得濃縮液；6)濃縮液采用親硫性混合模式吸附層析技術(shù)純化，層析柱裝30mlmep-hypercel吸附劑，以0.05mol/lph8.9tris-hcl緩沖液為上樣平衡液，0.02mol/lph4.2檸檬酸鈉緩沖液為洗脫液，0.1mol/l氫氧化鈉溶液為清洗液，上樣平衡液、洗脫液的流速均為1ml/min，清洗液的流速為2ml/min，得到提純的蛋黃抗體；7)在提純的蛋黃抗體中加入終濃度為0.2％的甲醛溶液，充分攪拌混勻，30℃靜置12h，每20分鐘攪拌一次；經(jīng)無菌檢測、中和效價檢測合格后，依次加入終濃度為5.0％、1.0％、0.5％的海藻糖、甘露醇和甘氨酸，充分攪拌后無菌定量分裝，分裝后迅速凍干；將凍干的蛋黃抗體用60co照射滅活，照射劑量為15kgy，得到抗番鴨細小病毒凍干蛋黃抗體。對比例1抗小鵝瘟凍干蛋黃抗體的提純方法，包括以下步驟：1)取100枚小鵝瘟高免蛋，對雞蛋進行消毒、熏蒸，手工打蛋分離出蛋黃；2)用1mol/l的鹽酸溶液將滅菌注射用水調(diào)至ph值為5.0，并降溫至2℃，按照蛋黃體積6倍的量加入到蛋黃中，邊加邊攪拌，然后4℃靜置16h，抽取上清液；3)將上清液加熱至22℃，并向其中加入終濃度為0.2％的正辛酸，充分混勻后22℃靜置16h，抽取上清液，得到提純的蛋黃抗體。對比例2抗小鵝瘟凍干蛋黃抗體的提純方法，包括以下步驟：1)取100枚小鵝瘟高免蛋，對雞蛋進行消毒、熏蒸，手工打蛋分離出蛋黃；2)在蛋黃中加入3倍體積的濃度0.01mol/l、ph7.2的滅菌pbs緩沖液，攪勻后加入無菌聚乙二醇6000，邊加邊攪拌，使其終濃度為12％，繼續(xù)攪拌30分鐘，3500rpm離心10min，取沉淀；3)將沉淀用pbs緩沖液(同上)還原至原蛋黃體積，再加入6倍體積預(yù)冷至2℃、ph4.0的酸化水，攪勻，4℃靜置16h，抽取上清液；4)將上清液加熱至22℃，并向其中加入終濃度為0.2％的正辛酸，充分混勻后于22℃靜置16h，抽取上清液；5)上清液依次經(jīng)0.45μm、0.22μm濾器過濾除菌，得到提純的蛋黃抗體。試驗例1、不同提取工藝提純后抗體檢測取實施例1及對比例1～2中提純后的蛋黃抗體進行外觀、氣味、抗體效價、蛋白含量、脂肪殘留量等檢測，檢測結(jié)果見下表1?？贵w效價檢測：用瓊脂擴散試驗檢測原蛋黃及提取后蛋黃抗體瓊擴效價。蛋白含量檢測：用lowry蛋白濃度測定試劑盒測定蛋黃抗體的蛋白含量，測定結(jié)果換算為每毫升蛋黃抗體的蛋白含量。脂肪殘留量檢測：用德杜szf-06c脂肪測定儀測定蛋黃抗體的脂肪殘留量，測定結(jié)果換算為每毫升蛋黃抗體的脂肪殘留量。表1不同提取工藝提純后抗體檢測對比結(jié)果檢測項目對比例1對比例2實施例1顏色淡黃色，澄清透明無色，澄清透明無色，澄清透明氣味略帶辛酸味略帶辛酸味無氣味蛋白含量(mg/ml)8.165.872.62脂肪殘留量(mg/ml)7.053.780.56稀釋倍數(shù)770.9使用原蛋黃量(ml)100100100提純后抗體量(ml)49048590原蛋黃效價1:1281:1281:128提純后抗體效價1:241:241:128抗體綜合收率92％91％90％由表1可知，實施例1中提純的抗體雜蛋白和脂肪殘留量少，抗體純度高、收率高。2、不同滅活方式對滅活效果的影響選擇垂直傳播且較難滅活的微生物作為指示微生物(包括減蛋綜合征病毒、蠟樣芽胞桿菌芽孢、雞大腸桿菌、銅綠假單胞菌和禽腦脊髓炎病毒)，取適量加入蛋黃液中，提純抗體，然后采用不同的方式滅活，分別于滅活前、后進行細菌計數(shù)、病毒滅活檢驗和抗體效價測定，結(jié)果見下表2。60co輻照劑量滅活組：取小鵝瘟高免蛋消毒晾干，分離出蛋黃，向蛋黃液中加入適量指示微生物(見下表2)，提純抗體后進行無菌分裝，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞軋蓋，60co輻照，輻照劑量為10kgy。甲醛溶液滅活組：取小鵝瘟高免蛋消毒晾干，分離出蛋黃，向蛋黃液中加入適量指示微生物(見下表2)，提純抗體后加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，充分混勻，25℃作用24h，期間每隔20min攪拌一次；滅活后進行無菌分裝，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞軋蓋。甲醛-60co輻照綜合滅活組：取小鵝瘟高免蛋消毒晾干，分離出蛋黃，向蛋黃液中加入適量指示微生物(見下表2)，提純抗體后加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，充分混勻，25℃作用24h，期間每隔20min攪拌一次；甲醛滅活后進行無菌分裝，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞軋蓋，60co輻照，輻照劑量為10kgy。對照組：取小鵝瘟高免蛋消毒晾干，分離出蛋黃，向蛋黃液中加入適量指示微生物(見下表2)，提純抗體后進行無菌分裝，250ml/瓶(塑料疫苗瓶)，加塞軋蓋。表2不同滅活方式滅活效果對比結(jié)果由表2可知，甲醛-60co輻照滅活方式對指示微生物的滅活效果最佳，且對抗體效價基本無影響。當(dāng)前第1頁12