本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬源抗菌肽的提取方法。

背景技術(shù)：

抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)抗菌作用的活性多肽，是生物先天免疫的重要組成成分。迄今為止，已在許多生物包括動(dòng)物、植物及原核生物中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)源性抗菌活性肽。豬源抗菌肽是從豬體內(nèi)分離得到的抗菌肽。

由于抗菌肽具有廣譜殺菌作用、相對(duì)分子量較小、熱穩(wěn)定及水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，更為重要的是抗菌肽可作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞且不易使病原微生物產(chǎn)生耐藥的特點(diǎn)；因此，在當(dāng)前人類濫用抗生素所帶來的全球耐藥性的嚴(yán)峻問題下，對(duì)于了解豬體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗菌肽的功能，以及設(shè)計(jì)一種方法來制備豬源抗菌肽以求替代抗生素的研究，便顯得極為重要，這勢(shì)必將對(duì)尋找抗生素替代品的研究與應(yīng)用起到積極的促進(jìn)作用。

現(xiàn)有技術(shù)在粗提豬源抗菌肽組織搗碎的過程中，因含有較大組織塊，勻漿搗碎時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)器造成較大損傷，并且會(huì)降低原料使用率；當(dāng)組織搗碎不夠充分時(shí)，會(huì)影響反復(fù)凍融時(shí)細(xì)胞破碎的程度，最終影響抗菌肽的提取。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高原料的使用率，降低組織搗碎過程對(duì)儀器的損耗，同時(shí)使反復(fù)凍融時(shí)細(xì)胞破碎更加充分的豬源抗菌肽的提取方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種豬源抗菌肽的提取方法，包括以下步驟：

1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用注射用水沖洗干凈，然后將豬小腸在80-100℃的水中熱處理15-25s，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；

2）將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90-99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無熱源的容器中并置于凍庫中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5-6次；

3）將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸（分析純）按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液沸水浴8-15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，離心，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；

4）將上述沉淀物與濃度2.87%乙酸溶液按照質(zhì)量比1∶0.8-1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃以下，冷凍2-4小時(shí)后（待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍）離心，收集二次上清液體；

5）合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過0.22μm-0.45μm和5kd-10kd濾膜進(jìn)行切向流過濾，收集濾膜透過液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至3.0-6.5之間，再經(jīng)0.1μm-0.22μm除菌濾器過濾，得到豬源抗菌肽。

進(jìn)一步，所述步驟2），勻漿液與注射用水的質(zhì)量比為100∶97.13。

進(jìn)一步，所述步驟3），反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸的質(zhì)量比為100∶2.87。

進(jìn)一步，所述步驟3），混合液在攪拌條件下進(jìn)行沸水浴。

進(jìn)一步，所述步驟3），冷卻后的混合液于4℃、6000-7500r/min離心20-30min。

進(jìn)一步，所述步驟4），沉淀物與2.87%乙酸溶液的質(zhì)量比為1∶1。

進(jìn)一步，所述步驟4），冷凍后的浸提液于4℃、6000-7500r/min離心20-30min。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，在豬小腸冷卻絞碎前，增加一個(gè)熱處理步驟，即前期處理后的小腸在溫度為80-100℃熱水中處理15-25s，再迅速冷卻，隨后剪碎，搗碎，該方法可以使豬小腸在絞肉機(jī)及膠體磨中勻漿時(shí)，豬小腸碾磨的比未熱處理的更細(xì)，幾乎不會(huì)有大顆粒的組織存在，不僅提高原料的使用率，而且能夠減少對(duì)儀器的損傷。同時(shí)，由于不存在大顆粒的組織塊，隨后進(jìn)行的反復(fù)凍融過程，能夠更加充分的破碎細(xì)胞，釋放更多的豬源抗菌肽。

本發(fā)明所述步驟3），混合液在沸水浴過程中，攪拌機(jī)應(yīng)不斷攪拌以保證受熱均勻)，反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，優(yōu)選為1∶2.87%，2.87%的乙酸溶液提取多肽類物質(zhì)含量不僅與5%乙酸溶液提取的差異不明顯，而且2.87%的乙酸溶液提取的抗菌肽溶液滲透壓是5%乙酸溶液提取的一半，避免出現(xiàn)滲透壓過高的現(xiàn)象。

具體實(shí)施方式

一種豬源抗菌肽的提取方法，包括以下步驟：

1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用水沖洗干凈，然后將豬小腸在80-100℃的水中熱處理15-25s，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；

2）將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90-99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝至無熱源的容器中并置于凍庫中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5-6次；

3）將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸（分析純）按照質(zhì)量比100∶1-10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴8-15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、6000-7500r/min離心20-30min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；

4）將上述沉淀物與濃度2.87%乙酸溶液按照質(zhì)量比1∶0.8-1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃以下，冷凍2-4小時(shí)后（待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍）于4℃、6000-7500r/min離心20-30min，收集二次上清液體；

5）合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過0.22μm-0.45μm和5kd-10kd濾膜進(jìn)行切向流過濾，收集濾膜透過液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至3.0-7.0之間，再經(jīng)0.1μm-0.22μm除菌濾器過濾，得到豬源抗菌肽。

實(shí)施例1

一種豬源抗菌肽的提取方法，包括以下步驟：

1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用水沖洗干凈，然后將豬小腸在90℃的水中熱處理20s，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；

2）將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶97.13混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無熱源的容器中并置于凍庫中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融6次；

3）將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸（分析純）按照質(zhì)量比100∶2.87混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴10min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、7000r/min離心25min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；

4）將上述沉淀物與濃度2.87%乙酸溶液按照質(zhì)量比1∶1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃下，冷凍3小時(shí)后（待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍）于4℃、7000r/min離心25min，收集二次上清液體；

5）合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過0.22μm和10kd濾膜進(jìn)行切向流過濾，收集濾膜透過液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至4.5，再經(jīng)0.1μm除菌濾器過濾，得到豬源抗菌肽。

實(shí)施例2

一種豬源抗菌肽的提取方法，包括以下步驟：

1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用水沖洗干凈，然后將豬小腸在80℃的水中熱處理25s，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；

2）將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶90混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無熱源的容器中并置于凍庫中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融6次；

3）將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸（分析純）按照質(zhì)量比100∶10混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴8min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、6000r/min離心30min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；

4）將上述沉淀物與濃度2.87%乙酸溶液按照質(zhì)量比1∶0.8混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)得到浸提液，將浸提液在-24℃條件下，冷凍2小時(shí)后（待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍）于4℃、6000r/min離心30min，收集二次上清液體；

5）合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過0.45μm和5kd濾膜進(jìn)行切向流過濾，收集濾膜透過液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至3.0，再經(jīng)0.1μm除菌濾器過濾，得到豬源抗菌肽。

實(shí)施例3

一種豬源抗菌肽的提取方法，包括以下步驟：

1)取新鮮或解凍的豬小腸，去除豬小腸表面的筋膜、脂肪組織和小腸內(nèi)容物，用水沖洗干凈，然后將豬小腸在100℃的水中熱處理15s，迅速冷卻后用絞肉機(jī)絞碎，接著用膠體磨勻漿3次，得到豬小腸勻漿液；

2）將上述勻漿液與注射用水按照質(zhì)量比100∶99混合均勻，然后將混合均勻后的勻漿液分裝于無熱源的容器中并置于凍庫中冷凍，待冷凍完全后取出，再置于室溫流水中解凍，如此反復(fù)凍融5次；

3）將反復(fù)凍融后的勻漿液與乙酸（分析純）按照質(zhì)量比100∶1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到混合液，將混合液在攪拌條件下沸水浴15min，然后將混合液置于冰水中迅速冷卻，于4℃、7500r/min離心20min，分別收集沉淀物和一次上清液，將一次上清液于4℃保存；

4）將上述沉淀物與濃度2.87%乙酸溶液按照質(zhì)量比1∶1混合均勻，于4℃攪拌12小時(shí)后得到浸提液，將浸提液在溫度-10℃下，冷凍4小時(shí)后（待浸提液表層出現(xiàn)冰渣，停止冷凍）于4℃、7500r/min離心20min，收集二次上清液體；

5）合并一次上清液和二次上清液，將合并后的上清液依次經(jīng)過0.3μm和7kd濾膜進(jìn)行切向流過濾，收集濾膜透過液，得到超濾液；調(diào)節(jié)超濾液ph值至7.0，再經(jīng)0.22μm除菌濾器過濾，得到豬源抗菌肽。