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CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特異性gRNA的制作方法

文檔序號:12697183閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.在CRISPR/Cas9特異性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的 gRNA,所述 gRNA 在人Lin28A基因上的靶序列符合5’- N (20)-NGG3’ 或 者5’-CCN- N (20)-3’的序列排列規(guī)則,在人Lin28A基因上的靶序列是唯一的,其特征在于:所述gRNA在人Lin28A基因的靶向位點位于人Lin28A基因的外顯子上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在CRISPR/Cas9 特異性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的 gRNA,其特征在于:對應(yīng)的核酸序列如序列表 SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 5任意一條序列所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的在CRISPR/Cas9特異性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的gRNA,其特征在于:該gRNA在治療腫瘤的新型藥物中的應(yīng)用。

4.CRISPR/Cas9特異性敲除人Lin28A基因的方法,具體包括如下步驟:

(1)如權(quán)利要求 1-3 任意一項所述的gRNA,在其對應(yīng) DNA 序列的 5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸序列,在其互補鏈的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列,分別合成正向和反向寡核苷酸序列,然后將合成的序列變性、退火,得到具有 BbsI 粘性末端的雙鏈 DNA片段;

(2)將上述合成的雙鏈DNA片段和用BbsI酶切過的PX458 載體進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中,涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上,篩選陽性菌落,提取陽性菌落質(zhì)粒進行分析及測序,確認gRNA 表達載體構(gòu)建正確;

(3)將步驟(2)構(gòu)建的gRNA載體轉(zhuǎn)染 HepG2、A375 細胞,并用PX458空載體轉(zhuǎn)染 HepG2、A375 細胞作為對照組。

5.將步驟(3)轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)流式分選,篩選出轉(zhuǎn)染陽性的細胞,采用有限稀釋的方法,培養(yǎng)細胞克隆,將靶位點測序鑒定,獲得Lin28A基因兩等位基因敲除的細胞株。

6.如權(quán)利要求4中步驟(4)所示,本發(fā)明構(gòu)建篩選的CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得HepG2和A375 Lin28基因敲除細胞株,命名為A375-KO-Lin28A和HepG2-KO-Lin28A。

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