本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種重組嗜堿芽孢桿菌的制備方法，和由該方法制備得到重組嗜堿芽孢桿菌及其應(yīng)用，以及一種制備D-乳酸的方法。

背景技術(shù)：

乳酸(Lactic acid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機酸之一，可作為酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、生物可降解性材料、藥物和農(nóng)藥等，應(yīng)用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)中。乳酸是一種手性分子，可分為L-乳酸和D-乳酸。D-乳酸作為一種重要的手性化合物，被用作醫(yī)藥、高效低毒農(nóng)藥、除草劑和其它手性化合物合成的中間體以及聚乳酸合成的原料。例如，德國Hoeehst公司開發(fā)了以D-乳酸為原料的新型高效除草劑威霸(Whip Super)，德國BASF公司以D-乳酸異丙酯為原料生產(chǎn)除草劑Duplosan，并已大規(guī)模投放市場。D-乳酸的重要應(yīng)用價值使得人們不斷探索以高產(chǎn)量、高底物轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度生產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸的技術(shù)方法。

目前國際上的D-乳酸生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法，其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品安全性高，而且能專一性的得到光學(xué)純度高的D-乳酸。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的關(guān)鍵因素之一是菌株的性能。目前主要應(yīng)用的發(fā)酵菌株為天然分離的乳桿菌(Lactobacillus)和芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus)。許平等利用芽孢乳桿菌CASD發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，其產(chǎn)量為207g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度為99.3％[Wang et al.2011,Appl Microbiol Biotechnol.89:1009-17]；CN101285047B利用芽孢乳桿菌Y2-8發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量達165g/L，光 學(xué)純度為99.1％；CN102978134B利用乳桿菌DMDL9010發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量達85g/L，光學(xué)純度為90％。另外，也有研究者采用基因工程育種策略提高菌株的D-乳酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率以及光學(xué)純度、降低副產(chǎn)物的合成等。所涉及的菌株包括：乳酸菌(Lactobacillus)、大腸桿菌(E.coli)、谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)以及酵母(Saccharomyces)等。CN104278003A利用工程化的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，其產(chǎn)量為131g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度達99.5％以上；CN101993850B利用重組谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum Res 167Δldh/ldhA)發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量達40g/L以上，純度為99％以上。然而D-乳酸生產(chǎn)在發(fā)酵菌株的多樣性和發(fā)酵水平方面仍有較大差距，探尋高產(chǎn)量、高光學(xué)純度的D-乳酸生產(chǎn)菌及生產(chǎn)工藝是極有價值的。

乳酸發(fā)酵過程中，由于不斷生產(chǎn)產(chǎn)物而使發(fā)酵液的酸度逐漸上升，導(dǎo)致菌體生長和產(chǎn)酸都受到嚴重的抑制，為此通常需要加入碳酸鈣等中和劑進行中和。另外，在乳酸的提取和純化過程中，需要加入硫酸對乳酸鈣進行酸化，從而生成乳酸和不溶性的硫酸鈣廢棄物，造成嚴重的環(huán)境問題和經(jīng)濟浪費。近年發(fā)展起來的電滲析法是一種乳酸提取純化新工藝。該工藝可避免碳酸鈣的生成，減少了環(huán)境污染。但是，電滲析膜對二價離子如Ca²⁺和Mg²⁺不耐受，為了利用這種環(huán)保節(jié)能的新技術(shù)，乳酸發(fā)酵過程中需要用一價離子的堿性物質(zhì)作為中和劑，而NaOH就是這樣一種理想的中和劑。然而，在使用NaOH作為中和劑進行乳酸發(fā)酵時，現(xiàn)有的發(fā)酵菌株都難以達到理想的效果，產(chǎn)量和光學(xué)純度均較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種既能夠獲得高產(chǎn)量且高光學(xué)純度的D-乳酸，又能夠耐受高濃度一價離子的堿性物質(zhì)的重組菌株以及利用該菌株制備D-乳酸的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種重組嗜堿芽孢桿菌的制備方法，其中，該方法包括：以生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過遺傳工程操作，使該出發(fā)菌株不表達L-乳酸脫氫酶而表達D-乳酸脫氫酶。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種由上述制備方法制備得到的重組嗜堿芽孢桿菌。

第三方面，本發(fā)明還提供了上述重組嗜堿芽孢桿菌在生產(chǎn)D-乳酸中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明還提供了一種制備D-乳酸的方法，其中，該方法包括將本發(fā)明第二方面所述的重組嗜堿芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，獲得含有D-乳酸的發(fā)酵液。

采用本發(fā)明的重組嗜堿芽孢桿菌制備得到的D-乳酸的光學(xué)純度高于99.8％，轉(zhuǎn)化率在94％以上，產(chǎn)量可高達142克/升。另外，本發(fā)明利用上述重組嗜堿芽孢桿菌制備D-乳酸的優(yōu)選實施方式中，以花生粕為氮源并采用發(fā)酵前不對發(fā)酵設(shè)備和/或發(fā)酵培養(yǎng)基進行滅菌的策略，大幅度地降低了成本；同時，可以以一價離子的堿性物質(zhì)作為中和劑，簡化了后期處理過程并減少了環(huán)境污染。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

生物保藏

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方式提供的重組嗜堿芽孢桿菌(或芽孢桿菌，Bacillus sp.)的保藏編號為CGMCC No.11581，已于2015年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(縮寫為CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)。

附圖說明

附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是本發(fā)明實施例2中葡萄糖和D-乳酸的濃度隨發(fā)酵時間的變化曲線；

圖2是本發(fā)明實施例3中葡萄糖和D-乳酸的濃度隨發(fā)酵時間的變化曲線。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應(yīng)當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

第一方面，本發(fā)明提供了一種重組嗜堿芽孢桿菌的制備方法，其中，該方法包括：以生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過遺傳工程操作，使該出發(fā)菌株不表達L-乳酸脫氫酶(L-LDH)而表達D-乳酸脫氫酶(D-LDH)。

在本發(fā)明中，所述出發(fā)菌株可以為各種能夠生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌，其中，所述生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌可以是只表達L-乳酸脫氫酶編碼基因(L-ldh)以生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌，或者是同時表達L-ldh和D-乳酸脫氫酶編碼基因(D-ldh)以生產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸的菌株。本發(fā)明對所述生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌的來源沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如，通過商購獲得，在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌為生產(chǎn)L-乳酸的嗜堿芽孢桿菌N16-5(保藏編號為CGMCC NO.0369，已在CN1266096A中公布)。

根據(jù)本發(fā)明，在上述制備方法中，使出發(fā)菌株不表達L-LDH的方式可 以為：突變或敲除出發(fā)菌株中的L-ldh。優(yōu)選地，通過敲除出發(fā)菌株中的L-ldh，從而使L-ldh完全不表達。在優(yōu)選的情況下，所述L-ldh的序列如SEQ ID NO:1所示。

根據(jù)本發(fā)明，在上述制備方法中，使D-LDH表達的方式為：將含有D-ldh的表達載體導(dǎo)入不表達L-LDH的嗜堿芽孢桿菌中。在優(yōu)選的情況下，所述D-ldh的序列如GenBank號AAA25246所示。

在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供的重組嗜堿芽孢桿菌的制備方法可以具體包括以下步驟：

(1)構(gòu)建L-ldh缺失的嗜堿芽孢菌(Bacillus sp.N16-5Δldh)；

(2)構(gòu)建含有D-ldh的表達載體；

(3)使用構(gòu)建好的含有D-ldh的表達載體轉(zhuǎn)化L-ldh缺失的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus sp.N16-5Δldh)；

(4)篩選陽性克隆子。

其中，在步驟(1)中，可以通過本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法構(gòu)建L-ldh缺失的嗜堿芽孢菌(Bacillus sp.N16-5Δldh)，例如，可以通過同源重組或基因突變的方法，優(yōu)選為通過同源重組的方法。

在步驟(2)，所述表達載體可以為質(zhì)粒、病毒、粘粒和噬菌體中的至少一種，優(yōu)選為質(zhì)粒。

另外，在步驟(2)中，構(gòu)建含有D-ldh的表達載體的具體方式可以為：根據(jù)D-ldh的基因序列設(shè)計引物，擴增D-ldh；在優(yōu)選的情況下，可以根據(jù)德式乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)或保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)菌中D-ldh的基因序列設(shè)計引物。

在步驟(3)中，轉(zhuǎn)化的方式可以為原生質(zhì)體法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法或電擊法。

在步驟(4)中，在優(yōu)選的情況下，步驟(4)還可以包括通過PCR方法驗證得到的攜有外源D-ldh的重組嗜堿芽孢桿菌(Bacillus sp. N16-5Δldh-pDlac)。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種由上述制備方法制備得到的重組嗜堿芽孢桿菌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述重組嗜堿芽孢桿菌為保藏編號為CGMCC No.11581的重組菌株。

第三方面，本發(fā)明還提供了上述重組嗜堿芽孢桿菌在生產(chǎn)D-乳酸中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明還提供了一種制備D-乳酸的方法，其中，該方法包括將上述重組嗜堿芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，獲得含有D-乳酸的發(fā)酵液。

根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有碳源、氮源和選擇性含有的無機鹽。優(yōu)選地，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述碳源的含量為60-150克/升，優(yōu)選為70-100克/升。所述氮源的含量優(yōu)選為10-50克/升，更優(yōu)選為20-40克/升。所述無機鹽的含量優(yōu)選為0-5克/升，更優(yōu)選為1-4克/升。

在優(yōu)選的情況下，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還可以含有抗生素和水，所述抗生素優(yōu)選為氯霉素?？股卦诎l(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度可以為2-4μg/mL。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明對碳源沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的選擇，例如，可以為糖，優(yōu)選為單糖和/或寡糖，更優(yōu)選為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露糖和半乳糖中的至少一種，進一步優(yōu)選為葡萄糖和/或果糖。

在本發(fā)明中，本發(fā)明對氮源沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的選擇，例如，可以為無機氮源和/或有機氮源，優(yōu)選為有機氮源，更優(yōu)選為由花生粕、蛋白胨、酵母粉和豆餅粉中的至少一種提供。另外，當使用的是有機氮源時，為了將其中的大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽或氨基酸以利于菌株有效吸收和利用，優(yōu)選地，所述有機氮源在發(fā)酵前需要進行預(yù)處理，所述預(yù)處理可以包括：滅菌預(yù)處理和酶預(yù)處理。其中，本發(fā)明對滅菌預(yù)處理的方式?jīng)]有特別的限定，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如，可以采用高溫滅菌的方式。所述 酶預(yù)處理可以使用中性蛋白酶進行預(yù)處理，優(yōu)選地，酶預(yù)處理的條件可以包括：pH值為6.8-7.2，預(yù)處理溫度為40-50℃，預(yù)處理時間為6-10小時，中性蛋白酶的濃度為10-50克/升。

在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明所述的無機鹽為醋酸鈉。

根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵的條件可以包括：發(fā)酵的溫度為35-45℃，發(fā)酵的時間為90-100小時，發(fā)酵的pH值為9-10，控制發(fā)酵的過程中碳源的含量為20-50克/升。優(yōu)選地，所述發(fā)酵在攪拌條件下進行，攪拌轉(zhuǎn)速為80-120轉(zhuǎn)/分鐘。進一步優(yōu)選地，在發(fā)酵前進行通氣處理，所述通氣處理的方式可以為在發(fā)酵前10-14小時以0.8-1.5升/分鐘的流速通入空氣。

根據(jù)本發(fā)明，控制發(fā)酵的pH值的方式可以為向發(fā)酵體系中補加中和劑，所述中和劑可以包括NaOH、氨水和Na₂CO₃中的至少一種，優(yōu)選為NaOH和/或Na₂CO₃。

在本發(fā)明中，由于在發(fā)酵過程中碳源被不斷地消耗導(dǎo)致其含量不斷地降低，因此，為了更好地保證菌株的正常生長需要控制發(fā)酵過程中碳源的含量。本發(fā)明對控制發(fā)酵過程中碳源的含量的方式?jīng)]有特別的限定，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如，可以采用補加碳源(如葡萄糖)水溶液的方式，優(yōu)選地，所述碳源水溶液的濃度可以為800-1000克/升。補加的次數(shù)通常為3-5次。

根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵之前可以對發(fā)酵的設(shè)備和/或發(fā)酵培養(yǎng)基進行滅菌或不進行滅菌，優(yōu)選為不進行滅菌。本發(fā)明對滅菌的方式?jīng)]有特別的限定，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如，可以為高溫滅菌。在優(yōu)選的情況下，所述高溫滅菌的條件可以包括：滅菌溫度為110-120℃，滅菌時間為15-25分鐘。本發(fā)明的重組嗜堿芽孢桿菌能夠在不進行滅菌的情況下發(fā)酵制備D-乳酸，特別有利于節(jié)省能耗。

以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。

在以下實施例中所使用的培養(yǎng)基配方如下：

SA5培養(yǎng)基(1L)：丁二酸鈉81g，Tris Base 1.21g，酵母提取物5g，Casamino acid 5g，葡萄糖5g，MgCl₂·6H₂O 4.06g，CaCl₂ 1.39g，NaCl 10g，瓊脂5％。200mL固體培養(yǎng)基配制方法:先將組分溶解于190mL中，加入10g瓊脂，滅菌后加入10mL 10％的葡萄糖溶液，置于70℃冷卻后倒平板。

NCM培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨5g，酵母提取物2g，檸檬酸0.34g，葡萄糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，NaCl 11.7g。滅菌后加入1/10終體積單獨滅菌的22.8％K₂HPO₄·3H₂O，混勻。培養(yǎng)基pH值為7.6-7.8。固體培養(yǎng)基加入3％的瓊脂。

種子培養(yǎng)基(克/升)：葡萄糖10，酵母粉5，聚蛋白胨5，K₂HPO₄·3H₂O1，MgSO₄·7H₂O 0.2，NaCl 50，蒸餾水900mL，115℃高溫滅菌20分鐘后加入高溫滅菌的10％(w/v)Na₂CO₃ 100mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基(克/升)：葡萄糖80，花生粕(北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司)30，醋酸鈉2。

實施例1

本實施例用于說明本發(fā)明提供的重組嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5Δldh-pDlac的構(gòu)建。

1、嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5中L-ldh基因的敲除

根據(jù)嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5的基因組信息，設(shè)計L-ldh基因(SEQ ID NO:1)的上下游引物，其中上游引物為5'-TATATAGAAAGGACGATGTAAATGAGTG-3'(SEQ ID NO:2)，下游引物為5'-TCTTATCTTATTTGCCTGATCAAATGCC-3'(SEQ ID NO:3)；通過高保真的核酸聚合酶Pyrobest(Takara公司)，以嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5基因組為模板經(jīng)PCR擴增出L-ldh基因，PCR擴增條件為：先95℃ 預(yù)變性5min，然后95℃30s，55℃30s，72℃90s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的大小，并將PCR產(chǎn)物送至北京擎科基因公司測序驗證；利用Fast clone Kit(PUEX公司)將純化的PCR產(chǎn)物和pMD18T載體連接，將構(gòu)建好的重組載體pMD18(Bspn165-ldh)通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌DH5a中，通過含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板的篩選以及PCR驗證得到陽性克隆子，提取質(zhì)粒，BamHI和SalI(New England Biolabs)酶切后連接到穿梭載體pNNB194上，獲得自殺質(zhì)粒pNNB-Δldh；通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將自殺質(zhì)粒pNNB-Δldh轉(zhuǎn)入嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5(保藏編號為CGMCC NO.0369，已在CN1266096A中公布)[Gao等2011 PLoS ONE.6(11):e28148]，在含有0.5μg/mL紅霉素的SA5固體培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子，長出的菌落用菌落PCR方法驗證是否為陽性克隆，獲得的陽性克隆用溫移法[Connelly等2004，J Bact 186:4159–67]進行同源交換，用NCM平板篩選敲除菌株，通過PCR擴增和測序檢測是否為L-ldh基因敲除菌株，得到嗜堿芽孢桿菌N16-5L-ldh基因(ΔBspn165-ldh)完全缺失的突變體Bacillus sp.N16-5Δldh。

2、生產(chǎn)D-乳酸的重組嗜堿芽孢桿菌的構(gòu)建

使用Pyrobest DNA聚合酶，以嗜堿芽孢桿菌N16-5基因組為模板，以引物165PRF(5′–GGAATTCCATATGCTGATGGTAGGACGCTTGTAC–3′，S EQ ID NO:4)和PR-LDH(5′–CGTAAGCAAAAATTTTAGTCATGTTTA AACATCTACCTTTCC–3′，SEQ ID NO:5)經(jīng)PCR擴增L-ldh啟動子，PCR擴增條件為：先94℃預(yù)變性10min，然后94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。以德式乳桿菌Lactobacillus delbrueckii基因組為模板，以引物L(fēng)DH-PR(5′–GGAAAGGTAGATGTTTAAACATGACTAAAATTTTTGCTTACG–3′，SEQ ID NO:6)和165LDHR(5′–CGCGGATCCTTAGCCAACCTTAACTGGAG–3′，SEQ ID NO:7)經(jīng)PCR擴增D-ldh基因(G enBank：AAA25246)，PCR擴增條件為：先94℃預(yù)變性10min，然后94℃30s，60℃30s，72℃90s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。利用重疊PCR將L-ldh啟動子和D-ldh基因融合后連接到pMK4載體，獲得表達質(zhì)粒pMK4-ldh，轉(zhuǎn)化Bacillus sp.N16-5Δldh原生質(zhì)體感受態(tài)，復(fù)生培養(yǎng)基使用含有2.5μg/mL氯霉素的SA5培養(yǎng)基，使用引物Cm-F/Cm-R進行菌落PCR挑選陽性克隆，然后將陽性克隆接入含有2.5μg/mL氯霉素的NCM培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得生產(chǎn)D-乳酸的重組嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5Δldh-pDlac。

實施例2

本實施例用于說明本發(fā)明提供的重組嗜堿芽孢桿菌在生產(chǎn)D-乳酸中的應(yīng)用。

1、發(fā)酵

1)活化培養(yǎng)：將保存的重組嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5Δldh-pDlac甘油菌液以體積比為4％接種量接種入裝有4mL種子培養(yǎng)基的試管往復(fù)式搖床，200轉(zhuǎn)/分鐘，溫度37℃，培養(yǎng)12小時；

2)種子培養(yǎng)：將步驟1)的液體培養(yǎng)物，在無菌條件下接種于裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，40℃靜置培養(yǎng)8小時，制得種子培養(yǎng)液；

3)發(fā)酵培養(yǎng)：瑞士Infors HT公司Multifors 1.4升發(fā)酵罐中加入700mL發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃條件下滅菌20分鐘。以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7、45℃條件下處理花生粕8h。以10％(體積比)接種量接入上述種子液，以2.5μg/mL的終濃度加入過濾滅菌的氯霉素，發(fā)酵過程中，當發(fā)酵液的葡萄糖濃度低于20克/升時，補加45mL濃度為750克/升的葡萄糖水溶液(整個過程共補加了3次)。發(fā)酵前12小時通氣1.0升/分鐘，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為48mm。利用10mol/L NaOH維持pH值恒定為9，45℃培養(yǎng)96小時 結(jié)束發(fā)酵。

每隔4小時取一次發(fā)酵液，6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。

2、檢測

葡萄糖的濃度采用Agillent 1100液相色譜分析儀(安捷倫科技有限公司)測定，用Bio-Rad的Aminex HPX-87H分析柱(300×7.8mm)，二極管陣列檢測器，檢測波長215nm，流動相18mmol/L H₂SO₄，流速0.5mL/分鐘，柱溫65℃，進樣量10μL。

D-乳酸濃度采用Agillent 1100液相色譜分析儀(安捷倫科技有限公司)測定，MCI GEL CRS10W手性分析柱，二極管陣列檢測器，檢測波長254nm，流動相2mM CuSO₄，流速0.5mL/分鐘，柱溫25℃，進樣量10μL。L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號為L1750。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號為L0625。

D-乳酸光學(xué)純度計算方法：

D-乳酸光學(xué)純度(％)＝D-乳酸濃度(克/升)/[L-乳酸濃度(克/升)+D-乳酸濃度(克/升)]×100％

轉(zhuǎn)化率的計算方法：

轉(zhuǎn)化率(％)＝D-乳酸濃度(克/升)/葡萄糖消耗量(克/升)×100％

實驗共設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖1所示，最終得到的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為0克/升，D-乳酸濃度142克/升，轉(zhuǎn)化率94％，D-乳酸光學(xué)純度99.85％。

實施例3

本實施例用于說明本發(fā)明提供的重組嗜堿芽孢桿菌在不進行滅菌的情況下生產(chǎn)D-乳酸中的應(yīng)用。

1、發(fā)酵

1)活化培養(yǎng)：方法同實施例1；

2)種子培養(yǎng)：方法同實施例1；

3)發(fā)酵培養(yǎng)：瑞士Infors HT公司Multifors 1.4升發(fā)酵罐中加入700mL發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC3.4.24.28)，在pH7、45℃條件下處理花生粕8h。以10％(體積比)接種量接入上述種子液，以2.5μg/mL的終濃度加入過濾滅菌的氯霉素，發(fā)酵過程中，當發(fā)酵液葡萄糖濃度低于20克/升時，補加45mL 750克/升的葡萄糖水溶液一次，整個過程共補加3次。發(fā)酵前12小時通氣1.0升/分鐘，然后停止通氣直到發(fā)酵結(jié)束，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為48mm。利用10M NaOH維持pH值恒定為9，45℃培養(yǎng)96小時結(jié)束發(fā)酵。

每隔4小時取一次發(fā)酵液，6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。

2、檢測

檢測方法與實施例1中所述相同。實驗共設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖2所示，最終得到的發(fā)酵液中葡萄糖的濃度為0克/升，D-乳酸濃度144克/升，轉(zhuǎn)化率96％，D-乳酸光學(xué)純度99.85％

從以上實施例可以看出，使用本發(fā)明提供的重組嗜堿芽孢桿菌的制備方法制備得到的重組嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.N16-5Δldh-pDlac可以用于制備D-乳酸，其中，得到的D-乳酸的光學(xué)純度高于99.8％，轉(zhuǎn)化率高達94％以上，產(chǎn)量高達142克/升。

以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方 案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。