專利名稱:一株嗜堿細(xì)菌及其固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景目前堿性果膠酶在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其應(yīng)用領(lǐng)域包括棉纖維的生物精練、植物韌皮纖維脫膠、造紙、處理果膠廢水、咖啡和茶發(fā)酵、洗滌劑等。中國專利(公開號CN1480529A)中公開了一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CCTCC NoM203042經(jīng)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶，可用于棉紡織物精練處理。中國專利(公開號CN1177003A)中公開了一株嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)CCTCCM96009能直接用于苧麻脫膠。中國專利(公開號CN1113951A)中公開了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CCTCC No0213經(jīng)高濃度液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶。我們從堿性土壤中分離篩選出一株嗜堿細(xì)菌，具有很高的產(chǎn)堿性果膠酶能力，經(jīng)鑒定為吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)，目前還未見用該菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株嗜堿細(xì)菌吉氏芽孢桿菌S-2菌株，它具有很高的產(chǎn)堿性果膠酶能力；并提供一種利用該菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。
該菌株是從堿性土壤中分離得到，篩選方法采用平板透明圈法。菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號為CGMCC No.1215。該菌株的16S rDNA與Bacillus gibsonii DSM No.8722菌株的相似性為99.6％，其DNA序列已遞交到GenBank，可通過序列號AY737309查看。
采用該菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的步驟如下1、菌種保藏。菌種吉氏芽孢桿菌S-2菌株保藏于4℃冰箱內(nèi)堿性瓊脂培養(yǎng)基斜面，半年轉(zhuǎn)接一次。培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖0.2％，氯化鈉0.2％，磷酸氫二鉀0.12％，碳酸鈉0.3％，瓊脂1.5％，于115℃滅菌15分鐘。
2、種子培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基組成胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖0.2％，氯化鈉0.2％，磷酸氫二鉀0.12％，碳酸鈉0.3％；于115℃滅菌15分鐘。接種，30℃搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)，既得液體種子。
3、固態(tài)發(fā)酵。產(chǎn)堿性果膠酶固態(tài)培養(yǎng)基是向含果膠固體生物質(zhì)(甜菜粕、米糠、橘皮、蘋果渣等)中添加3倍重量的營養(yǎng)液制成，營養(yǎng)液組成酵母浸膏1.0％，磷酸二氫鉀0.15％，碳酸鈉0.6％。甜菜粕和營養(yǎng)液分別于115℃滅菌15分鐘，按重量比1∶3混合均勻，接種液體種子，于35℃靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。
4、酶的提取和凈化。固態(tài)發(fā)酵后的物料加入3倍重量的水，浸泡30分鐘，在離心機(jī)中進(jìn)行固液分離，提取液用孔徑0.1μm的微濾膜過濾除去菌體，濾液用截留分子量為10000的超濾膜濃縮，收集濃縮液，即堿性果膠酶溶液，貯藏。
實(shí)施例1不同含果膠生物質(zhì)及培養(yǎng)基不同濕度對產(chǎn)酶影響分別在5g(干重)含果膠固體生物質(zhì)中加入1倍、2倍、3倍、4倍水，每分水中溶解有蛋白胨0.15g、磷酸二氫鉀0.23g、碳酸鈉0.09g，攪拌均勻，于35℃靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果見表1。
表1各種含果膠生物質(zhì)及培養(yǎng)基不同濕度對產(chǎn)酶影響含果膠生物質(zhì)不同培養(yǎng)基濕度果膠酶產(chǎn)率(u/g生物質(zhì))1倍水 2倍水 3倍水 4倍水麩皮 365 240 185 155米糠 905 1050 830 665甜菜粕 1050 1345 1560 1260蘋果渣 510 690 855 685桔皮粉 315 540 690 655注采用DNS法測定酶活，1個(gè)酶活力單位(u)定義為在55℃，pH10.5反應(yīng)條件下，每分鐘降解聚半乳糖醛酸鈉產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶的量。
實(shí)施例2不同氮源對產(chǎn)酶的影響向甜菜粕中添加3倍重量的營養(yǎng)液，營養(yǎng)液組成不同氮源1.0％，磷酸二氫鉀0.15％，碳酸鈉0.6％。甜菜粕和營養(yǎng)液分別于115℃滅菌15分鐘，按重量比1∶3混合均勻，接種液體種子，于35℃靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果見表2。
實(shí)施例3不同碳酸鈉添加量對產(chǎn)酶的影響向5克甜菜粕中添加15毫升營養(yǎng)液，營養(yǎng)液組成酵母膏1.0％，磷酸二氫鉀0.15％，碳酸鈉0-1.5％。甜菜粕和營養(yǎng)液分別于115℃滅菌15分鐘，按重量比1∶3混合均勻，接種液體種子，于35℃靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果見
圖1。當(dāng)碳酸鈉0.6％時(shí)，產(chǎn)酶率最高，達(dá)到3500單位/克干菜渣。
表2不同氮源對產(chǎn)酶的影響氮源 相對酶活(％)蛋白胨 100酵母膏 151大豆蛋白胨 105酵母浸粉 126KNO386.0NaNO388.6麩皮 130豆餅粉 110魚粉 115不添加氮源 43
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)堿性果膠酶的嗜堿細(xì)菌及其固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，該嗜堿細(xì)菌可以利用含果膠生物質(zhì)(甜菜粕、米糠、麩皮、橘皮、蘋果渣等)發(fā)酵合成堿性果膠酶；以含果膠生物質(zhì)為碳源，加入氮源、磷酸鹽、碳酸鈉和水，接種該菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方法合成堿性果膠酶。
2.權(quán)利要求
書1所述的嗜堿細(xì)菌，其特征在于，通過測定其16S rDNA序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號為CGMCC No.1215。
3.權(quán)利要求
書1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，發(fā)酵碳源為含果膠生物質(zhì)，包括甜菜粕、水果加工殘?jiān)?、米糠、麩皮等；氮源包括酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆餅粉、魚粉、硝酸鹽等。
4.權(quán)利要求
書1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，培養(yǎng)基組成(w/w)果膠生物質(zhì)20％-50％，氮源0.2％-1％，磷酸鹽0.02％-0.5％，碳酸鈉0.05％-0.5％，水50％-80％；培養(yǎng)溫度20℃-37℃；靜態(tài)培養(yǎng)48-72小時(shí)。
5.權(quán)利要求
書1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法，其特征在于，發(fā)酵后熟物用水浸提15-50分鐘，離心或壓濾除去殘?jiān)?，得到水溶液即為堿性果膠酶水溶液；該酶液可以通過孔徑0.1μm的微濾膜過濾除去菌體，再進(jìn)行超濾濃縮制備成濃縮酶液或噴霧干燥制備成干粉便于貯藏。
專利摘要
本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)堿性果膠酶的吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii)S－2菌株，并提供了一種利用該菌株固態(tài)發(fā)酵制備果膠酶的方法。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。發(fā)明以含果膠質(zhì)的廢棄生物質(zhì)為碳源和誘導(dǎo)物，添加適當(dāng)?shù)?、磷酸鹽、碳酸鈉和水分，接種吉氏芽孢桿菌S－2菌株，在接觸空氣條件下，于溫度35℃左右，靜態(tài)培養(yǎng)72小時(shí)左右達(dá)到產(chǎn)酶高峰。用水浸提培養(yǎng)物，過濾，濾液即堿性果膠酶液，超濾濃縮得到濃縮酶液或噴霧干燥得到堿性果膠酶干粉。經(jīng)DNS法測定酶活力，果膠酶產(chǎn)率達(dá)到3500單位/克甜菜渣。(酶活力單位定義為在pH10.5，溫度55℃條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。)
文檔編號C12N1/20GKCN1605627SQ200410073818
公開日2005年4月13日 申請日期2004年9月3日
發(fā)明者白志輝, 張保國, 李祖明, 張洪勛 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan