本發(fā)明涉及微生物篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高產(chǎn)蝦青素的突變菌株及其應(yīng)用。技術(shù)背景蝦青素(Astaxanthin)，化學(xué)名稱為3，3-二羥基-β,β’-胡蘿卜素-4,4’-二酮，是一種非維生素A源的酮式類胡蘿卜素。由于其呈天然的紫紅色，所以最初在歐美一些國家是作為色素而被用做水產(chǎn)業(yè)的餌料添加劑。藥理學(xué)和生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蝦青素具有極強的生物抗氧化性，其抗氧化和淬滅自由基的能力比β胡蘿卜素強1.7倍，比維生素E強80倍，此外還具有促進抗體產(chǎn)生增強免疫力以及抗紫外線輻射等作用，因而在水產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。蝦青素的生理功能主要有以下幾個方面：1）抗氧化作用。蝦青素強大的抗氧化活性是因為其能穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)，降低膜通透性、限制過氧化物啟動子進入細胞內(nèi)。保護細胞內(nèi)重要分子免受氧化損傷。同時蝦青素可能具有潛在的成為促氧化劑誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。2）抗癌作用。對膳食類胡蘿卜素攝入量和癌癥發(fā)病率或死亡率間關(guān)系的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，癌癥總發(fā)病率或死亡率與類胡蘿卜素的攝入量呈顯著負相關(guān)。比較各種類胡蘿卜素抗腫瘤活性，以蝦青素的作用效果最強。蝦青素的抗腫瘤活性可能與它在細胞間的信號傳導(dǎo)，與異型物質(zhì)代謝酶的誘導(dǎo)生成，與腫瘤細胞相關(guān)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。3）增強機體免疫力。蝦青素能明顯增強機體局部和全身的免疫能力，這種免疫調(diào)節(jié)特性與抗氧化性相結(jié)合，在防止疾病的發(fā)生與傳播中發(fā)揮重要作用。更重要的是蝦青素能增強體內(nèi)T細胞的功能，增加嗜中性白細胞、自然殺傷細胞的數(shù)目，參與機體細胞免疫；蝦青素還可以增加免疫系統(tǒng)中B細胞的活力，消滅外源入侵的病原體，通過協(xié)助產(chǎn)生抗體并提高其他免疫組分的活性發(fā)揮作用。4）著色作用。類胡蘿卜素是水生動物體內(nèi)的主要色素物質(zhì)，而蝦青素占水生動物體內(nèi)類胡蘿素的大部分，因此可以說蝦青素是水生動物體內(nèi)的主要色素物質(zhì)。蝦青素是類胡蘿卜素合成的終點，它進入動物體后可以不經(jīng)修飾或生化轉(zhuǎn)化而直接貯存在組織中，具有極強的色素沉積能力，使一些水生動物的皮膚和肌肉出現(xiàn)健康而鮮艷的顏色，使禽蛋及禽的羽毛、皮膚、腳、項均呈現(xiàn)健康的金黃色或紅色。蝦青素廣泛存在于生物界，特別是蝦、蟹、魚和鳥類的羽毛。蝦青素的生產(chǎn)主要有3種方法：化學(xué)合成法、提取法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法具有生產(chǎn)成本較低，產(chǎn)量高等優(yōu)點，但是合成的蝦青素多為順式結(jié)構(gòu)，而動物機體只對反式蝦青素有較高的吸收利用率；提取法主要從水產(chǎn)品加工的廢棄物中提取蝦青素，提取前必須除去廢棄物中的石灰質(zhì)成分，提取費用高且容易污染。當(dāng)前微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法主要有兩種，一是利用藻類生產(chǎn)（如雨生紅球藻培養(yǎng)）；二是利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素（如紅法夫酵母），發(fā)酵法生產(chǎn)的蝦青素天然無污染，但受到成本高、培養(yǎng)條件苛刻、產(chǎn)量低等因素的制約。例如，紅法夫酵母野生菌株產(chǎn)蝦青素量低，發(fā)酵溫度低易于退化，而且當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量濃度過高時，蝦青素產(chǎn)量會急劇的下降，這些性質(zhì)使其工業(yè)化生產(chǎn)受到制約。因此亟需通過選育獲得高產(chǎn)蝦青素、耐高溫、發(fā)酵溫度高、不易退化的優(yōu)良菌種，以提高蝦青素的產(chǎn)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母（Phaffiarhodozyma）菌株。所述紅法夫酵母是通過紫外誘變的方法篩選出的突變株，能大大提高蝦青素的產(chǎn)量，為低成本、規(guī)模化生產(chǎn)蝦青素奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明一方面涉及一種突變菌株紅法夫酵母XQS（PhaffiarhodozymaXQS），已于2016年12月19日保存于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016764。本發(fā)明還涉及上述紅法夫酵母在蝦青素生產(chǎn)中的應(yīng)用。一種生產(chǎn)蝦青素的方法，是以上述紅法夫酵母為發(fā)酵菌株。本發(fā)明從落葉上篩選到的自然菌株紅法夫酵母XQ（PhaffiarhodozymaXQ），其蝦青素產(chǎn)量為55.77mg/mL。申請人進一步通過紫外誘變和2-脫氧-D-葡萄糖篩選獲得的突變菌紅法夫酵母XQS，其蝦青素產(chǎn)量得到顯著提高，達78.42mg/mL，比出發(fā)菌紅法夫酵母XQ提高了40.6%，且遺傳性狀穩(wěn)定，取得了意料不到的技術(shù)效果。所述突變菌株可廣泛應(yīng)用于蝦青素的生產(chǎn)，有利于降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)蝦青素的有效推廣和使用。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。但本發(fā)明可用下文中的非限定性實施例作進一步的說明。本發(fā)明選用的原料均可購自市場上任意一種。實施例1產(chǎn)蝦青素自然菌株的篩選樣品來源：俄羅斯林場的落葉；從落葉表面刮下紅色的附著物，用無菌水稀釋后均勻涂布于分離平板上（葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，麥芽汁3g/L，瓊脂1g/L，pH5.0）上，置于28℃培養(yǎng)。菌落長出后，挑選其中紅色、粉紅色、橙紅色顏色較深且生長迅速的菌落，共29個，分別進行分離培養(yǎng)。將純化的菌株接種于保存斜面（葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，麥芽汁3g/L，瓊脂1g/L，pH5.0）上。將初篩得到的29株菌分別接種于YPD液體培養(yǎng)基（葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L；自然pH）中，28℃振蕩培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，即得種子培養(yǎng)液，然后在裝有30mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中按5%的接種量接入種子培養(yǎng)液，28℃振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，分別測定生物量和蝦青素含量，并計算蝦青素產(chǎn)量，根據(jù)單位體積發(fā)酵液的蝦青素產(chǎn)量篩選出蝦青素高產(chǎn)菌株。、生物量測定：取發(fā)酵液3mL加入離心管中，離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次后，將菌體轉(zhuǎn)移到預(yù)先烘干恒重的稱量瓶中，于105℃烘干至恒重。、蝦青素含量測定：1、儀器設(shè)備：高效液相色譜儀、色譜工作站、離心機、超聲清洗器、漩渦混合器、微量進樣器、微孔濾膜、色譜柱為Agilent不銹鋼柱（內(nèi)裝填料PLRS-S，10nm，長250nm，內(nèi)徑4.6mm）等。2、試劑：色譜甲醇、乙腈；3、檢測條件：流動相為乙腈：水（95:5）；流速為1.5mL·min-1；檢測波長為471nm，進樣量20μL。4、操作步驟(1)標(biāo)樣的制備準(zhǔn)確稱取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品0.05g(精確至0.0002g)溶于50mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。再用移液管取1mL至10mL容量瓶，色譜甲醇溶解，并定容至刻度，備用。(2)樣品制備取蝦青素生產(chǎn)菌株發(fā)酵液1mL加入離心管中，離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次后，用二甲亞砜55℃破壁處理5min，用乙醇多次萃取蝦青素，直到菌體呈白色。將萃取液定容到10mL，用0.22μm過濾器過濾，濾液用于HPLC檢測。在上述條件下，待儀器穩(wěn)定后注入標(biāo)樣溶液連續(xù)兩針標(biāo)樣蝦青素峰面積相對變化小于1.5%后，再將制備好的樣品進樣檢測。(3)計算方法蝦青素產(chǎn)量（g/L）=(樣品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品峰面積)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。檢測結(jié)果顯示，上述初篩得到的29株自然菌株中有8株蝦青素產(chǎn)量較高，考慮到生物量和蝦青素產(chǎn)量兩個標(biāo)準(zhǔn)，選擇蝦青素產(chǎn)量最高的一株命名為XQ，其生物量為7.538mg/mL，蝦青素產(chǎn)量為55.77mg/mL。申請人采用分子生物學(xué)的方法對上述篩選得到的XQ菌株進行鑒定，測得其18srDNA序列，并在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)其與紅法夫酵母（Phaffiarhodozyma）的序列相似性達99%。進一步結(jié)合XQ菌株的菌落形態(tài)，申請人確認(rèn)上述篩選到的高產(chǎn)蝦青素的XQ菌株為紅法夫酵母（Phaffiarhodozyma），命名為紅法夫酵母XQ（PhaffiarhodozymaXQ）。實施例2紅法夫酵母XQ的誘變篩選申請人為了進一步提高紅法夫酵母XQ的蝦青素產(chǎn)量，對該菌株進行紫外誘變，獲得蝦青素產(chǎn)量提高的紅法夫酵母突變菌株。紫外誘變處理及劑量確定打開40W紫外燈開關(guān)，預(yù)熱約30min。取直徑9cm無菌平皿，加入細胞濃度為OD600＝0.25的紅法夫酵母XQ菌懸液7mL，放入一根無菌磁力攪拌器；打開磁力攪拌器，然后打開皿蓋，在垂直距離為15cm處，分別攪拌照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈，黑暗中孵育30min。將照射后的菌懸液用0.85％生理鹽水10倍稀釋法梯度稀釋成10-1～10-5；取10-3、10-4、10-5三個稀釋度的菌懸液各100μL，涂布YPD固體平板，每個稀釋度涂布三個平板，均勻涂滿整個平板表面；以同樣的操作，取未經(jīng)紫外線照射的菌液稀釋涂平板作對照。將上述涂布均勻的平板，用報紙包好后，置37℃過夜培養(yǎng)。統(tǒng)計不同照射時間時每個稀釋度下平板上長出的單菌落數(shù)，若在某個稀釋度下平板上長出的單菌落數(shù)在30～300個之間，則認(rèn)為該稀釋度合適。將該稀釋度下三個平板上長出的單菌落數(shù)求平均值，按下列公式計算菌懸液濃度：菌懸液濃度(CFU/mL)＝某個稀釋度下的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10按下列公式計算某個紫外處理劑量下的致死率：致死率=(未誘變的菌懸液濃度-誘變后的菌懸液濃度)/未誘變的菌懸液濃度×100%經(jīng)計算，不同紫外誘變劑量下紅法夫酵母XQ的致死率如表1所示。表1紫外線誘變致死率時間/s0306090120150180致死率/s00034%60%86%93%從表1的數(shù)據(jù)可以看出，紅法夫酵母XQ菌懸液經(jīng)紫外照射180s后致死率就達到93％，因此最終確定誘變時間為180s。紫外誘變與2-脫氧-D-葡萄糖篩選取一個90mm培養(yǎng)皿，加入5ml稀釋好的紅法夫酵母XQ菌懸液懸液（濃度為1×107），加入轉(zhuǎn)子并在磁力攪拌器上攪拌使菌懸液處于均勻狀態(tài)。在無菌超凈工作臺中，用功率為40w的紫外燈于垂直距離20cm的上方照射180s。將紫外照射后的菌懸液稀釋1000倍，取100ul涂布分離平板（葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，2-脫氧-D-葡萄糖1g/L，瓊脂20g/L；自然pH），30℃培養(yǎng)2-3d。因分離平板中添加了2-脫氧-D-葡萄糖，因此能在分離平板上長出的菌株均為抗葡萄糖阻謁效應(yīng)的突變菌株，能有效提高紅法夫酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。據(jù)統(tǒng)計，經(jīng)過紫外誘變和2-脫氧-D-葡萄糖篩選，申請人共獲得21株突變菌株。分別挑取上述突變菌株接種于YPD固體平板上，30℃培養(yǎng)2-3d，觀察平板上菌落的顏色和長勢,如果顏色變淡的就淘汰，選擇顏色紅的菌落，再傳一代按上法進行選擇。經(jīng)過三次傳代后，上述獲得的31株突變菌中只有12株突變菌的菌落一直為紅色，且長勢良好，遺傳性狀穩(wěn)定。蝦青素產(chǎn)量分析將上述篩選獲得的遺傳性狀穩(wěn)定的12株突變菌，分別接種于裝有50mLYPD液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉(zhuǎn)速150rpm。同時以出發(fā)菌株紅法夫酵母XQ為對照，采用上述同樣條件進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，采用實施例1所述方法分別測定生物量和蝦青素含量，并計算蝦青素產(chǎn)量。結(jié)果顯示，上述篩選獲得的突變菌中蝦青素產(chǎn)量最高為78.42mg/mL，比出發(fā)菌紅法夫酵母XQ提高了40.6%，取得了意料不到的技術(shù)效果。申請人將該蝦青素產(chǎn)量最高的突變菌株命名為紅法夫酵母XQS（PhaffiarhodozymaXQS），并于2016年12月19日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016764。當(dāng)前第1頁1 2 3