本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種提高丹參產(chǎn)量及其有效成分含量的內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丹參SalviamiltiorrhizaBge.是唇形科鼠尾草屬植物，其干燥根及根莖同名入藥。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國常用傳統(tǒng)中藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效。丹參是我國臨床應(yīng)用最廣泛、最重要的中藥品種之一。丹參的活性成分主要分為兩大類：水溶性成分——酚酸類化合物，包括原兒茶醛、丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；脂溶性成分——丹參酮類化合物，包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、ⅡB、隱丹參酮Ⅰ、羥基丹參酮、丹參羥基酯、二氫丹參酮Ⅰ等。上述兩類成分是丹參發(fā)揮藥理如擴(kuò)血管、活血化瘀、改善微循環(huán)、抗腫瘤的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。雖然丹參資源區(qū)域廣闊，且已進(jìn)行大量的人工栽培；但是其分布不集中，資源更新周期長，且人工栽培技術(shù)要求高，藥材質(zhì)量參差各異。隨著丹參酮類和丹酚酸類化學(xué)成分眾多藥理活性的發(fā)現(xiàn)，其市場(chǎng)需求增大，通過直接采收丹參天然和人工資源將不能滿足市場(chǎng)需求。另一方面，丹參酮類和丹酚酸類成分的化學(xué)合成困難，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。研究者們?cè)噲D通過生物技術(shù)方法獲得丹參酮類和丹酚酸類有效成分，因此，近年來這已成為人們關(guān)注的課題。中國專利文獻(xiàn)CN102676392A公開了一種丹參內(nèi)生真菌及其應(yīng)用，是從丹參植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為木霉Trichodermaatroviride，保藏號(hào)為CGMCCNo.4712，通過其液體發(fā)酵，產(chǎn)生了丹參酮化合物丹參酮I和丹參酮IIA。中國專利文獻(xiàn)CN104830717A公開了具有誘導(dǎo)丹酚酸B積累作用的丹參內(nèi)生真菌，為PseudomonaspsychrotoleransLG4，其保藏號(hào)為：CCTCCNO:M2015085，可促進(jìn)丹參毛狀根中酚酸類物質(zhì)(丹酚酸B)含量的積累。中國專利文獻(xiàn)CN103992961A公開了一株提高丹參產(chǎn)量及酚酸類成分含量的真菌，它是保藏編號(hào)為CGMCCNo.6627的擬青霉(Paecilomycessp.)，栽培丹參時(shí)在每株丹參幼苗根部分別施予固體培養(yǎng)的菌材0.5-1.5g，經(jīng)與丹參幼苗共生栽培4-6月，能提高收獲期時(shí)丹參的產(chǎn)量和丹參總酚酸及丹酚酸B的含量?？梢姡瑥牡⒅袑ふ业叫碌膬?nèi)生真菌，特別是能夠提高宿主丹參生物量和有效成分含量的內(nèi)生真菌，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員不懈的追求。目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道從丹參中分離到可以同時(shí)提高丹參酮類和丹酚酸類成分的內(nèi)生真菌，也未見報(bào)道可以提高丹參植株生物量和有效成分含量的球毛殼菌。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新的丹參內(nèi)生真菌，并且提供其用途，即能夠提高丹參植株生物量及丹參酮類與酚酸類有效成分的含量。本發(fā)明的第一方面，提供一種丹參內(nèi)生真菌，命名為球毛殼D68(Chaetomiumglobosum)。所述的丹參內(nèi)生真菌是從唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為球毛殼D68(Chaetomiumglobosum)。該菌株已保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.12622，保藏日期為2016年6月16日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101。本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌顯微特征為：菌落直徑55mm，質(zhì)地絮狀，淺灰色，鋪展，后期形成大量橄欖褐色子囊殼；菌落背面褐色，無水溶性色素。子囊殼淺到深褐色，球形或橢球形，可達(dá)200～550μm；附屬絲具分隔，不分枝，頂端彎曲或稍彎曲，壁粗糙，基部淺到深褐色，頂端橄欖褐色，寬2.3～4.0μm；子囊早期消解；子囊孢子寬檸檬形、近球形，褐色，壁略粗糙，6.5～11.4×6.1～8.0μm。未見無性態(tài)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌的rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果，包括18SrRNA片段，ITS1、5.8SrRNA、ITS2的全序列及28S區(qū)序列片斷如SEQIDNO.1所示。將測(cè)序結(jié)果(SEQIDNO.1)于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)的相似性為100％。本發(fā)明的第二方面，提供上述的丹參內(nèi)生真菌在提高丹參植株生物量中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面，提供了一種提高丹參植株生物量的方法，是將本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌與丹參植株的共培養(yǎng)。本發(fā)明的第四方面，提供上述的丹參內(nèi)生真菌在提高丹參中丹參酮類和丹酚酸類含量中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五方面，提供一種提高丹參中丹參酮類和丹酚酸類含量的方法，所述的方法是將上述的丹參內(nèi)生真菌與丹參植株共培養(yǎng)。所述的共培養(yǎng)，是在丹參培苗根部接觸基質(zhì)的地方均勻撒20g固體菌種，用滅菌的盆栽土基質(zhì)將丹參組培苗根部埋好，用無菌水將植株澆透。將花盆移入溫室，前1周用保鮮膜拱膜保濕，7天后移去。所用的培養(yǎng)基包括：A)內(nèi)生真菌活化培養(yǎng)基：PDA土豆固體培養(yǎng)基(土豆200g，葡萄糖20g，每1L去離子水)；B)丹參培苗培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，pH5.8；C)內(nèi)生真菌固體菌種培養(yǎng)基：麥麩250g，棉籽殼250g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4.7H2O1.5g，每1L去離子水；D)內(nèi)生真菌與丹參共培養(yǎng)盆栽土基質(zhì)為珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基質(zhì)。栽培器具：塑料花盆(盆口直徑10cm，盆底直徑7cm，盆高9cm)。溫室培養(yǎng)溫度：25℃±1℃；每日光照：16h；光照度：2000Ix。所述的共培養(yǎng)具體包括以下步驟：(A)取本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28℃活化培養(yǎng)72小時(shí)；(B)在丹參培苗根部接觸基質(zhì)的地方均勻撒20g固體菌種，用滅菌的盆栽土基質(zhì)將丹參組培苗根部埋好，用無菌水將植株澆透；將花盆移入溫室，前1周用保鮮膜拱膜保濕，7天后移去；所述的丹參內(nèi)生真菌與丹參共培養(yǎng)盆栽土基質(zhì)為珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基質(zhì)。所述的共培養(yǎng)后，可采用回流提取及固液分離等方法從丹參植株根中分離提純得到丹參酮類和酚酸類有效成分。所述的丹參酮類和酚酸類有效成分包括：丹參酮I，隱丹參酮，二氫丹參酮I，丹參酮IIA，迷迭香酸，丹酚酸B。其中，丹參酮I，英文名：TanshinoneI，分子式：C18H12O3，CAS：568-73-0，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：隱丹參酮，別稱：隱丹參醌，英文名：Cryptotanshinone，分子式：C19H20O3，CAS：35825-57-1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：二氫丹參酮I，英文名：DihydrotanshinoneI，分子式：C18H14O3，CAS：87205-99-0，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：丹參酮IIA，英文名：TanshinoneIIA，分子式：C19H18O3，CAS：568-72-9，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：迷迭香酸，英文名：Rosmarinicacid，分子式：C18H16O8，CAS：20283-92-5，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：丹酚酸B，英文名：SalvianolicacidB，分子式：C36H30O16，CAS：115939-25-8，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌，通過和丹參植株共培養(yǎng)能夠有效地提高丹參根生物量，且對(duì)植株的冠幅、株高以及單個(gè)葉面積均有顯著提高，還可有效促進(jìn)丹參中丹參酮類和酚酸類有效成分的生物合成，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。生物材料樣品的保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)保藏日期：2016年6月16日保藏編號(hào)：CGMCCNO.12622分類命名：球毛殼D68(Chaetomiumglobosum)附圖說明圖1.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖。圖2.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌子囊殼(A)和子囊孢子(B)在PDA平板培養(yǎng)基中的顯微圖。圖3.本發(fā)明所述丹參內(nèi)生真菌菌絲作用于丹參植株60天后丹參植株生物量(A)、葉子數(shù)、冠幅、株高以及單個(gè)葉面積(B)、丹參酮類的含量(C)、丹酚酸類的含量(D)以及丹參酮類成分總量(E)和丹酚酸類成分總量(F)(Control為對(duì)照組，其余為處理組，D68為本發(fā)明所述內(nèi)生真菌)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。實(shí)施例1：丹參內(nèi)生真菌的分離純化本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌為從山西芮城丹參葉中得到的菌株。本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌按以下步驟分離獲得：自來水沖洗30min去凈泥沙后，用去離子水洗3次。將葉片按以下程序進(jìn)行表面消毒：75％乙醇，30s→1.3M次氯酸鈉(3-5％有效氯)，1min→75％乙醇，30s→無菌去離子水洗3次。濾紙吸干殘留水份后，用滅過菌的手術(shù)刀將葉片剪成1cm×1cm大小的組織塊，置于含有100mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂，15g/L)培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)。每天觀察樣品真菌生長的情況。5-7天后有菌絲長出，挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，并按形態(tài)合并，最終得到本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌菌株。其分類命名為球毛殼D68(Chaetomiumglobosum)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12622。如圖1所示，本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上菌落生長快，25℃黑暗條件下7天菌落直徑55mm，質(zhì)地絮狀，淺灰色，鋪展，后期形成大量橄欖褐色子囊殼；菌落背面褐色，無水溶性色素。如圖2A，2B所示，本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌顯微特征為：子囊殼淺到深褐色，球形或橢球形，可達(dá)200～550μm；附屬絲具分隔，不分枝，頂端彎曲或稍彎曲，壁粗糙，基部淺到深褐色，頂端橄欖褐色，寬2.3～4.0μm；子囊早期消解；子囊孢子寬檸檬形、近球形，褐色，壁略粗糙，6.5～11.4×6.1～8.0μm。未見無性態(tài)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2：丹參無菌苗的培養(yǎng)本發(fā)明的丹參種子購于陜西商洛天士力丹參種植基地。本發(fā)明的丹參無菌苗按以下步驟培養(yǎng)：將丹參種子用40-50℃熱水浸泡2h后，用無菌紗布抹掉種子表面的黏粘物；然后采用常規(guī)消毒法進(jìn)行消毒處理：75％乙醇30s，2％NaClO3min，75％乙醇30s，無菌水沖洗10次，最后接種至MS培養(yǎng)基上25℃、16h光照/8h黑暗培養(yǎng)，待種子萌發(fā)轉(zhuǎn)移至新的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌苗。實(shí)施例3：丹參植株根中丹參酮類和丹酚酸類有效成分含量的測(cè)定制備丹參植株實(shí)生根收獲時(shí)，洗掉丹參根上的土，蒸餾水洗3次后濾紙吸干殘留水分。50℃烘干至恒重后，按以下方法測(cè)定成分的丹參酮類和丹酚酸類有效成分含量。采用高效液相色譜法(HPLC)分析丹參酮類和丹酚酸類有效成分的含量，主要定量檢測(cè)迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I的含量。具體步驟如下：丹參根HPLC進(jìn)樣樣品的制備：精密稱量烘干至恒重的丹參根，記錄干重后研成粉末。精密稱取毛狀根粉末0.5g，加入250ml乙醇超聲提取60分鐘，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10ml。所得提取溶液過0.45um微孔濾膜即得HPLC進(jìn)樣樣品溶液。HPLC色譜分析條件：色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05％甲酸水(B)，梯度洗脫(0～20min，A相由20％增加至40％；20～21min，A相由40％增加至80％；21～40min，A相由80％增加至90％；40～45min，A相由90％降至20％)；流速：0.8ml/min；檢測(cè)波長：280nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：(1)迷迭香酸：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品迷迭香酸8mg于2ml容量瓶中，加甲醇定容刻度線，搖勻得濃度為4mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制lmg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml和0.125mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)丹酚酸B：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品丹酚酸B8mg于5ml容量瓶中，加甲醇定容刻度線，搖勻得濃度為1.6mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml和0.05mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)隱丹參酮：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品隱丹參酮5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻得濃度為0.5mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml，0.005mg/ml和0.001mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)二氫丹參酮I：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品二氫丹參酮I5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻得濃度為0.5mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml，0.005mg/ml，0.001mg/ml和0.0002mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(5)丹參酮I：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品丹參酮I1.5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻得濃度為0.15mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制0.0375mg/ml，0.015mg/ml，0.0075mg/ml，0.00375mg/ml和0.0015mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)丹參酮IIA：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品丹參酮IIA4mg于100ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻得濃度為0.04mg/ml的母液，以母液為基礎(chǔ)，配制0.016mg/ml，0.008mg/ml，0.004mg/ml，0.002mg/ml和0.001mg/ml濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。丹參根樣品中丹參酮類和丹酚酸類的有效成分含量測(cè)定：取上述制備的樣品溶液10ul進(jìn)樣，按上述HPLC色譜條件進(jìn)行丹參有效成分的分析，根據(jù)回歸方程進(jìn)行定量計(jì)算。表1.六種丹參有效成分的線性回歸方程化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2線性范圍(μg·ml-1)n迷迭香酸Y＝7101.7X–87.58115.625～4000.007丹酚酸BY＝4583.1X+16.5970.99995.00～1600.007二氫丹參酮ⅠY＝25322X–37.8580.99930.20～500.007丹參酮ⅠY＝34512X+23.0850.99941.50～150.006隱丹參酮Y＝22632X–53.4290.99621.00～500.006丹參酮ⅡAY＝33493X–13.9010.99941.00～40.006本發(fā)明所述的六種丹參有效成分含量測(cè)定的線性回歸方程及線性范圍如表1所示。測(cè)量結(jié)果顯示(圖3C和D)，與本發(fā)明所述的丹參內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的丹參植株中丹參酮類和丹酚酸類有效成分含量與對(duì)照組相比有顯著提高。其中，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹酚酸B分別為對(duì)照組的3.30倍，1.66倍，1.82倍和2.33倍。實(shí)施例4：丹參內(nèi)生真菌對(duì)丹參植株根生物量及有效成分生物合成的影響將本發(fā)明所述的丹參植株和球毛殼D68進(jìn)行共培養(yǎng)，包括以下步驟：(A)取本發(fā)明的丹參內(nèi)生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28℃活化培養(yǎng)72小時(shí)；(B)丹參內(nèi)生真菌與丹參植株培養(yǎng)方法為共培養(yǎng)，在丹參組培苗根部接觸基質(zhì)的地方均勻撒20g固體菌種，對(duì)照組撒20g不加菌的固體菌種培養(yǎng)基。用滅菌的盆栽土基質(zhì)將丹參組培苗根部埋好，用無菌水將植株澆透。將花盆移入溫室，前1周用保鮮膜拱膜保濕，7天后移去。內(nèi)生真菌與丹參共培養(yǎng)盆栽土基質(zhì)為珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基質(zhì)。栽培器具：塑料花盆(盆口直徑10cm，盆底直徑7cm，盆高9cm)。培養(yǎng)室溫度：25℃±1℃每日光照：16h光照度：2000Ix。(C)將丹參內(nèi)生真菌與丹參植株共培養(yǎng)60天的丹參植株收獲，測(cè)量葉子數(shù)目、冠幅、株高以及單個(gè)葉面積。取丹參根稱量鮮重，干燥至恒重后稱量干重；最后用回流提取及固液分離等方法從丹參植株根中分離提純得到丹參酮類和酚酸類有效成分，測(cè)量干燥根樣品中的迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮I的含量。從圖3A和B中數(shù)據(jù)可以看出，丹參內(nèi)生真菌D68能夠有效地提高丹參根生物量，植株濕重和干重分別是對(duì)照組的3.74倍和5.20倍。且對(duì)植株的冠幅、株高以及單個(gè)葉面積均有顯著提高。結(jié)合實(shí)施例3中所述結(jié)果，丹參內(nèi)生真菌D68(圖3E和F)對(duì)丹參植株中兩類有效成分的總量(含量乘以干重)影響更為顯著，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹酚酸B分別為對(duì)照組的14.78倍，8.32倍，9.04倍，6.36倍，6.82倍和11.89倍，提示D68可有效促進(jìn)丹參中有效成分的生物合成。以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)<120>一種提高丹參產(chǎn)量及其有效成分含量的內(nèi)生真菌及其應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>518<212>DNA<213>球毛殼菌Chaetomiumglobosum<400>1aaaggtggtttaacggccggaacccgcggcgcgaccagagcgagatgtatgctactacgc60tcggtgcgacagcgagcccgccactgcttttcagggcctgcggcagccgcaggtccccaa120cacaagcccgggggcttgatggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatgc180tggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacatta240cttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaag300ttttgacttattcagtacagaagactcagagaggccataaattatcaagagtttggtgac360ctccggcgggcgcccgcggtggggcccaggggcgcccggggggtaaaccccggggccgcc420cgccgaagcaacggtataggtaacgttcacaatggtttagggagttttgcaactctgtaa480tgatccctccgctggttcaccaacggagaccttgttac518當(dāng)前第1頁1 2 3