本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種基于高通量測序檢測t細(xì)胞白血病微小殘留病的方法。
背景技術(shù)：
：白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能，t細(xì)胞白血病屬于t細(xì)胞的惡性克隆性增值。隨著化療、特異靶向治療、造血干細(xì)胞移植(hsct)治療等技術(shù)的不斷改進(jìn)，白血病的治療效果日益改善，然而復(fù)發(fā)仍是困擾白血病治愈的一個難點，究其原因主要與白血病細(xì)胞微小殘留病(mrd)有關(guān)。mrd是指經(jīng)過誘導(dǎo)治療達(dá)到完全緩解時，患者體內(nèi)殘存的少量白血病細(xì)胞。近年來研究表明，白血病復(fù)發(fā)與mrd密切相關(guān)，mrd升高可提前預(yù)示白血病的全面復(fù)發(fā)。因此，采用靈敏度高、特異性強(qiáng)及穩(wěn)定可靠的試驗方法對白血病患者進(jìn)行定期mrd檢測，對評估疾病狀態(tài)、判斷療效、預(yù)測復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療具有重要的臨床意義。t細(xì)胞白血病患者有>50％的復(fù)發(fā)率，因此要定期檢測mrd，來幫助設(shè)計個性化的治療方法。目前檢測mrd的方法主要依賴于分子免疫學(xué)技術(shù)如流式細(xì)胞儀術(shù)(flowcytometry)，但其靈敏度最高僅可達(dá)10-4數(shù)量級(0.01％)，且該方法對mrd結(jié)果的判斷在很大程度上有賴于每個實驗室的實驗條件和操作者的個人經(jīng)驗，標(biāo)準(zhǔn)化程度低，而且有研究表明在化療過程中由于化療藥物的影響使白血病細(xì)胞的免疫表型發(fā)生變化，即“免疫漂移”現(xiàn)象，可影響mrd結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。t細(xì)胞基因座上大量的v(可變區(qū))、d(多變區(qū))、j(連接區(qū))基因片段在t細(xì)胞受體的形成中會產(chǎn)生各種多樣性重組。這種v-d-j基因的重組賦予了每一種t細(xì)胞自己獨特的t細(xì)胞受體(tcr)，從而使得每一個tcr的序列能有效的成為一個t細(xì)胞克隆的唯一生物標(biāo)志物。因此對t細(xì)胞tcr基因的序列組成進(jìn)行測序，可以很好的定位每一種t細(xì)胞，其中包括白血病癌變的t細(xì)胞，并且靈敏度最高可達(dá)10-6(0.0001％)。由于tcr基因的最大特點是v、d、j基因片段的隨機(jī)重組，所以，針對未知基因序列，很難設(shè)計一個上游引物用于識別tcr基因的5’端序列，所以也無法利用pcr技術(shù)擴(kuò)增tcr基因和測序。而另外一種tcr測序方法，即多重引物pcr的方法，只能測序tcr基因中的部分序列信息，這樣使得測序基因信息不完整。另外，多重引物pcr方法的引物是根據(jù)已知v，j基因設(shè)計的，但在癌癥病人中，癌細(xì)胞的基因突變是很常見的，如果白血病癌細(xì)胞的tcr產(chǎn)生了突變，那么已知序列的引物就有可能無法識別突變后的基因，對檢測結(jié)果來說，就容易造成假陰性。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于高通量測序檢測t細(xì)胞白血病微小殘留病的方法,通過高通量測序構(gòu)建t細(xì)胞白血病微小殘留病tcr文庫,以及構(gòu)建的cdna接頭和單對引物，以及文庫制備方法，通過從接頭的上游引物到c區(qū)的下游引物，獲得tcr基因序列的全長信息。解決以上技術(shù)問題的一種利用高通量測序檢測t細(xì)胞白血病微小殘留病的方法，其特征在于：包括如下步驟：(1)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(2)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；淋巴細(xì)胞分離液的作用在于可以從全血里分離淋巴細(xì)胞，分離后的細(xì)胞群所獲得的rna是除去了紅細(xì)胞、血小板等細(xì)胞的rna的。所以建庫使用的總rna內(nèi)含t細(xì)胞rna模板純度更高。(3)利用trizol的方法提取pbmc的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；步驟如下：收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，加入1mltrizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心，7500g×5min，棄上清。自然風(fēng)干，加入50ul的depch2o溶解，得到淋巴細(xì)胞總rna。(4)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并同時在cdna5’端添加接頭,用于后面pcr擴(kuò)增時5’端引物結(jié)合；在反轉(zhuǎn)錄時，同時添加接頭，可以最小化rna在多步反應(yīng)過程中的丟失。rna在操作中穩(wěn)定性極差，非常容易降解，少量的步驟可以最大程度上減少降解，同時也節(jié)約了可用于擴(kuò)增的cdna制備時間。接頭即cdna5‘端的核酸接頭，為tcr5’oligo接頭。(5)pcr1:通過單對引物的方式擴(kuò)增重組tcrcdna；(6)pcr2和純化：為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增；pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化。pcr產(chǎn)物一般都含有過量的引物、taqdna酶及dntp。這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的文庫質(zhì)檢、測序反應(yīng)等過程，純化可以去除這些影響后續(xù)實驗的副產(chǎn)物。同時，純化的過程也是一個片段大小篩選的過程，本發(fā)明中的dna片段是在700bp左右，可利用不同體積的磁珠與pcr產(chǎn)物混合，磁珠/dna不同的體積比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠體積，可以成功去掉pcr擴(kuò)增時的錯誤(誤差)片段和引物雙聚體，讓我們的測序上機(jī)文庫只有我們的測序目標(biāo)dna片段，使得測序結(jié)果更加準(zhǔn)確，減少誤差。如圖3所示，通過文庫質(zhì)檢只發(fā)現(xiàn)了一個片段的峰。(7)進(jìn)行高通量測序：將所得的cdna文庫通過illuminamiseq平臺進(jìn)行測序，測序模式為pe300，文庫變性濃度為2nm，上機(jī)濃度為20pm，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果；根據(jù)得出特有的tcr序列是否大于10-4(0.01％)，即某種特有的t細(xì)胞是否大于10-4(0.01％)，從而判斷受試者的微小殘留病是呈陽性還是陰性，若mrd>10-4(0.01％)則為陽性，若mrd<10-4(0.01％)則為陰性。所述步驟(4)中接頭為tcr5’oligo接頭，其堿基序列為：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’。所述步驟(5)中單對引物及引物序列為：tcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’tcrc區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’。本發(fā)明中所述步驟(四)中按照以下比例混合每一個rna樣本：試劑體積1x(μl)，rna8(0.1μg～1μg)，tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1，孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘。按照以下比例制備pcr反應(yīng)緩沖液混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始cdna反轉(zhuǎn)錄42℃60分鐘70℃10分鐘4℃永久反應(yīng)結(jié)束后，就可獲得已在5’端添加了接頭的總cdna(如圖1)。所述步驟(五)中具體步驟如下：按照以下比例制備反應(yīng)體系：按照上述的反應(yīng)體系制備反應(yīng)體系，混合上述5樣試劑于pcr試管，混勻，離心數(shù)秒，把管壁上的液體殘留離心于管底。放置試管于pcr擴(kuò)增儀中，按照上述反應(yīng)程序開始運行。所述步驟(5)中pcr1反應(yīng)程序為:95℃3分鐘；95℃30秒；65℃1分鐘，25循環(huán)；72℃1分鐘；4℃永久。所述步驟(6)中具體步驟如下：按照以下比例制備反應(yīng)體系：所述步驟(6)中pcr2反應(yīng)程序為:94℃3分鐘；94℃30秒；55℃30秒，15循環(huán)；72℃20分鐘，72℃1分鐘，4℃永久。所述步驟(6)中具體純化步驟如下：a、添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻。b、在室溫孵化10分鐘。c、放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄。d、添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄。e、重復(fù)第四步2次。f、打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)。j、把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠。h、把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中。上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。本發(fā)明基于高通量測序技術(shù)，tcr測序單對引物的文庫構(gòu)建方法，通過在獲得t細(xì)胞rna后，在進(jìn)行rna至cdna反轉(zhuǎn)錄的同時，給cdna的5’端添加一個接頭，從而通過這個已知序列的接頭設(shè)計tcr擴(kuò)增上游引物，再配合tcr基因3’端c區(qū)基因(不變區(qū))設(shè)計下游引物，從而達(dá)到擴(kuò)增整個tcr序列全長基因的目的。本發(fā)明中檢測靈敏度可達(dá)10-6(0.0001％)，高于目前臨床檢測方法100倍。本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的基于高通量測序構(gòu)建白血病微小殘留病tcr文庫的cdna接頭和單對pcr引物或第二方面所述基于高通量測序構(gòu)建白血病微小殘留病tcr文庫的構(gòu)建方法在檢測白血病微小殘留病tcr克隆性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供基于高通量測序構(gòu)建白血病微小殘留病tcr文庫的接頭，引物及方法的有益效果為：1.獲得了人tcr全轉(zhuǎn)錄組序列；2.獲得了人特異性cdr1、cdr2和cdr3序列；3.獲得了人克隆性增值了后的tcr序列，以便作為白血病微小殘留病的檢測生物標(biāo)記物，尤其是提高了低于10-4(0.01％)的低拷貝數(shù)的t細(xì)胞克隆的檢出率。本發(fā)明在高通量測序平臺的基礎(chǔ)上，通過對人tcr基因測序結(jié)果進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，獲得了tcr在vdj重組時的基因偏好性，vdj基因組合信息，tcr克隆種類信息，tcr多樣性信息，cdr1、cdr2、cdr3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突變信息，等。正是這些因素形成數(shù)量龐大且種類多樣的tcr組庫。提供詳細(xì)的測序后生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，并且對整個實驗提供有效的質(zhì)量監(jiān)控，能最大程度減少實驗誤差及錯誤。通過對tcr的測序評估可以快速的，非侵入性的幫助醫(yī)療工作者和癌癥病人早期預(yù)測t細(xì)胞白血病微小殘留病(mrd)水平，mrd是指癌癥在在完全緩解后，體內(nèi)仍有殘留的癌變細(xì)胞，此為疾病復(fù)發(fā)的根源。為爭取患者長期無病生存和痊愈，必須對mrd進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，實時療效評估，治療指導(dǎo)及復(fù)發(fā)預(yù)測。附圖說明圖1本發(fā)明中rna反轉(zhuǎn)錄cdna示意圖圖2為本發(fā)明中利用兩次pcr擴(kuò)增tcrcdna并添加測序上機(jī)接頭示意圖圖3為本發(fā)明中測序文庫質(zhì)檢結(jié)果。圖4為本發(fā)明中tcr測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析比對，找出每條序列的信息(部分)圖5為本發(fā)明中tcr測序結(jié)果3d森林圖。展示受試者tcr的多樣性和克隆性情況，每一條柱代表一種tcr克隆，克隆性增值的tcr表示了白血病癌細(xì)胞的增值情況，增值的這一條tcr序列就可作為癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物，為將來每次的白血病微小殘留病檢測提供生物標(biāo)記物。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述:實施例1一種利用高通量測序檢測t細(xì)胞白血病微小殘留病的方法，包括如下步驟：(1)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(2)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；(3)利用trizol的方法提取pbmc的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；(4)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并在cdna5’端添加接頭用于后面pcr擴(kuò)增時5’端引物結(jié)合，具體步驟如下，所使用到的試劑：·tcr3’oligo(dt)引物(10μm)·5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液(250mmtris-hcl(ph8.3),375mmkcl,15mmmgcl2)·二硫蘇糖醇，dtt(20mm)美國thermoscientific#r0861·dntpmix(10mm)美國invitrogen#18427088·rnaseout(40u/μl)美國invitrogen#10777019·tcr5’oligo接頭(10μm)·superscriptiirt(200u/μl)美國invitrogen#18064022按照以下比例混合每一個rna樣本：試劑體積1x(μl)rna8tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘。按照以下比例制備pcr反應(yīng)緩沖液試劑體積1x(μl)5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液3.5dtt(20mm)1dntp(10mm)1rnaseout1tcr5’oligo接頭(10μm)1superscriptiirt1混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始cdna反轉(zhuǎn)錄42℃60分鐘70℃10分鐘4℃永久反應(yīng)結(jié)束后，就可獲得已在5’端添加了接頭的總cdna(如圖)(5)pcr1：通過“單對”引物的方式擴(kuò)增重組tcrcdna，具體步驟如下：所使用到的試劑：·q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)·tcr5’端接頭引物(上游引物)·tcrc區(qū)引物(下游引物)·去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr1反應(yīng)程序為:(6)pcr2(標(biāo)簽pcr)。為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增。具體步驟如下：所使用到的試劑：·q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)·標(biāo)簽上游引物·標(biāo)簽下游引物·去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr2反應(yīng)程序為:pcr2產(chǎn)物純化。上述pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化，具體步驟如下：所使用到的試劑：agencourtampurexpbeads(美國beckman#a63882)具體純化步驟如下：(1)添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻。(2)在室溫孵化10分鐘。(3)放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄。(4)添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄。(5)重復(fù)第四步2次。(6)打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)。(7)把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠。(8)把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中。上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。(7)進(jìn)行高通量測序。將所得的cdna文庫通過illumina平臺(美國illumina公司)進(jìn)行測序，測序模式為pe300，文庫變性濃度為2nm，上機(jī)濃度為20pm，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果。材料及試劑說明t淋巴細(xì)胞相關(guān)白血病患者：來源浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，患者知情同意。非特殊說明，本發(fā)明采用的試劑均為市售商品，本發(fā)明實施例采用的數(shù)據(jù)庫均為公開的在線數(shù)據(jù)庫。具體地，本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄5’端接頭序列、引物序列如下(5’-3’)：反轉(zhuǎn)錄步驟tcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’tcr5’oligo接頭：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’pcr1步驟tcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’tcrc區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’pcr2步驟標(biāo)簽上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’標(biāo)簽下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’rg＝rna核苷酸標(biāo)簽引物中下劃線部分為illumina測序標(biāo)簽序列，內(nèi)序列可更換為下表序列，用于同時檢測多個樣本時，利用不同的index1-index2組合和生物信息學(xué)算法區(qū)分各個樣本測序結(jié)果。引物設(shè)計：針對rna反轉(zhuǎn)錄時在tcr5’端添加的接頭序列和tcrc區(qū)基因進(jìn)行分析，采用oligo7.36和primerpremier6.0對引物二聚體以及莖環(huán)錯配進(jìn)行分析，在tcr5’端人工接頭設(shè)置了上游引物，針對c基因下游設(shè)計反向引物，擴(kuò)增tcr全長轉(zhuǎn)錄子區(qū)域序列，其中包含了tcr的fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4區(qū)域。實施例2本發(fā)明實施例1提供了一種t淋巴細(xì)胞受體(tcr)rna樣品的制備方法，包括如下步驟：收集新鮮的外周血樣本10毫升(ml)，按照ficoll-1077(美國sigma公司#10771)的說明書操作，獲得相對較純的外周血單核細(xì)胞(pbmc)；采用trizol的方法提取pbmc的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)，所獲得的總rna，利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合rnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32852)測定rna濃度，然后反轉(zhuǎn)錄rna；實施例3本發(fā)明實施例2提供了一種采用白血病微小殘留病tcr文庫的單對引物構(gòu)建白血病微小殘留病tcr高通量測序文庫的方法，包括如下步驟：以實施例1所得的rna為反轉(zhuǎn)錄模板，按照上述“第二方面”中第四部分中的試劑和步驟獲得加上了tcr5’端接頭的cdna。再按照上述“第二方面”中第五、六、七部分中的試劑和步驟進(jìn)行pcr1、pcr2和pcr2的產(chǎn)物(文庫)純化。文庫純化結(jié)束后，利用agilent2100bioanalyzer(美國agilent公司#g2939aa)檢測文庫的純度和大小，使用的試劑盒是agilentdna1000kit(美國agilent公司#5067-1504)，檢測結(jié)果如圖3所示，文庫大小在686bp，并且文庫純度相當(dāng)高，并未見到其他非特異性擴(kuò)增序列。利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合dsdnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32851)測定dna文庫濃度，并送公司進(jìn)行高通量測序(采用illuminamiseq，2*300pair-end)。采用本發(fā)明的tcr5’端接頭、引物以及文庫構(gòu)建后，高通量測序得到大約幾百萬條tcr序列。測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析(生物信息分析采用bowtie2aligner(ver.2.1.0)，tcr數(shù)據(jù)庫匹配來源于國際免疫基因信息系統(tǒng)www.imgt.org)，部分分析比對結(jié)果如下圖4、5所示。通過生物信息學(xué)分析，可以準(zhǔn)確地知道每條tcr序列的信息，氨基酸信息，條數(shù)以及所占比例。經(jīng)過tcr對比分析，本發(fā)明獲得了高通量測序tcr序列代表性克隆的統(tǒng)計分析結(jié)果，結(jié)果如圖4和5所示，圖5為tcr的重組基因v-j組合使用情況。由圖5可知，通過本發(fā)明的tcr5’端接頭、pcr引物以及測序文庫制備方法獲得的近百萬條的tcr序列中，可以得出特有的tcr序列是否大于10-4(0.01％)，也就某種特有的t細(xì)胞(癌細(xì)胞)是否大于10-4，從而判斷受試者的微小殘留病是陽性還是陰性(臨床參考值以mrd>10-4(0.01％)為陽性，mrd<10-4(0.01％)為陰性)。上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法構(gòu)建白血病微小殘留病tcr文庫能夠覆蓋tcr基因的多樣性信息，提高低拷貝數(shù)t細(xì)胞克隆的檢出率。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表sequencelisting<110>孫濤<120>一種基于高通量測序檢測t細(xì)胞白血病微小殘留病的方法<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>32<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr5’oligo接頭<400>1atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg32<210>2<211>22<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr3’oligo(dt)引物<400>2ttttttttttttttttttttga22<210>3<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr5’端接頭<400>3gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga57<210>4<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcrc區(qū)引物<400>4tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag62<210>5<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>5caagcagaagacggcatacgagatatctatcggtctcgtgggctgg46<210>6<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>6caagcagaagacggcatacgagattcaggtgagtctcgtgggctgg46<210>7<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>7caagcagaagacggcatacgagatcactagttgtctcgtgggctgg46<210>8<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>8caagcagaagacggcatacgagatgaattgccgtctcgtgggctgg46<210>9<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>9caagcagaagacggcatacgagatatgtacaagtctcgtgggctgg46<210>10<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>10caagcagaagacggcatacgagatgattcagtgtctcgtgggctgg46<210>11<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>11caagcagaagacggcatacgagatctgttcgtgtctcgtgggctgg46<210>12<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>12caagcagaagacggcatacgagattatacggcgtctcgtgggctgg46<210>13<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>13aatgatacggcgaccaccgagatctacactagctacttcgtcgccagcgtc51<210>14<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>14aatgatacggcgaccaccgagatctacacattatagctcgtcgccagcgtc51<210>15<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>15aatgatacggcgaccaccgagatctacaccccgtacttcgtcgccagcgtc51<210>16<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>16aatgatacggcgaccaccgagatctacacgggtataatcgtcgccagcgtc51<210>17<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>17aatgatacggcgaccaccgagatctacacagcaggtgtcgtcgccagcgtc51<210>18<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>18aatgatacggcgaccaccgagatctacactatacgtatcgtcgccagcgtc51<210>19<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacctagttcgtcgccagcgtc51<210>20<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽下游引物<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttgctactcgtcgccagcgtc51當(dāng)前第1頁12