本發(fā)明涉及一種檢驗技術領域，具體是一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒及其應用。

背景技術：

隨著人類基因組計劃(humangenomeproject，hgp)的完成，大量疾病相關基因的發(fā)現(xiàn)，促進了傳統(tǒng)生物醫(yī)學模式向可預測性、可預防性、個體化和參與性的基因組醫(yī)學模式轉(zhuǎn)變，為未來發(fā)展預防、診斷、治療長期困擾人類的諸如癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)和精神疾病等重大復雜性疾病開辟了新途徑，也為基因科學的產(chǎn)業(yè)化提供了良好的機遇。

全基因組關聯(lián)分析(genomewideassociationstudies，gwas)是應用人類基因組中數(shù)以百萬計的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)為標記進行病例一對照關聯(lián)分析，即在一定人群中收集病例組和對照組dna，進行snps芯片掃描，采用關聯(lián)分析比較受檢snps標記的某一等位基因頻率在病例組和對照組間有無顯著性差異，篩選與疾病關聯(lián)的基因序列變異，做出該snps是否與疾病關聯(lián)的判斷，預測疾病的患病率及風險。該方法研究前不需構(gòu)建任何假設，不再局限于候選基因或候選染色體區(qū)域作為關聯(lián)分析對象，而是針對基因組中所有snps，隨機進行基因分型，分析snps與疾病的關聯(lián)度，可在全基因組水平上，開展多中心、大樣本、反復驗證的基因與疾病的關聯(lián)研究，全面及時疾病發(fā)生、發(fā)展和治療的相關遺傳基因。

目前發(fā)現(xiàn)遺傳因素，或其與環(huán)境因素之間的相互作用參與了幾乎所有的人類疾病的發(fā)生過程。一些復雜的疾病往往不是由單一基因突變引起的，其發(fā)生發(fā)展與多基因多位點變異有關，且這些位點的變異可能與環(huán)境因素相關，這些位點可提高或降低個體患某種疾病的相對風險，被稱為該種疾病的易感位點。根據(jù)大量的gwas結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證明的一系列復雜疾病的易感位點已被普遍應用于基因檢測領域。

帕金森病(parkinson'sdisease,pd)是繼阿爾茨海默病之后的第二大常見神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特點是紋狀體黑質(zhì)中進行性的多巴胺能神經(jīng)元變性和存活神經(jīng)元內(nèi)的蛋白聚集，即路易小體。pd主要引起運動障礙，包括運動遲緩，靜止性震顫，肌強直和姿勢步態(tài)異常。目前沒有藥物能夠減緩此病進展，左旋多巴等藥物僅能緩解癥狀。pd的病因尚不清楚，但遺傳和環(huán)境因素被認為共同參與發(fā)病。遺傳因素在pd發(fā)病中的作用是肯定的，因為目前已有十幾個致病基因在家族遺傳性pd病例中被發(fā)現(xiàn)，例如snca、parkin、lrrk2、uch-l1、pink1等。這些致病基因的突變導致單基因遺傳形式的pd。但單基因遺傳形式的pd病例僅占所有病例的10％左右，絕大多數(shù)病例屬于散發(fā)性pd(joshuam.shulman,philipl.dejager,andmelb.feany.parkinson'sdisease:geneticsandpathogenesis[j].annualreviewofpathology,2011,6:193-222.)。

突觸核蛋白(alpha-synuclein,snca)基因是在家族性pd中發(fā)現(xiàn)的第一個致病基因，snca基因突變導致常染色體顯性遺傳性pd。它所編碼的蛋白-a-synuclein蛋白是路易小體的主要組成部分。snca基因的點突變、三倍重復突變和二倍重復突變在家族性pd病例中被發(fā)現(xiàn)，并且攜帶重復突變的患者的死后腦組織中野生型snca的表達增加(singletonab,farrerm,johnsonj,etal.alpha-synucleinlocustriplicationcausesparkinson'sdisease.[j].science,2003,302(5646):841-841.；chartier-harlinmc,kachergusj,roumierc,etal.α-synucleinlocusduplicationasacauseoffamilialparkinson'sdisease[j].lancet,2004,364(9440):1167-9.)。這就提示的重復突變snca可能通過過表達而對多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性，并導致家族性pd。snca基因不僅是家族性pd的一個致病基因，而且是散發(fā)性pd的一個易感基因，snca在散發(fā)性pd患者腦組織中表達增加(chiba-faleko,lopezgj,nussbaumrl.levelsofalpha-synucleinmrnainsporadicparkinsondiseasepatients[j].movementdisordersofficialjournalofthemovementdisordersociety,2006,21(10):1703-8.)。位于snca基因轉(zhuǎn)錄起始點上游10kb的一個微衛(wèi)星雙核苷酸重復序列等位基因長度多態(tài)-rep1，已經(jīng)被多個研究證實與散發(fā)性pd的易感性相關(linnertzc,saucierl,ged,etal.geneticregulationofalpha-synucleinmrnaexpressioninvarioushumanbraintissues.[j].plosone,2009,4(10)::e7480.)。

lrrk2基因突變在常染色體顯性遺傳pd中是最常見的遺傳因素，約占白種人群家族性pd的6％及散發(fā)性pd的2％(tianyy,tangcj,wuj,etal.parkinson'sdiseaseinchina[j].neurologicalsciencesofficialjournaloftheitalianneurologicalsociety&oftheitaliansocietyofclinicalneurophysiology,2011,32(1):23-30.；panf,dongh,dingh,etal.snprs356219oftheα-synuclein(snca)geneisassociatedwithparkinson'sdiseaseinachinesehanpopulation.[j].parkinsonism&relateddisorders,2012,18(5):632-634.)。國內(nèi)乃至亞洲地區(qū)的研究多以基因突變與pd的關聯(lián)性研究居多，綜合這些研究結(jié)果可見lrrk2在多個亞洲地區(qū)(包括中國、日本、韓國等)的散發(fā)性pd患者中最常見，受關注最多(sidhua,wersingerc,vernierp.α-synucleinregulationofthedopaminergictransporter:apossibleroleinthepathogenesisofparkinson'sdisease[j].febsletters,2004,565(1-3):1–5.；taysp,limggy.parkinandparkinson'sdisease[j].etiologyandpathophysiologyofparkinson'sdisease,2011,10:47-70.)。

同時，hamzath等研究還發(fā)現(xiàn)hla-dra與帕金森氏病相關(hamzath,zabetiancp,tenesaa,etal.commongeneticvariationinthehlaregionisassociatedwithlate-onsetsporadicparkinson'sdisease[j].naturegenetics,2010,42(9):781-5.)

因此，對snca、lrrk2、hla-dra三個與帕金森氏病相關基因的多態(tài)性位點進行檢測，能了解個體在帕金森氏病方面的遺傳因素，評估帕金森氏病發(fā)病的相對風險，對于帕金森氏病早期診斷、早期治療、早期干預具有積極的意義。同時還能輔助帕金森氏病的診斷，指導合理用藥，幫助預測后代患病風險等。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒及其應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒，所述試劑盒中包括dna提取試劑盒、dna擴增試劑盒和測序試劑盒；所述dna提取試劑盒采用天根生化科技有限公司的dp322型產(chǎn)品，所述dna擴增試劑盒主要包括擴增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、擴增引物，所述擴增引物為：1)f：5'-aggtaaccaccgtgtgggtttg-3'，r：5'-tgatcctgtcaggggtttgtttt-3',2)f：5'-actttccacactgctgcacagg-3'，r：5'-ttctcatccaagtgggatgtgttt-3',3)f：5'-cagatcctgggtaggcgttttg-3',r：5'-tatgctcaggcttgggcaattt-3'；所述酶采用寶生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述測序試劑盒采用美國abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述擴增引物為基于基因hla-dra、snca和lrrk2進行設計合成的。

一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒的應用，具體步驟為：

(1)首先，將采集回來的樣本按照dna提取試劑盒提取獲得樣本基因組dna；

(2)然后，將獲得樣本基因組dna使用dna擴增試劑盒進行擴增，得到擴增后的產(chǎn)物，隨后將擴增后的產(chǎn)物進行電泳檢測和純化，得到純化后的產(chǎn)物；

(3)接著，在純化后的產(chǎn)物中加入測序試劑盒進行桑格測序反應；

(4)最后，將上述步驟桑格測序反應結(jié)束后的產(chǎn)物進行乙醇/edta純化，純化后上樣到測序儀中，序列分析后進行分型判定。

作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(1)中樣本為口腔黏膜細胞。

作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(4)中乙醇/edta純化具體為從pcr儀上取下反應板，3800rpm離心1min；加2.5μl0.125medta，短離心；靜置5min；加20μl預冷無水乙醇，貼封口膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心30min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；加60μl75％的預冷乙醇，貼膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心15min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；pcr儀變性程序處理5min，或避光靜置30min，揮發(fā)乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，貼膜，短離心；95℃變性5min；迅速置于-20℃冰箱。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明制備出一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒，對snca、lrrk2、hla-dra三個與帕金森氏病相關基因的多態(tài)性位點進行檢測，能了解個體在帕金森氏病方面的遺傳因素，評估帕金森氏病發(fā)病的相對風險，對于帕金森氏病早期診斷、早期治療、早期干預具有積極的意義；同時還能輔助帕金森氏病的診斷，指導合理用藥，幫助預測后代患病風險等；本專利產(chǎn)品采用基因檢測領域的金標準——桑格測序法進行基因分型；桑格測序法是通過控制dna的合成來產(chǎn)生終止于靶序列特定位點的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同單鏈的dna模板退火，設立四種不同的測序反應，每一種反應中都含有dna聚合酶和四種正常的dntp；除此之外，還含有少量的有3'-h取代普通脫氧核糖3'-oh的2',3'-ddntp；若ddntp摻入到延伸中的dna鏈，由于缺少3'-oh將會阻斷后續(xù)dntp形成磷酸二酯鍵，dna的進一步延伸被終止；使用四種不同的ddntp，產(chǎn)生的寡核苷酸將終止于每一個a,c,g或t在模板鏈上占據(jù)的位置，將四種反應產(chǎn)生的寡核苷酸加到測序儀中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳動的速率就不同，測序儀的圖像控制器按照寡核苷酸經(jīng)過的時間順序，便可以檢測出新合成鏈5'到3'的序列信息。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的雜合型ag測序分型結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明的雜合型ct測序分型結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明的雜合型cg測序分型結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。

一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒，所述試劑盒中包括dna提取試劑盒、dna擴增試劑盒和測序試劑盒；所述dna提取試劑盒采用天根生化科技有限公司的dp322型產(chǎn)品，所述dna擴增試劑盒主要包括擴增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、擴增引物，所述擴增引物為：1)f：5'-aggtaaccaccgtgtgggtttg-3'(seqidno.1)，r：5'-tgatcctgtcaggggtttgtttt-3'(seqidno.2),2)f：5'-actttccacactgctgcacagg-3'(seqidno.3)，r：5'-ttctcatccaagtgggatgtgttt-3'(seqidno.4),3)f：5'-cagatcctgggtaggcgttttg-3'(seqidno.5),r：5'-tatgctcaggcttgggcaattt-3'(seqidno.6)；所述酶采用寶生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述測序試劑盒采用美國abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

所述擴增引物為基于基因hla-dra、snca和lrrk2進行設計合成的；其中，檢測的目標snp位點包括rs3129882、rs356220和rs1491942，這3個位點分別位于基因hla-dra、snca和lrrk2。

一種帕金森綜合征易感基因檢測分型試劑盒的應用，具體步驟為：

(1)首先，將采集回來的樣本按照dna提取試劑盒提取獲得樣本基因組dna；

(2)然后，將獲得樣本基因組dna使用dna擴增試劑盒進行擴增，得到擴增后的產(chǎn)物，隨后將擴增后的產(chǎn)物進行電泳檢測和純化，得到純化后的產(chǎn)物；

(3)接著，在純化后的產(chǎn)物中加入測序試劑盒進行桑格測序反應；

(4)最后，將上述步驟桑格測序反應結(jié)束后的產(chǎn)物進行乙醇/edta純化，純化后上樣到測序儀中，序列分析后進行分型判定。

其中：

步驟(1)中樣本為口腔黏膜細胞。

步驟(2)中使用dna擴增試劑盒進行擴增，擴增的反應體系為：

takarataqtm(5u/μl)1u

10×pcrbuffer(mg2+)5μl

dntpmixture(2.5mmeach)4μl

正向引物(10pmol/μl)0.5μl

反向引物(10pmol/μl)0.5μl

模板1μl

雙蒸水upto50μl，

擴增程序為：

stage1:predegeneration

repeat:1time

95℃3minutes

stage2:pcrreaction

repeat:30cycles

95℃5second

55℃30second

72℃1minutes

stage3:finalextension

72℃5minutes。

步驟(2)中電泳檢測和純化，其中電泳檢測具體步驟為：制備1％的瓊脂糖凝膠：稱一定量的瓊脂糖粉加入對應體積的10×tae加熱熔解瓊脂糖，待其完全熔解后加入10000×goldviewⅰ。待膠凝固后，取5μl的pcr產(chǎn)物加入loadingbuffer混合后，點到膠孔內(nèi)，120v定壓，跑15min左右。在tgreentransilluminator內(nèi)觀察擴增產(chǎn)物的片段大小、單一性及擴增濃度；

其中純化體系為：

pcr擴增后的反應液5μl

sap/cip(1u/μl)1μl

exoⅰ(5u/μl)1μl

ddh2o3μl，

其中純化反應程序為：

37℃30minutes

75℃15minutes。

步驟(3)中的桑格測序反應，反應體系為：

bigdye混合液1μl

測序引物(3.2pmol/μl)1μl

模板(純化產(chǎn)物)1μl

ddh2o2μl，

反應程序為：

stage1:1time

95℃2minutes

stage2:25cycles

95℃10second

50℃5second

60℃4minutes。

步驟(4)中乙醇/edta純化具體為從pcr儀上取下反應板，3800rpm離心1min；加2.5μl0.125medta，短離心；靜置5min；加20μl預冷無水乙醇，貼封口膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心30min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；加60μl75％的預冷乙醇，貼膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心15min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；pcr儀變性程序處理5min，或避光靜置30min，揮發(fā)乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，貼膜，短離心；95℃變性5min；迅速置于-20℃冰箱。

結(jié)果檢測判定：

分型判定標準如下，見表1。

表1

其中rs3129882的雜合型ag、rs356220的雜合型ct和rs1491942的雜合型cg，測序分型結(jié)果圖，見圖1-3.

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。