本發(fā)明涉及一種檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人類基因組計劃(humangenomeproject，hgp)的完成，大量疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)模式向可預(yù)測性、可預(yù)防性、個體化和參與性的基因組醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)變，為未來發(fā)展預(yù)防、診斷、治療長期困擾人類的諸如癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)和精神疾病等重大復(fù)雜性疾病開辟了新途徑，也為基因科學(xué)的產(chǎn)業(yè)化提供了良好的機(jī)遇。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genomewideassociationstudies，gwas)是應(yīng)用人類基因組中數(shù)以百萬計的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)為標(biāo)記進(jìn)行病例一對照關(guān)聯(lián)分析，即在一定人群中收集病例組和對照組dna，進(jìn)行snps芯片掃描，采用關(guān)聯(lián)分析比較受檢snps標(biāo)記的某一等位基因頻率在病例組和對照組間有無顯著性差異，篩選與疾病關(guān)聯(lián)的基因序列變異，做出該snps是否與疾病關(guān)聯(lián)的判斷，預(yù)測疾病的患病率及風(fēng)險。該方法研究前不需構(gòu)建任何假設(shè)，不再局限于候選基因或候選染色體區(qū)域作為關(guān)聯(lián)分析對象，而是針對基因組中所有snps，隨機(jī)進(jìn)行基因分型，分析snps與疾病的關(guān)聯(lián)度，可在全基因組水平上，開展多中心、大樣本、反復(fù)驗證的基因與疾病的關(guān)聯(lián)研究，全面及時疾病發(fā)生、發(fā)展和治療的相關(guān)遺傳基因。

目前發(fā)現(xiàn)遺傳因素，或其與環(huán)境因素之間的相互作用參與了幾乎所有的人類疾病的發(fā)生過程。一些復(fù)雜的疾病往往不是由單一基因突變引起的，其發(fā)生發(fā)展與多基因多位點(diǎn)變異有關(guān)，且這些位點(diǎn)的變異可能與環(huán)境因素相關(guān)，這些位點(diǎn)可提高或降低個體患某種疾病的相對風(fēng)險，被稱為該種疾病的易感位點(diǎn)。根據(jù)大量的gwas結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證明的一系列復(fù)雜疾病的易感位點(diǎn)已被普遍應(yīng)用于基因檢測領(lǐng)域。

阿爾茨海默癥(alzheimer'sdisease,ad)隱匿起病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力減退為主要表現(xiàn)的年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年期癡呆中最常見的類型。男女兩性均對此病易感，以女性稍甚。該病患病率在老年人群中呈指數(shù)上升，65歲時患病率約1％，至95歲時達(dá)到40％-50％，目前已成為不斷增長的威脅公眾健康的流行疾患。晚發(fā)型ad(late-onsetalzheimer'sdisease,load)是指發(fā)病年齡大于65歲的患者，多無家族史。盡管ad的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明了，但遺傳因素在ad發(fā)病中的作用越來越受到人們的關(guān)注。發(fā)生在三個基因(app,psen1,psen2)中的突變可導(dǎo)致該病，而apoe4等位基因與患病的危險增加有關(guān)。隨著人類基因組研究的進(jìn)展，可能會有更多與該病相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)。目前，應(yīng)用遺傳篩選測試，可以幫助阿爾茨海默氏病的高危人群更好地準(zhǔn)備和應(yīng)對未來可能發(fā)生的疾病。

cntnap2(contactin-associatedprotein-like2，接觸蛋白相關(guān)蛋白樣蛋白2)，位于7號染色體上，屬于軸突蛋白家族成員，該基因編碼的膜蛋白主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在有髓鞘的神經(jīng)纖維細(xì)胞的跳躍式神經(jīng)沖動傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。logue等人的研究結(jié)果顯示，cntnap2的基因多態(tài)性是ad的重要遺傳風(fēng)險因素，其中rs10273775的等位基因與load發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)(loguemarkwetal.,acomprehensivegeneticassociationstudyofalzheimerdiseaseinafricanamericans.,archneurol68(12):1569-79)。

cr1(complementreceptor1，補(bǔ)體受體1)，又名c3b/c4b受體orcd35，屬于補(bǔ)體激活的調(diào)控蛋白家族成員，定位于1號染色體“rca簇”區(qū)域。cr1分布廣泛，能作為i因子介導(dǎo)c3b裂解的輔助因子，加速c3轉(zhuǎn)化酶衰變，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對c3b/c4b所包被顆粒及免疫復(fù)合物的吞噬、激活和殺菌代謝。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠過度表達(dá)c3能減少aβ的沉積和病理作用。相反，抑制c3轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)則加速aβ的沉積和神經(jīng)退行性改變。aβ通過c3b介導(dǎo)與紅細(xì)胞表面的cr1相結(jié)合，并最終被紅細(xì)胞清除出循環(huán)系統(tǒng)。lambert等人的研究結(jié)果顯示，cr1的基因多態(tài)性是高加索人患ad的重要遺傳風(fēng)險因素，rs6656401和rs3818361的等位基因是遲發(fā)型ad發(fā)病的危險因素。另外一項基因組研究顯示，rs3818361也是歐洲和美洲人群發(fā)生ad的危險因素(haroldd,abrahamr,hollingworthpj.genome-wideassociatiedstudyidentifiesvariantsatcluandpicalmassociatedwithalzheimer'sdisease.natgenet,2009,41:1088-1093)。

lrat(lecithinretinolacyltransferase，卵磷脂-視黃醇?；D(zhuǎn)移酶)，定位于色素上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其n端位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)，c端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔側(cè)，其功能是催化全反式視黃醛與磷脂膽堿進(jìn)行酯化反應(yīng)生成全反式視黃酯，因此對體內(nèi)的維生素a代謝途徑起重要作用。abrahamr等人的研究發(fā)現(xiàn)，位于lrat轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游13kb處的rs727153位點(diǎn)load有著顯著的相關(guān)性，并通過更多覆蓋lrat的snp位點(diǎn)，進(jìn)一步確定了lrat為load的新的候選易感基因(abrahamr,moskvinav,simsretal.agenome-wideassociationstudyforlate-onsetalzheimer'sdiseaseusingdnapooling.bmcmedgenomics,2008sep29；1:44)。

因此，對cntnap2、cr1和lrat與阿爾茨海默氏病相關(guān)基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，能了解個體在阿爾茨海默氏病方面的遺傳因素，評估阿爾茨海默氏病發(fā)病的相對風(fēng)險，對于阿爾茨海默氏病早期診斷、早期治療、早期干預(yù)具有積極的意義。同時還能輔助阿爾茨海默氏病的診斷，指導(dǎo)合理用藥，幫助預(yù)測后代患病風(fēng)險等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒及其應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒，所述試劑盒中包括dna提取試劑盒、dna擴(kuò)增試劑盒和測序試劑盒；所述dna提取試劑盒采用天根生化科技有限公司的dp322型產(chǎn)品，所述dna擴(kuò)增試劑盒主要包括擴(kuò)增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物為：1)f：5'-ccagagacaaccagtgctca-3'，r：5'-aaatccaccctgctgtatgc-3',2)f：5'-ggcttagggtatgctcacca-3'，r：5'-tgagggactgcctctgtagg-3',3)f：5'-agatgaaaaggggccagatt-3',r：5'-tatccctgggcagttttgtc-3'；所述酶采用寶生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述測序試劑盒采用美國abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述擴(kuò)增引物為基于基因cntnap2、cr1和lrat進(jìn)行設(shè)計合成的。

一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒的應(yīng)用，具體步驟為：

(1)首先，將采集回來的樣本按照dna提取試劑盒提取獲得樣本基因組dna；

(2)然后，將獲得樣本基因組dna使用dna擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的產(chǎn)物，隨后將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測和純化，得到純化后的產(chǎn)物；

(3)接著，在純化后的產(chǎn)物中加入測序試劑盒進(jìn)行桑格測序反應(yīng)；

(4)最后，將上述步驟桑格測序反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物進(jìn)行乙醇/edta純化，純化后上樣到測序儀中，序列分析后進(jìn)行分型判定。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟(1)中樣本為口腔黏膜細(xì)胞。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟(4)中乙醇/edta純化具體為從pcr儀上取下反應(yīng)板，3800rpm離心1min；加2.5μl0.125medta，短離心；靜置5min；加20μl預(yù)冷無水乙醇，貼封口膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心30min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；加60μl75％的預(yù)冷乙醇，貼膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心15min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；pcr儀變性程序處理5min，或避光靜置30min，揮發(fā)乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，貼膜，短離心；95℃變性5min；迅速置于-20℃冰箱。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明制備出一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒，對cntnap2、cr1和lrat與阿爾茨海默氏病相關(guān)基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，能了解個體在阿爾茨海默氏病方面的遺傳因素，評估阿爾茨海默氏病發(fā)病的相對風(fēng)險，對于阿爾茨海默氏病早期診斷、早期治療、早期干預(yù)具有積極的意義；同時還能輔助阿爾茨海默氏病的診斷，指導(dǎo)合理用藥，幫助預(yù)測后代患病風(fēng)險等；本專利產(chǎn)品采用基因檢測領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)——桑格測序法進(jìn)行基因分型；桑格測序法是通過控制dna的合成來產(chǎn)生終止于靶序列特定位點(diǎn)的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同單鏈的dna模板退火，設(shè)立四種不同的測序反應(yīng)，每一種反應(yīng)中都含有dna聚合酶和四種正常的dntp；除此之外，還含有少量的有3'-h取代普通脫氧核糖3'-oh的2',3'-ddntp；若ddntp摻入到延伸中的dna鏈，由于缺少3'-oh將會阻斷后續(xù)dntp形成磷酸二酯鍵，dna的進(jìn)一步延伸被終止；使用四種不同的ddntp，產(chǎn)生的寡核苷酸將終止于每一個a,c,g或t在模板鏈上占據(jù)的位置，將四種反應(yīng)產(chǎn)生的寡核苷酸加到測序儀中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳動的速率就不同，測序儀的圖像控制器按照寡核苷酸經(jīng)過的時間順序，便可以檢測出新合成鏈5'到3'的序列信息。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的雜合型ag測序分型結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明的正常純合型ct測序分型結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明的雜合型ag測序分型結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒，所述試劑盒中包括dna提取試劑盒、dna擴(kuò)增試劑盒和測序試劑盒；所述dna提取試劑盒采用天根生化科技有限公司的dp322型產(chǎn)品，所述dna擴(kuò)增試劑盒主要包括擴(kuò)增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物為：1)f：5'-ccagagacaaccagtgctca-3'(seqidno.1)，r：5'-aaatccaccctgctgtatgc-3'(seqidno.2),2)f：5'-ggcttagggtatgctcacca-3'(seqidno.3)，r：5'-tgagggactgcctctgtagg-3'(seqidno.4),3)f：5'-agatgaaaaggggccagatt-3'(seqidno.5),r：5'-tatccctgggcagttttgtc-3'(seqidno.6)；所述酶采用寶生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述測序試劑盒采用美國abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

所述擴(kuò)增引物為基于基因cntnap2、cr1和lrat進(jìn)行設(shè)計合成的；其中，檢測的目標(biāo)snp位點(diǎn)包括rs10273775、rs3818361和rs727153，這3個位點(diǎn)分別位于基因cntnap2、cr1和lrat。

一種阿爾茨海默氏病易感基因檢測分型試劑盒的應(yīng)用，具體步驟為：

(1)首先，將采集回來的樣本按照dna提取試劑盒提取獲得樣本基因組dna；

(2)然后，將獲得樣本基因組dna使用dna擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增后的產(chǎn)物，隨后將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測和純化，得到純化后的產(chǎn)物；

(3)接著，在純化后的產(chǎn)物中加入測序試劑盒進(jìn)行桑格測序反應(yīng)；

(4)最后，將上述步驟桑格測序反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物進(jìn)行乙醇/edta純化，純化后上樣到測序儀中，序列分析后進(jìn)行分型判定。

其中：

步驟(1)中樣本為口腔黏膜細(xì)胞。

步驟(2)中使用dna擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

takarataqtm(5u/μl)1u

10×pcrbuffer(mg2+)5μl

dntpmixture(2.5mmeach)4μl

正向引物(10pmol/μl)0.5μl

反向引物(10pmol/μl)0.5μl

模板1μl

雙蒸水upto50μl，

擴(kuò)增程序為：

stage1:predegeneration

repeat:1time

95℃3minutes

stage2:pcrreaction

repeat:30cycles

95℃5second

55℃30second

72℃1minutes

stage3:finalextension

72℃5minutes。

步驟(2)中電泳檢測和純化，其中電泳檢測具體步驟為：制備1％的瓊脂糖凝膠：稱一定量的瓊脂糖粉加入對應(yīng)體積的10×tae加熱熔解瓊脂糖，待其完全熔解后加入10000×goldviewⅰ。待膠凝固后，取5μl的pcr產(chǎn)物加入loadingbuffer混合后，點(diǎn)到膠孔內(nèi)，120v定壓，跑15min左右。在tgreentransilluminator內(nèi)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小、單一性及擴(kuò)增濃度；

其中純化體系為：

pcr擴(kuò)增后的反應(yīng)液5μl

sap/cip(1u/μl)1μl

exoⅰ(5u/μl)1μl

ddh2o3μl，

其中純化反應(yīng)程序為：

37℃30minutes

75℃15minutes。

步驟(3)中的桑格測序反應(yīng)，反應(yīng)體系為：

bigdye混合液1μl

測序引物(3.2pmol/μl)1μl

模板(純化產(chǎn)物)1μl

ddh2o2μl，

反應(yīng)程序為：

stage1:1time

95℃2minutes

stage2:25cycles

95℃10second

50℃5second

60℃4minutes。

步驟(4)中乙醇/edta純化具體為從pcr儀上取下反應(yīng)板，3800rpm離心1min；加2.5μl0.125medta，短離心；靜置5min；加20μl預(yù)冷無水乙醇，貼封口膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心30min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；加60μl75％的預(yù)冷乙醇，貼膜，振蕩混勻；3800rpm，4℃離心15min；離心結(jié)束后立即，倒置pcr板低速離心片刻，轉(zhuǎn)速不超過800rpm；pcr儀變性程序處理5min，或避光靜置30min，揮發(fā)乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，貼膜，短離心；95℃變性5min；迅速置于-20℃冰箱。

結(jié)果檢測判定：

分型判定標(biāo)準(zhǔn)如下，見表1。

表1

其中rs10273775的雜合型ag、rs3818361的正常純型ct和rs727153的雜合型ag，測序分型結(jié)果圖，見圖1-3.

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。