本發(fā)明涉及一種活性人參皂苷的制取方法。本發(fā)明旨在批量制取活性人參?；钚匀藚⒃谌梭w內具有較高的吸收能力。本發(fā)明也與食品生產(chǎn)的方法相關。
背景技術：
本發(fā)明中人參系指高麗參、野生人參、栽培野生人參、中國人參(三七人參)、西洋參、生曬參中的一種、兩種或兩種以上的人參組合。
人參皂苷和非皂苷物質包括人參萜、多糖、氨基酸衍生物和酚類化合物。該物質具有很好的藥理活性。對清除自由基、抗腫瘤、血壓調節(jié)、降脂及抗肝損害等方面有重要作用。
人參皂苷分為兩類：ppd(原人參二醇)和ppt(原人參三醇)。ppd型皂苷在基本結構ppd上有多種不同取代基團，典型的有rb1、rb2、rc、rd、f2、rg3和人參皂苷化合物k等。ppt型皂苷以ppt為基本結構，包含re、rf、rg1和rh1。
一般來說，自然界中許多含糖類化合物，糖酵解后的產(chǎn)物(糖苷配基)表現(xiàn)出增強的生物活性(med.pharm.soc.1992，9：1-13)。如果人參皂苷含糖類側鏈(人參皂苷rb1、rb2、rb和re)發(fā)生水解并形成人參皂苷rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck，它們在體內會產(chǎn)生更佳效應(ginsengres.2003，27：129-134)。
人參皂苷被稱為非活性型皂苷，是一種糖類復合物，只有極少量的非活性型皂苷在小腸被吸收并進入體內。人類糞便中提取到的腸道微生物當中，關于其人參皂苷rb1的水解能力的實驗結果表明，21％的腸道微生物不具水解能力。并且現(xiàn)已證實，70％具有一定程度的水解作用的腸道微生物，在分解人參皂苷的能力上有很大的差異(plantamedica.1998，64：696-700)。
一般的人參產(chǎn)品由高水溶性(非活性皂苷組分)的人參皂苷組成，然而這種高水溶性和低腸道吸收性的成分對人體無益。但是，如果活性組分變?yōu)椴蝗苡谒湮漳芰陀行砸驳靡栽鰪姟?/p>
本發(fā)明的皂苷或人參加工產(chǎn)品的性質主要有：
通過使糖類從皂苷中移除，本發(fā)明中的活性組分提高了在人體的口服吸收(與天然人參相比)。人參皂苷rb1、rb2、rd和re與三個或三個以上的單糖耦合。本發(fā)明通過糖類的水解作用，生成人參皂苷rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck。rg3、rh1、rh2、f2、cy和ck是典型的具有更高級效應的皂苷，即在人體內有更好的吸收能力或生理活性的活性人參皂苷。
紅參是活化人參的典型代表，在現(xiàn)代意義上是指在90℃條件下加工六小時的人參。某些活性組分(尤其是化合物ck)是由某些腸道細菌產(chǎn)生(化合物ck在自然界中是不存在的)。而化合物ck難以合成。然而，利用菌株發(fā)酵生產(chǎn)化合物ck的方法仍然不夠成熟。一般來說，與酶法轉換相比，菌株發(fā)酵的生產(chǎn)量很低。但是，發(fā)酵生產(chǎn)比酶法轉換更有可能生產(chǎn)出各種活性皂苷。
乳酸菌在37℃左右條件下難以發(fā)酵，其發(fā)酵溫度應不低于42℃。高溫改變了菌株產(chǎn)酶的三級結構，因此該酶無法發(fā)揮作用。當溫度升高10℃時，酶的能力也隨之提高兩倍。但高溫也不利于菌株生存。因此本發(fā)明者采用的是耐高溫、可以產(chǎn)生多種酶的菌株。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種具有更好效果的活性人參皂苷的制取方法，該皂苷在活體內有更好的吸收能力或生理活性。
本發(fā)明采用的發(fā)酵溫度高于42℃。該溫度不利于一般細菌的生長。本發(fā)明從人參皂苷中分離出附加的糖，然后利用發(fā)酵方法獲得化合物ck、rd、rg3等形式的活性組分。
本發(fā)明實現(xiàn)上述目標的技術方案包括如下步驟：
1)用蒸汽熱處理人參；
2)破碎，利用乙醇萃取人參，得到人參皂苷提取液；
3)將莫哈韋芽孢桿菌kjs-3(moja-3)培養(yǎng)液和聚酵素芽孢桿菌kjs-2(bp-2)培養(yǎng)液添加至人參皂苷提取液中發(fā)酵；
4)離心發(fā)酵后的人參皂苷溶液，分離并保留上清液；回收沉淀物，使用乙醇復溶，過濾，收集濾液；
5)將濾液濃縮后，冷凍干燥，得到活性人參皂苷；上清液繼續(xù)培養(yǎng)后，濃縮，冷凍干燥，也得到活性人參皂苷。
上述方案中，步驟3)的發(fā)酵溫度在42℃-50℃范圍內；作為一種優(yōu)選，發(fā)酵溫度為45℃。
步驟5)中，上層清液發(fā)酵溫度在45～60℃。作為一種優(yōu)選，發(fā)酵溫度為55℃。
步驟1)中，人參加工溫度為110℃，蒸汽壓強為1.1kg/cm2，持續(xù)時間為10分鐘。重復三次。
步驟2)中，將熱處理后的人參切碎放至高速攪拌器攪拌，然后靜置于80vol％酒精中，萃取皂苷組分。
本發(fā)明具有以下效果。
通過熱處理制備活性皂苷成分。提取皂苷后，在發(fā)酵過程中，使用兩種菌株，依次利用兩種溫度處理，可制備得到高產(chǎn)量的含化合物ck的活性皂苷。由于活性物質是由發(fā)酵產(chǎn)生的，可在食物中使用。
具體實施方式
申請人將具體描述本發(fā)明問題的解決方法。本發(fā)明將不詳細描述與已知技術相關的詳細信息，以免混淆本發(fā)明主題。
一般來說，在保證酶的二級結構不被破壞的條件下，菌株在增加10℃時的酶產(chǎn)量是原先的兩倍。
本發(fā)明涉及的菌株被發(fā)現(xiàn)在高于普通菌的最適生長溫度下生長得很好。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，莫哈韋芽孢桿菌kjs-3(moja-3，2008年8月22日保藏于韓國微生物保藏中心，保藏編號為kccm10961p。該菌的生長條件為：20～50℃，ph＝6～7.5)。在42-45℃溫度范圍內展現(xiàn)出最大生長量。我們還選擇了生長溫度可能達到60℃的bp-2(2006.08.16保藏于韓國微生物保藏中心，保藏編號為kccm10769p)。bp-2的最宜生長溫度為45℃至55℃，發(fā)酵最高溫度為55℃。在該溫度條件下，大部分細菌無法生長，從而阻止由雜菌污染造成的中途抑制。
本發(fā)明將在下文中根據(jù)實施例進行詳細描述。
本發(fā)明的熱處理過程中，具體來說，人參加工溫度為110℃，蒸汽壓強為1.1kg/cm2，持續(xù)時間為10分鐘。重復三次。
然后切碎放至高速攪拌器，然后靜置于80vol％酒精中，萃取皂苷組分。原人參二醇(ppd)比原人參三醇((ppt)更容易在80％的乙醇溶液中提取得到。集中皂苷提取液后，將其復溶于水中。這將作為活性ppd的原料使用。
使用軟管泵將一定量的moja-3、bp-2菌株的發(fā)酵溶液注入到ppd的懸浮液中。該發(fā)酵液用于分解皂苷的糖類側鏈，然后生成含化合物ck的活化ppd溶液。
如果不是逐滴添加少量原料，會使得反應不能很好發(fā)生，致使產(chǎn)量較低。因此，本發(fā)明是將預定量的反應原料通過軟管泵注入到moja3、bp2菌株的發(fā)酵液，發(fā)酵后，制備含活性組分的ppd溶液，內含化合物ck(即cks溶液)。
cks溶液離心完成后，在乙醇中再次靜置沉淀物，過濾，濾液集中回收cks溶液。
實施例1活性ppd的制取
將人參裝入反應室內的多孔架子。通過自動溫度及濕度控制裝置，向反應室通入蒸汽，排除空氣，直接由蒸汽進行熱處理，蒸汽壓力1.1kg/cm2。保持溫度121℃，時間10分鐘，去除人參多余的水分。
將熱處理過的人參冷卻至90℃以下，打開排氣閥注入空氣，繼續(xù)重復以上操作兩次。
將熱處理過的人參磨碎成粒徑不超過1毫米的顆粒，干燥后加入80vol％乙醇，加熱充分提取人參皂苷。通過濾紙過濾掉500微米以上的固體顆粒，收集經(jīng)過濾紙的乙醇溶液，稱之為熱處理皂苷乙醇溶液。
使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮熱處理皂苷乙醇溶液。用少量乙醇溶解熱處理過的濃縮皂苷，再加入滅菌蒸餾水制備懸浮液用于保存。濃縮過程可以防止有害細菌滋生，是因為造成污染的雜菌在50℃以上不易存活。
實施例2moja-3菌株發(fā)酵(45℃)生成活性皂苷
取實施例1中制備的含rg3等活性ppd的人參皂苷，干燥后，取24克，用于以下實驗。
首先，用胰蛋白大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)mojia-3菌株，溫度45℃，時間不低于16小時。取100毫升培養(yǎng)液加至1000毫升新鮮tbs中傳代培養(yǎng)，45℃條件下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd懸浮溶液，軟管泵速率為20毫升/分鐘。在45℃條件下再次培養(yǎng)6小時，得到cks溶液。
cks溶液離心得到上清液，稱為溶液a。離心后的沉淀物集中，再次溶于少量乙醇中。過濾，取濾液，濃縮得到濃度較高的cks溶液。冷凍干燥cks溶液，得到0.054克cks(初級反應cks)。
45℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)溶液a，時間為6小時。與初級cks制取方法相同，濃縮、冷凍干燥得到0.18克cks(次級反應cks)。初級和次級反應cks總量為0.234g。
實施例3bp-2發(fā)酵(55℃)生成活性皂苷
取實施例1中制備的含rg3等活性ppd的人參皂苷，干燥后，取24克，用于以下實驗。
首先，用胰蛋白大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)bp-2菌株，溫度45℃，時間不低于16小時。取100毫升培養(yǎng)液加至1000毫升新鮮tbs中傳代培養(yǎng)，55℃條件下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd懸浮溶液，軟管泵速率為20毫升/分鐘。在55℃條件下再次培養(yǎng)6小時，得到cks溶液。
cks溶液離心得到上清液，稱為溶液b。用少量乙醇溶解沉淀物，過濾，取濾液，濃縮得到濃度較高的cks溶液。冷凍干燥cks溶液，得到0.0645gcks(cks初級反應)。
55℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)溶液b，時間為6小時。與初級cks制取方法相同，濃縮、冷凍干燥得到0.139克cks(次級反應cks)。主級和次級反應cks總量為0.2035克。
實施例4moja-3(45℃)和bp-2(55℃)發(fā)酵生成活性皂苷化合物
取實施例1中制備的含rg3等活性ppd的人參皂苷，干燥后，取24克，用于以下實驗。
首先，用胰蛋白大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)bp-2菌株和moja-3菌株溫度45℃，時間不低于16小時。取100毫升培養(yǎng)液加至1000毫升新鮮tbs中傳代培養(yǎng)，45℃條件下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)完成后，加入100毫升10％(w/v)活性ppd懸浮溶液，軟管泵速率為20毫升/分鐘。在45℃條件下再次培養(yǎng)6小時，得到cks溶液。
cks溶液離心得到上清液，稱為溶液c。用少量乙醇溶解沉淀物。過濾，取濾液，濃縮得到濃度較高的cks溶液。冷凍干燥cks溶液，得到1.04克cks(cks初級反應)。
55℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)溶液c，時間為6小時。與初級cks制取方法相同，濃縮、冷凍干燥得到0.2747克cks(次級反應cks)。初級和次級反應cks總量為1.3147g。
現(xiàn)已證實，在高溫條件下利用兩種菌株共同作用，有可能產(chǎn)生大量活性皂苷。
實施例5moja-3(45℃)和bp-2(55℃)發(fā)酵生成活性皂苷化合物
取實施例1中制備的含rg3等活性ppd的人參皂苷，干燥后，取24克，用于以下實驗。
首先，用胰蛋白大豆肉湯(tsb)培養(yǎng)bp-2菌株和moja-3菌株溫度45℃，時間不低于16小時。取100毫升培養(yǎng)液加至1000毫升新鮮tbs中傳代培養(yǎng)，55℃條件下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)完成后，加入100毫升10w/v％活性ppd懸浮溶液，軟管泵速率為20毫升/分鐘。在45℃條件下再次培養(yǎng)12小時，得到cks溶液。cks溶液離心得到上清液，稱為溶液d。用少量乙醇溶解沉淀物。過濾，取濾液，濃縮得到濃度較高的cks溶液。冷凍干燥cks溶液，得到1.02克cks(cks初級反應)。
55℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)溶液d，時間為12小時。與初級cks制取方法相同，濃縮、冷凍干燥得到0.210克cks(次級反應cks)。初級和次級反應cks總量為1.23克。
現(xiàn)已證實，在高溫條件下利用兩種菌株共同作用，有可能產(chǎn)生大量活性皂苷。發(fā)酵時間超過6小時后，不再產(chǎn)生cks。
實施例6皂苷測定條件
使用kinetexc18進行色譜分離，溫度35℃，檢測波長為203納米。水(dw)和乙腈(acn)作為流動相，梯度洗脫包括以下步驟，百分比為體積比。運行前使色譜柱重新緩沖平衡20分鐘。進樣體積為20微升。分析條件詳情見下表1，流動相中百分比為體積比。
表1，色譜分析條件
生產(chǎn)皂素的結果闡釋：
對實施例1至實施例4的具有代表性的cks皂苷進行分析。采用高效液相色譜電霧式檢測器法(hplc-cad)進行皂苷分析。分析典型皂苷中的化合物ck、rg3、rd、rb1和rf成分。由于每個實施例都取24克生曬參進行發(fā)酵，結果有比較意義。每種皂苷含量以絕對數(shù)形式表示，結果如表2所示，moja-3和bp2發(fā)酵的cks產(chǎn)量分別為234毫克和203毫克。但是，混合菌株(moja3和bp2)發(fā)酵的cks產(chǎn)量達到1315毫克。實現(xiàn)了批量生產(chǎn)cks的目標。rg3是紅參的重要指標。moja3生成了8.39毫克rg3，bp2生成了12.48毫克rg3。但是混合菌株(moja3和bp-2)發(fā)酵生產(chǎn)的rg3高于單菌株發(fā)酵。其產(chǎn)量是原先的兩倍(32.64毫克)。自然界中不存在的化合物ck，它僅由腸道細菌或酶生成。moja3和bp2發(fā)酵的化合物k產(chǎn)量分別為0.04毫克和0.14毫克。而混合菌株(moja-3和bp-2)發(fā)酵生產(chǎn)的化合物ck高于單菌株發(fā)酵(0.26毫克)。
表2色譜分析結果