本發(fā)明涉及一種提高膽固醇氧化酶對(duì)底物谷甾醇的特異性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase；EC1.1.3.6；COD)屬于黃素氧化酶類(lèi)，能特異性氧化含C3-OH的類(lèi)固醇底物，為催化膽固醇降解的第一步作用酶，氧化膽固醇C3-OH，隨后異構(gòu)化類(lèi)固醇環(huán)上Δ5-6雙鍵，其中以氧氣為電子受體生成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2。
膽固醇氧化酶具有重要醫(yī)學(xué)檢測(cè)價(jià)值，可用于定量血樣膽固醇的含量，如動(dòng)脈粥樣硬化性疾病需評(píng)估高密度脂蛋白或低密度脂蛋白的含量，以及評(píng)估血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)等，而將膽固醇氧化酶固定在膜上采用電化學(xué)生物傳感器測(cè)定膽固醇的含量是最近研究的熱潮；膽固醇氧化酶具有廣泛的底物特異性，可以轉(zhuǎn)化大量的3β-羥甾類(lèi)化合物，同時(shí)伴隨有異構(gòu)化作用，為工業(yè)類(lèi)固醇藥物甾體激素或甾體類(lèi)藥物的合成生產(chǎn)提供有用的中間體。例如R.equi DSM89-133被用來(lái)轉(zhuǎn)化膽固醇和其他的甾醇生產(chǎn)雄甾-4-烯-3,17-二酮和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。膽固醇氧化酶在生物催化方面的應(yīng)用前景廣闊，要求膽固醇氧化酶具有不同的底物特異性。
膽固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，膽甾烷醇是四種膽固醇氧化酶常見(jiàn)的底物，它們有相同的環(huán)結(jié)構(gòu)，差異在于R側(cè)鏈不同。在生物催化生產(chǎn)類(lèi)固醇藥物前體物質(zhì)需要膽固醇作用于不同側(cè)鏈的類(lèi)固醇。
為了提高膽固醇氧化酶的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)酶分子改造主要是改變底物特異性。Nishiya采用隨機(jī)突變的方式找到V145E/G405S突變株能提高Km值并適于臨床檢測(cè)膽固醇含量；也有報(bào)道對(duì)StreptomycesSA-COO源CODs進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)突變酶對(duì)脫氧異雄酮的催化效率提高了，對(duì)囊泡膽固醇的催化效率降低了，這可能是因?yàn)橥蛔儞p壞酶的疏水通道，破壞對(duì)疏水活性中心的保護(hù)。
目前，還鮮有關(guān)于提高膽固醇氧化酶對(duì)谷甾醇的特異性的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種對(duì)谷甾醇底物特異性提高的膽固醇氧化酶突變體。
所述突變體的氨基酸序列是在NCBI上GenBank：ABC75776.1的膽固醇氧化酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上，缺失了第34位的氨基酸且第127位的氨基酸突變成為蘇氨酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體，是在Rhodococcus sp.源(以前被分類(lèi)命名為Brevibacterium sp.DGCDC-82)的膽固醇氧化酶基礎(chǔ)上突變得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Rhodococcus sp.源的CODr的核苷酸序列，如Genebank：DQ345780.1。
所述突變體對(duì)谷甾醇的底物特異性提高了6.2倍。
本發(fā)明還要求保護(hù)表達(dá)所述突變體的載體、工程菌，以及所述突變體在食品、環(huán)境、制備藥物等方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種提高Rhodococcus sp.源的膽固醇氧化酶底物特異性的方法，所述方法是將Rhodococcus sp.源的膽固醇氧化酶的第34位的氨基酸進(jìn)行缺失突變且將第127位的氨基酸G(甘氨酸)突變成蘇氨酸T。
本發(fā)明的有益效果：
原始的Rhodococcus sp.源的膽固醇氧化酶對(duì)膽固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，膽甾烷醇這4種底物的活性差不多，而本發(fā)明的突變體的底物特異性有顯著變化，對(duì)谷甾醇的活性最高，是對(duì)膽固醇的活性的6.2倍。通過(guò)本發(fā)明的方法，有效提高了膽固醇氧化酶對(duì)底物谷甾醇的特異性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：突變株的構(gòu)建
(1)化學(xué)合成CODr基因片段，序列如GenBank登錄號(hào)為DQ345780.1(Rhodococcus sp.來(lái)源的膽固醇氧化酶)所示，將該基因片段連接到pET28a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli。提取重組E.coli，質(zhì)粒，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒pET28a(+)-CODr。
(2)以pET28a(+)-CODr為模板，根據(jù)要缺失的第34位氨基酸和要突變的第127位氨基酸的前后序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物上相應(yīng)的位點(diǎn)核苷酸缺失或者為突變后的核苷酸。利用HS PCR酶(購(gòu)于TaKaRa公司)采用全質(zhì)粒PCR的方法進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物線性化處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。得到相對(duì)于GenBank：ABC75776.1的膽固醇氧化酶缺失了第34位的氨基酸且第127位的氨基酸突變成為蘇氨酸的突變質(zhì)粒pET28a(+)-CODrM。
(3)將pET28a(+)-CODrM轉(zhuǎn)化得到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子，驗(yàn)證正確的即為突變體菌株E.coli-CODrM，突變體菌株所產(chǎn)膽固醇氧化酶即為CODrM。
實(shí)施例2：突變株發(fā)酵產(chǎn)酶與酶純化
(1)粗酶液的制備
種子液的培養(yǎng)條件：采用250mL搖瓶培養(yǎng)，裝液為20％的LB培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的100mg·mL-1硫酸卡那霉素50μL，取單菌落至培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過(guò)夜培養(yǎng)。
發(fā)酵液培養(yǎng)條件：采用500mL搖瓶培養(yǎng)，裝液為20％的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中的MgSO4·7H2O，葡萄糖，甘油分別配成母液，單獨(dú)滅菌，用時(shí)添加相應(yīng)的量，并加入過(guò)濾除菌100mg·mL-1的硫酸卡那霉素100μL，加入5％的種子液，37℃，200rpm，培養(yǎng)8h，加入20％的乳糖誘導(dǎo)液，28℃，200rpm，誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。
菌體的收集及粗酶液的獲得：將發(fā)酵液8000rpm離心5min，稱(chēng)得濕重，按1g濕菌體加入20mL pH7.5，20mmol·mL-1的磷酸緩沖液的比例重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，使用過(guò)程破壁4min，停1min，并吹打菌液，防止破壁過(guò)程中因溫度過(guò)高導(dǎo)致酶的失活，破壁30min后8000rpm離心10min，上清即為粗酶液。
(2)COD的純化
以瓊脂糖為基質(zhì)，2-羥基-1,3-丙二胺連接臂，8-氯咯嗪為配體合成的介質(zhì)進(jìn)行親和純化。
1.樣品制備：將上樣粗酶液的的電導(dǎo)率與20mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.5)的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)到一致。
2.裝柱：15mL塑料小柱垂直固定，柱子下端導(dǎo)管打開(kāi)，裝入3mL介質(zhì)，靜置沉淀，使柱中乙醇流出約至略高出介質(zhì)界面。
3.平衡：用20mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.5)平衡10個(gè)柱體積。
4.上樣：取20mL粗酶液加到平衡好的親和介質(zhì)中。
5.洗滌：用20mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.5)洗10個(gè)柱體積，洗去未結(jié)合的蛋白，再用含0.1mol·L-1NaCl的磷酸緩沖液(pH 7.5)洗去部分與介質(zhì)結(jié)合不牢固的雜蛋白。
6.洗脫：以含0.5mol·L-1NaCl的磷酸緩沖液(pH 7.5)為洗脫液，收集并測(cè)定COD活性用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的分子量大小和純度。
實(shí)施例3：突變前后膽固醇氧化酶的底物特異性比較
選取膽固醇，谷甾醇，孕烯酮醇，膽甾烷醇四種底物，都配成21.3mmol·L-1的檢測(cè)液B，測(cè)定酶活，并以膽固醇為底物時(shí)的活性為100％，計(jì)算以其他類(lèi)固醇為底物時(shí)的相對(duì)活性，比較酶的底物特異性。
COD酶活的測(cè)定：
利用膽固醇氧化酶與辣根過(guò)氧化物酶的耦合反應(yīng)，膽固醇氧化酶氧化類(lèi)固醇底物產(chǎn)生的H2O2，可以在辣根過(guò)氧化酶的作用下使苯酚與4-氨基-安替比林產(chǎn)生紅色苯醌亞胺類(lèi)化合物，在A500處有最大吸收峰。具體操作：比色管中加入3mL檢測(cè)液A(4-氨基-安替比林,1mmol/L；苯酚，6mmol/L；疊氮鈉，0.2g/L；過(guò)氧化物酶，5,000U/L；磷酸鉀緩沖液，25mmol/L，pH 7.5)+50uL酶液+150uL類(lèi)固醇底物(異丙醇為溶劑)，三種組分振蕩混勻后，37℃水浴15min，立即用沸水煮3min，使酶失活，放冷水中冷卻；9000rpm，離心2min；上清A500處測(cè)吸光值，平行實(shí)驗(yàn)測(cè)三次，取平均值。酶活力單位定義：在37℃下，每分鐘催化1μmol類(lèi)固醇底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。
結(jié)果顯示，原酶(wild-type)對(duì)4種底物的活性差不多，對(duì)孕烯酮醇的活性稍好，本發(fā)明的突變體CODrM的底物特異性有顯著變化，對(duì)谷甾醇的活性最高，是對(duì)膽固醇的活性的6.2倍，而CODrM對(duì)孕烯酮醇和膽甾烷醇的活性分別為對(duì)膽固醇的活性的1倍、1.4倍。這可能是由于突變后膽固醇氧化酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而便于與谷甾醇接觸、作用。本發(fā)明的突變體，改變酶的底物特異性，對(duì)谷甾醇的活性較好。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。