一種篩選干細胞因子受體激酶抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種篩選干細胞因子受體激酶抑制劑高通量篩選方法，包括以下步驟：(1)干細胞因子受體激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：進行激酶濃度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗；(2)陽性藥驗證模型可靠性：選用合適濃度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分別加入2μl，再按濃度梯度每孔加入4μl陽性藥，加入2ul ATP開始反應(yīng)，按優(yōu)化時間室溫孵育；每孔加入10μl終止液終止反應(yīng)，室溫孵育1小時后檢測，分析數(shù)據(jù)得陽性藥IC50；(3)高通量篩選模型驗證：按照上述步驟操作，使用BiomekNXP自動化加樣儀器和Multidrop自動分液器進行加樣，計算Z因子。本發(fā)明的優(yōu)點主要有：1)簡便快捷；2)靈敏度高；3)結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，可用于高通量篩選。
【專利說明】一種篩選干細胞因子受體激酶抑制劑高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用均相時間分辨熒光檢測技術(shù)，構(gòu)建了干細胞因子受 體酪氨酸激酶（Kit)抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對Kit激酶抑制活性的高通 量檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] Kit是一種原癌基因，是HZ4貓科肉瘤病毒的胞漿逆轉(zhuǎn)錄病毒同源物，位于4號染 色體4qll_12,編碼一種相對分子質(zhì)量為145kD的跨膜糖蛋白，該蛋白屬受體酪氨酸激酶家 族成員。Kit受體分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三部分。Kit/SCF系統(tǒng)是蛋白激酶/磷酸酶 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一個重要環(huán)節(jié)。正常情況下Kit受體的活化需要SCF參與，當(dāng)Kit受體與 SCF的特異性結(jié)合后，觸發(fā)Kit受體的同源二聚體化和細胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，從而 將細胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)。Kit基因突變導(dǎo)致了Kit不依賴配體的自發(fā)性受體二聚體 化，引起Kit受體的持續(xù)激活，刺激細胞過度增殖和抗凋亡信號失控。己發(fā)現(xiàn)在許多惡性腫 瘤中均有Kit的高表達，包括胃腸道間質(zhì)瘤、前列腺癌、生殖細胞瘤、乳腺癌及小細胞肺癌 等。抑制Kit介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以達到治療腫瘤的目的已成為近年來腫瘤治療的熱點。
[0003] 時間分辨突光技術(shù)（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于鑭系元素如銪 (Eu)、釤（Sm)、鏑（Dy)等具有較長熒光壽命的特點發(fā)展而來的。當(dāng)銪螯合物供體與受體之 間距離小于l〇nm，且供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊時，則發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，均 相時間分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技術(shù)是法國Cisbio 公司利用這一原理進行深入開發(fā)的產(chǎn)品。大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光壽命非常短（一般為幾毫 秒），為了避免短暫的熒光干擾，Cisbio公司利用較長熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能 量供體，受體經(jīng)過別藻藍蛋白（allophycocyanin)或突光素修飾，供體在能量轉(zhuǎn)移時就可 以使受體也具有較長的熒光壽命。因此，能量轉(zhuǎn)移時受體發(fā)射光消失時間與供體發(fā)射光消 失時間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長了熒光檢測時間，降低了短暫熒 光引起的背景干擾。
[0004] 目前，已有多種Kit激酶抑制劑的篩選方法，多利用ELISA法來篩選Kit激酶抑制 齊[J，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準確的檢測方法，特別 是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立一種基于均相時間分辨熒光的Kit激酶抑制劑高通量篩 選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：采用均相時間分辨熒光方法建立體外Kit激酶抑制劑高通量 篩選模型，初篩，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制Kit激酶活性的候選化合物。具體步驟如下：
[0007] 本發(fā)明利用均相時間分辨熒光的方法建立了一種Kit激酶抑制劑高通量篩選模 型。
[0008] 步驟一 ：Kit激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0009] 步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0010] 步驟三：高通量篩選模型驗證。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1 :Kit激酶濃度梯度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n= 3，；土S)
[0012] 圖2 :Kit激酶溫孵時間優(yōu)化實驗結(jié)果。（n= 3, ；土S)
[0013] 圖3 :Kit激酶底物濃度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n= 3, )
[0014] 圖4 :Kit激酶ATP濃度優(yōu)化實驗結(jié)果。（n= 3,S土)
[0015] 圖5 :陽性藥十字孢堿對Kit激酶的抑制曲線圖。（n= 3，；土S〇
[0016] 圖6 :Kit激酶抑制劑高通量篩選模型信號檢測窗口。
[0017] 圖7:高通量篩選Z'值分布。

【具體實施方式】
[0018] 以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】：
[0019] 1.Kit激酶抑制劑篩選方法建立
[0020] (1)實驗材料
[0021]Kit激酶檢測試劑盒（Cisbio,法國）、Kit激酶（Invitrogen，美國）、ATP(生興， 中國）、十字孢堿（碧云天，中國）、384低體積白板（Coming,美國）、槍頭（Axygen，美國）。
[0022] (2)實驗步驟
[0023] 1)進行Kit激酶濃度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗，見圖1-4。
[0024] 2)待測化合物精確稱量，加入DMS0溶劑成母液，然后使用檢測緩沖液配制待測化 合物溶液至所需濃度，初篩濃度約為1Xl(T3m〇l/L。
[0025] 3)在反應(yīng)容器中每孔加入Kit激酶溶液2iil，底物溶液2iil，緩沖液或待篩化合 物4iil，ATP2ill。室溫反應(yīng)1小時。
[0026] 4)每孔加入Estradiol_XL6655U1，Anti-Estradiol_cryptate5U1，室溫孵育 1 小時。
[0027] 5)利用美國貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter)公司檢測平臺HTRF模塊分別檢測 665nm和610nm處的突光強度。
[0028] 6)繪制陽性藥十字孢堿量效曲線并測定其IC5Q值，見圖5。
[0029] 7)采集檢測信號并繪圖，通過信號窗和Z'值確定高通量篩選模型的可靠性，見圖 6,7。
[0030] 2?數(shù)據(jù)處理
[0031] (1)根據(jù)公式計算各孔665nm和610nm處突光強度的比值（Ratio665/610);
[0032] (2)根據(jù)公式計算各孔的相對抑制率
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種干細胞因子受體激酶抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 激酶抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶為干細胞因子受體激酶。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中進行干細胞因子受體激酶濃度梯 度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，由步驟（1)可得到最佳反應(yīng)所需的干細胞因 子受體激酶濃度為〇. lng/ yl，最佳溫孵時間為60min，最佳底物濃度為0. 38 y M，最佳ATP 濃度為21. 31iiM。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)選用步驟（1)所到的合適濃度的 激酶，ATP Km，底物Km ;將激酶和底物按1 :2體積混合，每孔加入4 iil，再按濃度梯度每孔 加入4 陽性藥，最后每孔加入2 ATP開始反應(yīng)，按優(yōu)化時間室溫孵育；配制SA-XL665 和TK-Ab，將SA-XL665和TK Ab按體積比1 :1混合，每孔加入lOiil終止反應(yīng)，室溫孵育1 小時后檢測，分析數(shù)據(jù)得陽性藥半數(shù)抑制率IC5(I為1. 599nM。
6. 權(quán)利要求1-5中所述任一方法在篩選干細胞因子受體激酶抑制劑的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK104458675SQ201310421225
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】嚴明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學(xué)