用于對nadh依賴型酶底物進行檢測的融合蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶學檢測領域，更具體地，本發(fā)明涉及用于對NADH依賴型酶底物進行 檢測的融合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 氧化還原反應是人體中一類重要的代謝反應，此類反應需要在酶的催化下才能進 行。NADH依賴型酶是參與人體氧化還原中最多的酶，據(jù)統(tǒng)計約80%的反應是由NADH依賴 型酶催化的。NADH依賴型酶的底物大都是人體中非常關鍵的代謝產物。許多代謝疾病的發(fā) 生都與這些代謝物水平的異常有關。因此，NADH依賴型酶底物的檢測對疾病的診斷和治療 以及基礎研宄都有重大價值。
[0003] 但是，由于多數(shù)NADH依賴型酶底物沒有明顯的光學特性，故很難用常規(guī)的光學手 段直接檢測這些代謝產物。較早的檢測方法主要是滴定法、HPLC分析、氣相色譜法等化學 分析法，此類方法存在兩個主要的缺陷：1、檢測操作復雜且耗時；2、有效靈敏度受儀器精 密度所限。隨后，根據(jù)NADH依賴型酶催化其底物產生或消耗NADH特性，發(fā)展出了一系列酶 學檢測方法，包括：
[0004] NADH吸光法：NADH依賴性酶都以NADH或NAD+為輔酶，其催化的反應都會產生或 消耗NADH。在吸光方面，NADH在260nm和340nm處各有一吸收峰，而NAD+則只有260nm - 處吸收峰，兩者間的這種屬性差異使得NADH成為NADH依賴性酶檢測的重要指標，通過測定 反應混合溶液對340nm光吸收的變化來監(jiān)控酶促反應的進程。已知NADH在340nm的吸光 系數(shù)為6. 2*103lV(m〇l*cm)，根據(jù)檢測結果可以直接計算出酶的活力，此種方法雖然操作方 便，但靈敏度不高，會影響測定結果的精準度。
[0005] NADH熒光檢測法：作為NADH依賴性酶的重要檢測指標，NADH除具有吸光特性外， 還是一種強焚光物質，其最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為340和460nm，而NAD+則無焚光。 NADH的這一特性為其熒光分析法奠定了基礎，因而很早就建立了 NADH的熒光測定法，雖然 熒光檢測法的靈敏度比吸光法提高了許多，但是仍未能滿足實驗的需要。
[0006] MTT及其類似物分析法：MTT是一種黃顏色的染料，全稱3-(4,5_二甲基噻 唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，主要用于檢測細胞活力，也常用于NAD+(NADP+)相關的酶 偶聯(lián)分析。MTT用于NADH依賴性酶分析的原理是：NADH依賴性酶催化產生的NADH，可通過 硫酸甲酯吩嗪（PMS)將電子傳遞給MTT，使得MTT被還原成甲臜，后者在波長560nm處有最 大吸光，故可在560nm檢測反應混合溶液的0D值以測定NADH依賴性酶的活力。但是由于 MTT經還原所產生的甲臜難溶于水，需要被溶解后才能檢測，既增加了工作量，又影響了實 驗結果的準確性，故研宄人員又相繼開發(fā)了許多MTT的替代產品，例如，XTT，MTS和WST系 列化合物，這些都是四氮唑染料，它們對NADH依賴性酶檢測的原理與MTT類似。
[0007] 酶循環(huán)法：酶循環(huán)法是采用兩種酶進行循環(huán)反應，使待測物的酶促反應產物不斷 擴增，循環(huán)數(shù)越多，擴增量也越大。酶循環(huán)法通過增加反應產物的量和降低共存物質的干 擾，提高了檢測的靈敏度。申請?zhí)枮閁S3384555 A的美國專利公開了一種NADH依賴性酶活 性的酶循環(huán)檢測方法，該方法是基于心肌黃酶/刃天青系統(tǒng)，心肌黃酶催化NADH依賴性酶 的生成物NADH將電子轉移到刃天青上，產生強熒光的試鹵靈，通過測定后者的熒光來計算 酶活。
[0008] 雖然MTT及其類似物分析法和酶循環(huán)法都大大提高了檢測靈敏度。但是它們的電 子轉移受體對NADH的選擇性較低，NADPH等其它一些電子供體會對檢測產生干擾，從而影 響檢測結果的準確性近年來，一些NADH依賴型酶底物的探針也見諸于文獻報道。然而，以 上大部分的方法都有不同程度的缺陷，或者檢測靈敏度低，或者特異性差，或者生物兼容性 差。
[0009]因此，本領域亟需發(fā)展一種靈敏度高，特異性好的NADH依賴型酶底物檢測技術。 在酶法分析中，直接檢測NADH吸光或熒光的信號很弱，檢測結果誤差較大。近年來基于Rex 蛋白和環(huán)形置換熒光蛋白融合的遺傳編碼NADH熒光探針已經被報道，此類探針的靈敏度 高，干擾小，并且可用于單細胞或細胞器的動力學檢測，此外，還可通過基因工程手段對探 針修飾，改變探針對NADH響應的動力學范圍，以滿足實驗需要。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供用于對NADH依賴型酶底物進行檢測的融合蛋白及其應 用。
[0011] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于對NADH依賴型酶底物進行檢測的融合蛋白， 所述的融合蛋白包括：NADH依賴型酶；和NADH熒光探針，其包含：對環(huán)境內NADH敏感的多 肽和通過光譜性質的改變對環(huán)境內NADH進行表現(xiàn)的部分。
[0012] 在一個優(yōu)選例中，所述的NADH依賴型酶是催化NADH依賴型底物將H+轉移給NAD + 而產生NADH的酶。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的NADH依賴型酶包括（但不限于）：乳酸脫氫酶（LDHA)、蘋 果酸脫氫酶（MDH1)、異檸檬酸脫氫酶（IDH3A)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)、a -酮戊二 酸脫氫酶（0GDH)和磷酸甘油酸脫氫酶（HGDH)。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的乳酸脫氫酶的底物為L-乳酸，所述的蘋果酸脫氫酶的底 物為L-蘋果酸、所述的異檸檬酸脫氫酶的底物為異檸檬酸、所述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶 的底物為甘油醛-3-磷酸、所述的a-酮戊二酸脫氫酶的底物為a-酮戊二酸，所述的磷酸 甘油酸脫氫酶的底物為a-羥基戊二酸。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述通過光譜性質的改變對環(huán)境內NADH進行表現(xiàn)的部分是熒 光蛋白序列；所述對NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽：（1)具有NADH結合特性的 Rossman結構域；和/或（2)來源于對NADH敏感的轉錄調控因子Rex家族蛋白。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的NADH熒光探針是SuperFrex探針。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的SuperFrex探針包括：（a)具有SEQ ID N0 :1所示氨基酸 序列的多肽；(b)將SEQ ID N0 :1氨基酸序列經過一個或多個（如1-30個，更佳地1-20個， 更佳地1-10個，更佳地1-5個或1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有 抗腫瘤功能的由（a)衍生的多肽；（c)與SEQ ID N0 :1氨基酸序列具有80%以上（較佳地 90%以上；更佳地95%以上；更佳地98%以上或99%以上）的序列相同性的，且具有抗腫 瘤功能的多肽；（d)SEQ ID N0 :1所示氨基酸序列的多肽的生物活性片段；或（e)在（a)多 肽的N或C末端添加標簽序列，或在其N末端添加信號肽序列構成的多肽。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的乳酸脫氫酶（LDHA)、蘋果酸脫氫酶（MDH1)、異檸檬酸脫 氫酶（IDH3A)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)、a -酮戊二酸脫氫酶（0GDH)和磷酸甘油酸 脫氫酶（HGDH)依次是：具有 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :7所示氨基酸序列的多肽；或這些多肽的同功能變異多肽或衍生多 肽。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的NADH依賴型酶位于融合蛋白的N端，所述的NADH熒光探 針位于融合蛋白的C端。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的NADH依賴型酶與所述的NADH熒光探針之間，還包括連接 肽；較佳地連接肽長度為2~50aa;更佳地為2~30aa。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽包括（但不限于）：PW，ASA，ASGA(SEQ ID NO ：72),GSASG(SEQ ID NO ：73),ASGASGA(SEQ ID NO ：74),ASGASSASGA(SEQ ID NO： 75) , ASGASSGAGSASGA(SEQ ID NO ：76), PWAAATAASSASASASAPW (SEQ ID NO ：77), PWASAAMTMSSASASAS APW(SEQ ID N0:78)，PWAAATAMATAASSAS ASASAPW(SEQ ID N0:79)。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼前面任一所述 的融合蛋白。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達載體，其包含與表達控制序列操作性連接的 所述的多核苷酸的序列。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細胞，其包含所述的表達載體，或其基因組中 整合有所述的多核苷酸。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備前面所述的融合蛋白的方法，該方法包括以 下步驟：（a)培養(yǎng)所述的宿主細胞，和（b)由所述宿主細胞表達和分離所述的融合蛋白。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的融合蛋白的用途，用于對NADH依賴型 酶底物進行檢測；或用于制備對NADH依賴型酶底物進行檢測的檢測試劑或試劑盒。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測NADH依賴型酶底物的方法，所述方法包括：
[0028] (1)在包含NAD+的反應體系內，將前面任一所述的融合蛋白與待測樣品混合；（2) 測定融合蛋白中NADH熒光探針感應NADH所產生的熒光變化，確定待測樣品中NADH依賴型 酶底物的存在情況或存在量。
[0029] 在一個優(yōu)選例中，所述的融合蛋白中，所述的NADH焚光探針是SuperFrex探針；通 過分析反應的速度或達到平衡時420nm/485nm的熒光比率來確定相應底物的存在情況或 存在量。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的NADH依賴型酶底物包括（但不限于）：L-乳酸，L-蘋果 酸、異檸檬酸、甘油醛-3-磷酸、a-酮戊二酸，a-羥基戊二酸。
[0031] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測NADH依賴型酶底物的試劑盒，所述試劑 盒中包括：前面任一所述的融合蛋白，或前面所述的表達載體。
[0032] 在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括以下一種或多種：NAD+溶液，Ifepes，多 孔板，使用說明書。
[0033] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0034] 圖1、本發(fā)明的融合蛋白探針對NADH依賴型酶底物進行檢測的原理