本發(fā)明涉及一種制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，具體的說是酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝及醇脫氫酶突變體。
背景技術(shù)：
：生物催化具有反應條件溫和、效率高、立體和區(qū)域選擇性強、環(huán)境友好等特點,因此生物催化在新藥的研究和開發(fā)中得到了廣泛的應用。此外,利用理性設(shè)計和定向進化對生物催化劑進行改造優(yōu)化，如提高催化劑的穩(wěn)定性和底物選擇性,將使其能夠更好地應用于生產(chǎn)工藝。醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase,ADH）作為生物催化劑主要是用于合成手性醇（Catal.Sci.Technol.,2011,1,1311–1323）用于手性藥物的合成。（S）-3-羥基四氫呋喃和（R）-3-羥基四氫呋喃在有機合成和藥物生產(chǎn)中有著廣泛的用途，結(jié)構(gòu)式如(S)-2和(R)-2所示：，其中（S）-構(gòu)型的主要用來合成HIV抑制劑安普那韋和膦沙那韋（Tetrahedron:Asymmetry2012,23,898-903）。目前（S）-或/和（R）-3-羥基四氫呋喃主要用化學法合成，如，用蘋果酸和酒石酸為起始原料合成（S）-3-羥基四氫呋喃及其對映體（R）-3-羥基四氫呋喃（TheJournalofOrganicChemistry1983,48,2767-2769）。也有用酯酶對3-乙酸酯四氫呋喃通過動態(tài)拆分獲得（S）-3-羥基四氫呋喃的報道（FEBSJournal2013,280,3084-3093.），但這種方法的轉(zhuǎn)化率最高只有50%。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝及醇脫氫酶突變體，該方法利用醇脫氫酶突變體制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，可以實現(xiàn)底物的全轉(zhuǎn)化及高立體選擇性。一種酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，包括以下步驟：以3-酮基四氫呋喃為底物，該底物在醇脫氫酶突變體、輔因子以及輔因子再生體系在緩沖體系中發(fā)生生物催化反應生成手性3-羥基四氫呋喃；所述醇脫氫酶突變體為，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脫氫酶突變體所采用的醇脫氫酶，其野生基因序列來源于嗜熱菌（Thermoethanolicusbrockii），堿基序列如SEQIDNo:1；該醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羥基四氫呋喃為（S）-3-羥基四氫呋喃（即S-3-羥基四氫呋喃）或（R）-3-羥基四氫呋喃（即R-3-羥基四氫呋喃）。酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝具體操作如下：①、配制反應體系：反應體系中包括，磷酸鹽緩沖液，5~50mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和10%的異丙醇，醇脫氫酶突變體的粗酶液和0.01~0.1mmol/L的輔因子；②、將反應體系置于25～37℃的條件下進行反應，得到手性3-羥基四氫呋喃。用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率。所述磷酸鹽緩沖液的pH值為為7.0~8.0，濃度為50~100mmol/L。所述輔因子為NAD+或NADP+。所述輔因子以異丙醇為底物通過醇脫氫酶突變體的自催化進行再生。所述醇脫氫酶突變體也可以應用于催化雜環(huán)醇類化合物，該類雜環(huán)醇類化合物的結(jié)構(gòu)式為或。有益效果是：本發(fā)明酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，利用定向進化方法改造醇脫氫酶獲得的醇脫氫酶突變體，采用醇脫氫酶突變體制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，與化學法相比，具有環(huán)境污染小，效率高，光學選擇性高等優(yōu)點；與酶拆分法相比具有較高的純度和轉(zhuǎn)化率，ee值和轉(zhuǎn)化率均可達到99%。附圖說明圖1為突變體庫A的引物設(shè)計與構(gòu)建示意圖；圖2為突變體庫B的引物設(shè)計與構(gòu)建示意圖。具體實施方式一種酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝，包括以下步驟：以3-酮基四氫呋喃為底物，該底物在醇脫氫酶突變體、輔因子以及輔因子再生體系在緩沖體系中發(fā)生生物催化反應生成手性3-羥基四氫呋喃；所述醇脫氫酶突變體為，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脫氫酶突變體所采用的醇脫氫酶，其野生基因序列來源于嗜熱菌（Thermoethanolicusbrockii），堿基序列如SEQIDNo:1；該醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羥基四氫呋喃為（S）-3-羥基四氫呋喃或（R）-3-羥基四氫呋喃。其中所述的醇脫氫酶突變體，其中突變體I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q、I86V/L294H或I86L/W110S/L294Q等可以用于（S）-3-羥基四氫呋喃的酶法合成；醇脫氫酶突變體A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N、A85V/I86L/W110S、I86Q/C295Q、I86N/C295A或I86Q/C295N等可以用于（R）-3-羥基四氫呋喃的酶法合成。酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝操作如下：①、配制反應體系：反應體系中包括，磷酸鹽緩沖液，5~50mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和10%異丙醇，醇脫氫酶突變體的粗酶液和0.01~0.1mmol/L的輔因子；②、將反應體系置于25～37℃的條件下進行反應，得到手性3-羥基四氫呋喃。用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率。所述磷酸鹽緩沖液的pH值為為7.0~8.0，濃度為50~100mmol/L。所述輔因子為NAD+或NADP+。所述輔因子以異丙醇為底物通過醇脫氫酶突變體的自催化進行再生。所述醇脫氫酶突變體也可以應用于催化雜環(huán)醇類化合物，該類雜環(huán)醇類化合物的結(jié)構(gòu)式為或。所述醇脫氫酶突變體所表示的含義如下：I86V/W110L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)槔i氨酸（V），第110位的色氨酸（W）突變?yōu)榱涟彼幔↙）和第294位的亮氨酸（L））突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；A85V/I86L/W110Q/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位的丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V），第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙），第110位的色氨酸（W）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）和第294位的亮氨酸（L））突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；I86L/W110Q/L294Q/D307Y，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙），110位的色氨酸（W）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），294位的亮氨酸（L）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）和307位的天冬氨酸（D）突變?yōu)槔野彼幔╕）；I86L/W110Q/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙），第110位的色氨酸（W）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）和第294位的亮氨酸（L））突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；A85V/I86L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位的丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V），第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙）和第294位的亮氨酸（L））突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；I86L/W110L/L294Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙），第110位的色氨酸（W）突變?yōu)榱涟彼幔↙）和第294位的亮氨酸（L））突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；I86V/L294H，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)槔i氨酸（V），第294位的亮氨酸（L）突變?yōu)榻M氨酸（H）I86L/W110S/L294Q,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙）第110位的色氨酸（W）突變?yōu)榻z氨酸（S）和第294位的亮氨酸（L）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；A85V/I86N/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V）,第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟）,第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；A85V/I86N/L294V/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V）,第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），第294位的亮氨酸（L）突變?yōu)槔i氨酸（V）和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；I86N/L294V/C295N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），294位的亮氨酸（L）突變?yōu)槔i氨酸（V）,和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；I86N/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟）和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；C295D，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於彼幔―）;I86N,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟）;I86Q,指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）;L294Q/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第294位的亮氨酸（L）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；I86V/W110L/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位的異亮氨酸（I）突變?yōu)槔i氨酸（V），第110位的色氨酸（W）突變?yōu)榱涟彼幔↙），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）;A85V/I86L/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V）,第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙）和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）；I86N/C295Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楣劝卑罚≦）；I86N/C295I，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）；I86N/C295G，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楦拾彼幔℅）；I86N/C295H，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)榻M氨酸（H）；I86N/C295P，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楦彼幔≒）；I86N/C295D，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於彼幔―）；I86N/C295M，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕）；I86N/C295E，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楣劝彼幔‥）；I86N/C295S，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)榻z氨酸（S）；I86N/L294V，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），和第294位的亮氨酸（L）突變?yōu)槔i氨酸（V）；I86A/L294N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)楸彼幔ˋ），和294位的亮氨酸（L）突變?yōu)樘於０罚∟）；A85V/I86L/W110S，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第85位丙氨酸（A）突變?yōu)槔i氨酸（V）,第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)榱涟彼幔↙），和第110位的色氨酸（W）突變?yōu)榻z氨酸（S）；I86Q/C295Q，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楣劝滨０罚≦）；I86N/C295A，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)樘於０罚∟），第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)楸彼幔ˋ）；I86Q/C295N，指氨基酸序列如SEQIDNo:2的醇脫氫酶氨基酸序列的第86位異亮氨酸（I）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），第295位的半胱氨酸（C）突變?yōu)樘於０罚∟）。實施例1在反應體系中依次加入pH值為7.0，濃度為50mmol/L，磷酸鹽緩沖液，5mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.01mmol/L的NAD+和醇脫氫酶突變體A85V/I86N/L294V/C295N的粗酶液，在30℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率；產(chǎn)物為（R）-3-羥基四氫呋喃，ee值為97%，轉(zhuǎn)化率達到97%。實施例2在反應體系中依次加入為pH值為7.4，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，5mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.05mmol/L的NAD+作為輔因子和I86N/C295N醇脫氫酶突變體粗酶液，在25℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物為（R）-3-羥基四氫呋喃，ee值為99%，轉(zhuǎn)化率為99%。實施例3在反應體系中依次加入為pH值為7.4，濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，5mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.01~0.1mmol/L的NADP+作為輔因子和I86V/W110L/L294Q醇脫氫酶突變體裂解液，在30℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率；產(chǎn)物為（S）-3-羥基四氫呋喃，ee值為95%，轉(zhuǎn)化率為99%。實施例4在反應體系中依次加入pH值為為7.4，濃度為90mmol/L的磷酸鹽緩沖液，50mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.05mmol/L的NADP+作為輔因子和醇脫氫酶突變體A85V/I86L/W110Q/L294Q的粗酶液，在37℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率；產(chǎn)物為（S）-3-羥基四氫呋喃，ee值為95%，轉(zhuǎn)化率為99%。實施例5在反應體系中依次加入pH值為為8.0，濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，30mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.05mmol/L的NADP+作為輔因子，醇脫氫酶突變體I86V/W110L/C295N醇脫氫酶突變體，在30℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率；產(chǎn)物為（R）-3-羥基四氫呋喃，ee值為96%，轉(zhuǎn)化率為98%。實施例6在反應體系中依次加入pH值為為7.0，濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，5mmol/L的3-酮基四氫呋喃作為底物和終濃度為10%的異丙醇，0.1mmol/L的NADP+作為輔因子，I86Q/C295N醇脫氫酶突變體粗酶液，在30℃的條件下反應14-16小時，用乙酸乙酯提取產(chǎn)物和底物并用GC檢測反應過程，測定ee值及轉(zhuǎn)化率；產(chǎn)物為（R）-3-羥基四氫呋喃，ee值為99%，轉(zhuǎn)化率為99%。以下為多種醇脫氫酶突變體的制備及其將其用于制備手性3-羥基四氫呋喃的具體實施方案及所制備的手性3-羥基四氫呋喃ee值和轉(zhuǎn)化率對比：1、基因克隆本發(fā)明所使用的醇脫氫酶野生序列來源于嗜熱菌（Thermoethanolicusbrockii），堿基序列如SEQIDNo:1；該醇脫氫酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。將該醇脫氫酶野生序列按照文獻Chembiochem2012,13,1465-1473的構(gòu)建方法克隆入pRSFDuet-1獲得pRSFADH用作定向進化的模板。、單點飽和突變選取醇脫氫酶ADH活性催化中心周圍的氨基酸殘基，如：C37，A85，I86，W110，Y267，L294和C295，使用簡并密碼子NNK分別對所選取的八個位點進行單點飽和突變，所用PCR引物如表1所示。單點飽和突變PCR程序如下：50μl反應體系依次加入5μlKOD熱啟動DNA聚合酶緩沖液(10×),3μl25mmol/LMgSO4,5μl2mmol/LdNTP,2.5μlDMSO,0.5μl(50~100ng)DNA模板,100μmol/L正向引物和反向引物各0.5μl和1μlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃5min)×24循環(huán),68℃10min,16℃30min。獲得PCR產(chǎn)物加入2μlDpnI37℃消化2h以上去除模板質(zhì)粒，吸取1~2μl通過電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，建立單點飽和突變體庫。挑取單克隆于含有50ug/ml卡那霉素的300μlLB培養(yǎng)基的2ml96深孔板中，每個單點飽和突變體庫挑取96個克隆，37℃，220rmp搖床中培養(yǎng)過夜。將120μl培養(yǎng)液轉(zhuǎn)出進行甘油板保藏，在剩余的培養(yǎng)液中直接加入800μl含有0.2mmol/LIPTG和50ug/ml的卡那霉素的TB培養(yǎng)基，于30℃誘導培養(yǎng)8h。4000rmp，4℃，離心10min收取細胞，去除上清液，用400μl50mmol/LpH7.4的磷酸鉀緩沖液洗一次，之后用同樣體積的緩沖液加入1mg/ml溶菌酶和6U的DNA酶，30℃裂解細胞1h。然后4000rmp，4℃，離心30min獲得上清液，轉(zhuǎn)出300μl上清液于新的96孔板中，加入5mmol/L3-酮基四氫呋喃，50umol/LNADP+和總體積10%的異丙醇，總體積為400ul每孔，30oC反應14～16h，然后用等體積的乙酸乙酯進行萃取，萃取液進行氣相色譜篩選，所用手性色譜柱子為：Hydrodex-β-TBDAc,25mx0.25mmID，檢測條件：起始125℃以3℃/min的速度升至135℃,然后以50℃/min速度升至220℃，H2壓力為1.5bar。出峰時間為：底物1:1.3min，(S)-2:3.1min，(R)-2:3.3min，獲得醇脫氫酶突變體，并將其用于制備手性3-羥基四氫呋喃，結(jié)果如表2所示。、多點組合突變庫A的構(gòu)建將A85，I86，L294和C295分為一組，組合突變體為纈氨酸(V),天冬酰胺（N）和亮氨酸（L），引物設(shè)計和突變體庫構(gòu)建參考圖1所示，使用STG為簡并密碼子代表V和L，N單獨使用ATT為密碼子。引物序列參考表3所示，將各條單引物按照等摩爾量混合，如：使用ATT為密碼子時定為1份，那么STG就需要添加2份，因為STG代表了兩種氨基酸密碼子，這樣獲得的結(jié)果才是等摩爾量，如此獲得混合引物F1和R1。多點飽和突變體庫A的構(gòu)建分兩步進行，如下：1）大引物片段的獲得：50μl反應體系依次加入5μlKOD熱啟動DNA聚合酶緩沖液(10×),3μl25mmol/LMgSO4,5μl2mmol/LdNTP,2.5μlDMSO,0.5μl(50~100ng)DNA模板,100μmol/L正向引物F1和反向引物R1各0.5μl和1μlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循環(huán),68℃2min,16℃30min。獲得PCR產(chǎn)物片段作為大引物。2）突變體庫的構(gòu)建：50μl反應體系依次加入5μlKOD熱啟動DNA聚合酶緩沖液(10×),3μl25mmol/LMgSO4,5μl2mmol/LdNTP,2.5μlDMSO,0.5μl(50~100ng)DNA模板,大引物片段2μl和1μlKODDNA聚合酶。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,60℃30sec,68℃5min)×24循環(huán),68℃10min,16℃30min，獲得PCR產(chǎn)物加入2μlDpnI37℃消化2h以上去除模板質(zhì)粒，吸取1~2μl通過電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，建立突變體庫A。突變體庫A的篩選參單點飽和突變體庫的篩選，篩選576個單克隆；所獲得的單克隆參照上述單點飽和突變中的工藝獲得醇脫氫酶突變體，且將其用于制備手性3-羥基四氫呋喃，結(jié)果如表5所示。、多點組合突變庫B的構(gòu)建將A85，I86，W110和L294分為一組，組合突變體為纈氨酸(V),谷氨酰胺（Q）和亮氨酸（L），引物設(shè)計和突變體庫構(gòu)建如圖2所示，使用STG為簡并密碼子代表V和L，Q單獨使用CAG為密碼子。引物序列參考表4所示，將各條單引物按照等摩爾量混合，獲得混合引物F2/R2和F3/R3。多點飽和突變體庫B的構(gòu)建分三步進行，如下：1）A85/I86-W110片段和W110-L294片段的獲得：50μl反應體系依次加入5μlKOD熱啟動DNA聚合酶緩沖液(10×),3μl25mmol/LMgSO4,5μl2mmol/LdNTP,2.5μlDMSO,0.5μl(50~100ng)DNA模板,和1μlKODDNA聚合酶，分別加入100μmol/L引物對F2/R2或引物對F3/R3各0.5μl。采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循環(huán),68℃2min,16℃30min。分別獲得A85/I86-W110片段和W110-L294片段。2）大引物片段的獲得，將1）獲得兩個片段A85/I86-W110和W110-L294作為模板，利用引物對F2/R3做重疊PCR。50μl反應體系依次加入5μlKOD熱啟動DNA聚合酶緩沖液(10×),3μl25mmol/LMgSO4,5μl2mmol/LdNTP,2.5μlDMSO,0.5μl(50~100ng)DNA模板,采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,56℃30sec,68℃40sec)×32循環(huán),68℃2min,16℃30min，獲得大引物片段，采用PCR程序：95℃3min,(95℃30sec,60℃30sec,68℃5min)×24循環(huán),68℃10min,16℃30min，獲得PCR產(chǎn)物加入2μlDpnI37℃消化2h以上去除模板質(zhì)粒，吸取1~2μl通過電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，建立突變體庫B。突變體庫B的篩選參考單點飽和突變體庫的篩選，篩選576個單克??；所獲得的單克隆參照上述工藝，獲得醇脫氫酶突變體，且將其用于制備手性3-羥基四氫呋喃，結(jié)果如表5所示。、多點組合突變庫C的構(gòu)建將A85，I86，W110和L294分為一組，A85突變?yōu)閂或W，I86突變?yōu)閂，L或A，W110突變?yōu)镚，S或L，L294突變?yōu)镹，H或Q。引物設(shè)計和突變體庫構(gòu)建參考圖2所示，引物序列參考表6所示，將各條單引物按照等摩爾量混合，獲得混合引物F4/R4和F5/R5。多點組合突變體庫C的構(gòu)建參考B的構(gòu)建，篩選576個克隆，并獲得醇脫氫酶突變體，且將其用于制備手性3-羥基四氫呋喃，結(jié)果如表7所示。、以I86N為模板對C295單點飽和突變以突變體I86N為模板，對點C295進行飽和突變，使用NNK為簡并密碼子，引物序列參考表1中的ADH-C295NNK-F和ADH-C295NNK-R，構(gòu)建和篩選過程參考上述2單點飽和突變，結(jié)果如表8所示。、定點突變采用定點突變策略構(gòu)建突變體I86Q/C295N，I86Q/C295Q，L294Q/C295N，A85V/I86L/C295N和I86V/W110L/C295N。所用模板和引物如表9所示。首先用正向引物和反向引物PCR擴增小片段，然后用該小片段為大引物擴增整個質(zhì)粒，獲得的PCR產(chǎn)物用DpnI消化之后，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，獲得單克隆，測序驗證。PCR程序參考多點組合突變庫A的構(gòu)建，突變體測定結(jié)果見表10所示。表1.單點飽和突變所用引物引物寡核苷酸DNA序列（從5'端至3'端）ADH-C37NNK-FGACCTCTAGCTGTGGCCCCTNNKACTTCGGACATTCATACCGTTTTTGAADH-C37NNK-RTCAAAAACGGTATGAATGTCCGAAGTMNNAGGGGCCACAGCTAGAGGTCADH-A85NNK-FGTGATCGCGTTGTTGTGCCANNKATTACCCCTGATTGGCGGACCTCADH-A85NNK-RGAGGTCCGCCAATCAGGGGTAATMNNTGGCACAACAACGCGATCACADH-I86NNK-FGTGATCGCGTTGTTGTGCCAGCTNNKACCCCTGATTGGCGGACCTCADH-I86NNK-RGAGGTCCGCCAATCAGGGGTMNNAGCTGGCACAACAACGCGATCACADH-W110-NNK-FCCGGTGGAATGCTGGCAGGCNNKAAATTTTCGAATGTAAAAGATGADH-W110-NNK-RCATCTTTTACATTCGAAAATTTMNNGCCTGCCAGCATTCCACCGGADH-Y267-NNK-FGCACCATCGCTAATGTAAATNNKTTTGGCGAAGGAGAGGTTTTGADH-Y267-NNK-RCAAAACCTCTCCTTCGCCAAAMNNATTTACATTAGCGATGGTGCADH-L294NNK-FCATAAAACTATAAAAGGCGGGNNKTGCCCCGGTGGACGTCTAAGAATGADH-L294NNK-RCATTCTTAGACGTCCACCGGGGCAMNNCCCGCCTTTTATAGTTTTATGADH-C295NNK-FCATAAAACTATAAAAGGCGGGCTANNKCCCGGTGGACGTCTAAGAATGADH-C295NNK-RCATTCTTAGACGTCCACCGGGMNNTAGCCCGCCTTTTATAGTTTTATG表2.單點飽和突變體篩選結(jié)果表3.構(gòu)建多點組合突變體庫A所用引物表4.構(gòu)建多點組合突變體庫B所用引物表5.多點組合飽和突變庫A和B篩選結(jié)果*D307Y是通過PCR突變額外引入。表6.構(gòu)建多點組合突變體庫C所用引物表7.多點組合突變體庫C的篩選結(jié)果突變體突變位點ee值（%）轉(zhuǎn)化率（%）手性單體SZ2150A85V/I86L/L294Q9499(S)SZ2151A85V/I86L/L294H8653(S)SZ2153W110L/L294Q8291(S)SZ2154I86V/W110S/L294Q8159(S)SZ2155A85V/I86L/W110S>9918(R)SZ2157I86L/L294Q8193(S)SZ2160I86L/W110S7896(S)SZ2161I86L/W110S/L294Q9040(S)SZ2162I86A/L294N9295(R)SZ2163I86V/L294H9091(S)SZ2165I86L/W110L/L294Q9197(S)SZ2166I86V/L294Q8297(S)表8.以突變體I86N為模板的C295NNK篩選結(jié)果突變體突變位點ee值（%）轉(zhuǎn)化率（%）手性單體SZ2236I86N/C295Q>9997(R)SZ2241I86N/C295H>9989(R)SZ2271I86N/C295D>9997(R)SZ2273I86N/C295E>9992(R)SZ2274I86N/C295I>9984(R)SZ2276I86N/C295S9480(R)SZ2277I86N/C295M9589(R)SZ2281I86N/C295G>9997(R)SZ2284I86N/C295A8997(R)SZ2288I86N/C295P>9914(R)表9.定點突變所用模板和引物表10.突變體ee值及轉(zhuǎn)化率測定結(jié)果突變體突變位點ee值（%）轉(zhuǎn)化率（%）手性單體SZ2234I86Q/C295N>99>99(R)SZ2244I86Q/C295Q>9999(R)SZ2321L294Q/C295N9498(R)SZ2315A85V/I86L/C295N9599(R)Z2319I86V/W110L/C295N9484(R)SEQUENCELISTING<110>洛陽華榮生物技術(shù)有限公司<120>一種酶法制備手性3-羥基四氫呋喃的工藝<130>1<160>79<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1059<212>DNA<213>嗜熱菌（Thermoethanolicusbrockii）<400>1atgaaaggttttgcaatgctcagtatcggtaaagttggctggattgagaaggaaaagcct60gctcctggcccatttgatgctattgtaagacctctagctgtggccccttgcacttcggac120attcataccgtttttgaaggagccattggcgaaagacataacatgatactcggtcacgaa180gctgtaggtgaagtagttgaagtaggtagtgaggtaaaagattttaaacctggtgatcgc240gttgttgtgccagctattacccctgattggcggacctctgaagtacaaagaggatatcac300cagcactccggtggaatgctggcaggctggaaattttcgaatgtaaaagatggtgttttt360ggtgaattttttcatgtgaatgatgctgatatgaatttagcacatctgcctaaagaaatt420ccattggaagctgcagttatgattcccgatatgatgaccactggttttcacggagctgaa480ctggcagatatagaattaggtgcgacggtagcagttttgggtattggcccagtaggtctt540atggcagtcgctggtgccaaattgcgtggagccggaagaattattgccgtaggcagtaga600ccagtttgtgtagatgctgcaaaatactatggagctactgatattgtaaactataaagat660ggtcctatcgaaagtcagattatgaatctaactgaaggcaaaggtgtcgatgctgccatc720atcgctggaggaaatgctgacattatggctacagcagttaagattgttaaacctggtggc780accatcgctaatgtaaattattttggcgaaggagaggttttgcctgttcctcgtcttgaa840tggggttgcggcatggctcataaaactataaaaggcgggctatgccccggtggacgtcta900agaatggaaagactgattgaccttgttttttataagcgtgtcgatccttctaagctcgtc960actcacgttttccggggatttgacaatattgaaaaagcctttatgttgatgaaagacaaa1020ccaaaagacctaatcaaacctgttgtaatattagcataa1059<210>2<211>352<212>PRT<213>嗜熱菌（Thermoethanolicusbrockii）<400>2MetLysGlyPheAlaMetLeuSerIleGlyLysValGlyTrpIleGlu151015LysGluLysProAlaProGlyProPheAspAlaIleValArgProLeu202530AlaValAlaProCysThrSerAspIleHisThrValPheGluGlyAla354045IleGlyGluArgHisAsnMetIleLeuGlyHisGluAlaValGlyGlu505560ValValGluValGlySerGluValLysAspPheLysProGlyAspArg65707580ValValValProAlaIleThrProAspTrpArgThrSerGluValGln859095ArgGlyTyrHisGlnHisSerGlyGlyMetLeuAlaGlyTrpLysPhe100105110SerAsnValLysAspGlyValPheGlyGluPhePheHisValAsnAsp115120125AlaAspMetAsnLeuAlaHisLeuProLysGluIleProLeuGluAla130135140AlaValMetIleProAspMetMetThrThrGlyPheHisGlyAlaGlu145150155160LeuAlaAspIleGluLeuGlyAlaThrValAlaValLeuGlyIleGly165170175ProValGlyLeuMetAlaValAlaGlyAlaLysLeuArgGlyAlaGly180185190ArgIleIleAlaValGlySerArgProValCysValAspAlaAlaLys195200205TyrTyrGlyAlaThrAspIleValAsnTyrLysAspGlyProIleGlu210215220SerGlnIleMetAsnLeuThrGluGlyLysGlyValAspAlaAlaIle225230235240IleAlaGlyGlyAsnAlaAspIleMetAlaThrAlaValLysIleVal245250255LysProGlyGlyThrIleAlaAsnValAsnTyrPheGlyGluGlyGlu260265270ValLeuProValProArgLeuGluTrpGlyCysGlyMetAlaHisLys275280285ThrIleLysGlyGlyLeuCysProGlyGlyArgLeuArgMetGluArg290295300LeuIleAspLeuValPheTyrLysArgValAspProSerLysLeuVal305310315320ThrHisValPheArgGlyPheAspAsnIleGluLysAlaPheMetLeu325330335MetLysAspLysProLysAspLeuIleLysProValValIleLeuAla340345350<210>3<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>nisa,c,g,ort<400>3gacctctagctgtggcccctnnkacttcggacattcataccgtttttga49<210>4<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(28)..(29)<223>nisa,c,g,ort<400>4tcaaaaacggtatgaatgtccgaagtmnnaggggccacagctagaggtc49<210>5<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>nisa,c,g,ort<400>5gtgatcgcgttgttgtgccannkattacccctgattggcggacctc46<210>6<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>6gaggtccgccaatcaggggtaatmnntggcacaacaacgcgatcac46<210>7<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(24)..(25)<223>nisa,c,g,ort<400>7gtgatcgcgttgttgtgccagctnnkacccctgattggcggacctc46<210>8<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(22)..(23)<223>nisa,c,g,ort<400>8gaggtccgccaatcaggggtmnnagctggcacaacaacgcgatcac46<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>nisa,c,g,ort<400>9ccggtggaatgctggcaggcnnkaaattttcgaatgtaaaagatg45<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(24)..(25)<223>nisa,c,g,ort<400>10catcttttacattcgaaaatttmnngcctgccagcattccaccgg45<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>nisa,c,g,ort<400>11gcaccatcgctaatgtaaatnnktttggcgaaggagaggttttg44<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(23)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>12caaaacctctccttcgccaaamnnatttacattagcgatggtgc44<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(22)..(23)<223>nisa,c,g,ort<400>13cataaaactataaaaggcgggnnktgccccggtggacgtctaagaatg48<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(27)<223>nisa,c,g,ort<400>14cattcttagacgtccaccggggcamnncccgccttttatagttttatg48<210>15<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(26)<223>nisa,c,g,ort<400>15cataaaactataaaaggcgggctannkcccggtggacgtctaagaatg48<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(23)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>16cattcttagacgtccaccgggmnntagcccgccttttatagttttatg48<210>17<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>17gtgatcgcgttgttgtgccagctattacccctgattggcggacctc46<210>18<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>18gtgatcgcgttgttgtgccaaatattacccctgattggcggacctc46<210>19<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>19gtgatcgcgttgttgtgccagctaatacccctgattggcggacctc46<210>20<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>20gtgatcgcgttgttgtgccaaataatacccctgattggcggacctc46<210>21<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>21gtgatcgcgttgttgtgccastgattacccctgattggcggacctc46<210>22<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>22gtgatcgcgttgttgtgccagctstgacccctgattggcggacctc46<210>23<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>23gtgatcgcgttgttgtgccastgstgacccctgattggcggacctc46<210>24<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>24gtgatcgcgttgttgtgccaaatstgacccctgattggcggacctc46<210>25<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>25gtgatcgcgttgttgtgccastgaatacccctgattggcggacctc46<210>26<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>26cattcttagacgtccaccggggcatagcccgccttttatagttttatg48<210>27<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>27cattcttagacgtccaccggggcaattcccgccttttatagttttatg48<210>28<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>28cattcttagacgtccaccgggatttagcccgccttttatagttttatg48<210>29<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>29cattcttagacgtccaccgggattattcccgccttttatagttttatg48<210>30<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>30cattcttagacgtccaccggggcacascccgccttttatagttttatg48<210>31<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>31cattcttagacgtccaccgggcastagcccgccttttatagttttat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