本發(fā)明屬于基因工程與酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過定向進化手段獲得來源于雨生紅球藻菌株的β-胡蘿卜素酮化酶突變體、編碼它的核酸序列、含有該突變體基因的重組表達載體，以及在釀酒酵母中的表達及其在酮基類胡蘿卜素合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酮基類胡蘿卜素是存在于植物、藻類、海洋細菌和真菌中的一類重要的天然色素，屬于C40異戊二烯類化合物，含有許多的共軛雙鍵以及末端六元環(huán)上含有不飽和酮基，可以有效的猝滅單線氧，具有很強的抗氧化能力。因此具有多種生理和營養(yǎng)功能，可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品等各行業(yè)。目前市場上的這些類胡蘿卜素大都是通過化學(xué)方法合成，而化學(xué)合成過程中會引入其它雜質(zhì)化合物，降低生物安全性，另外化學(xué)合成中一些類胡蘿卜素的構(gòu)型與天然的構(gòu)型差別大，使生物學(xué)活性降低。而從天然產(chǎn)的微生物如雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母中提取含量、成本高，目前很難進行大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)掘類胡蘿卜素合成途徑中的基因，并通過生物方法利用這些基因來生產(chǎn)類胡蘿卜素既經(jīng)濟又安全。β-胡蘿卜素酮化酶是酮基類胡蘿卜素(海膽烯酮、角黃素、金盞花黃素、蝦青素等)合成途徑中的關(guān)鍵酶。在β-胡蘿卜素酮化酶的作用下，會將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成海膽酮和角黃素，也可以將玉米黃質(zhì)經(jīng)金盞花黃質(zhì)生成蝦青素。然而植物細菌來源的這些酶底物作用不專一，酶活較低。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種通過定向進化手段獲得的β-胡蘿卜素酮化酶突變體以及其在類胡蘿卜素合成當(dāng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在與提供一種通過定向進化手段獲得的β-胡蘿卜素酮化酶突變基因編碼的酮化酶及其應(yīng)用。

經(jīng)密碼子優(yōu)化后在釀酒酵母中表達的β-胡蘿卜素酮化酶基因如序列表中SEQ ID NO:15所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。本發(fā)明提供上述經(jīng)定向進化獲得β-胡蘿卜素酮化酶突變體，所述突變基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO:3的核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO:4的核苷酸序列；

(5)序列表中SEQ ID NO:5的核苷酸序列；

(6)序列表中SEQ ID NO:6的核苷酸序列；

(7)序列表中SEQ ID NO:7的核苷酸序列；

由突變基因編碼的β-胡蘿卜素酮化酶突變體，所述β-胡蘿卜素酮化酶突變體的氨基酸序列時下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

(5)序列表中SEQ ID NO:12的氨基酸序列；

(6)序列表中SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

(7)序列表中SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

任何對SEQ ID NO：14所示氨基酸序列中氨基酸經(jīng)過缺失、插入或替換一個或幾個氨基酸并與序列SEQ ID NO：14在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有β-胡蘿卜素酮化酶活性的，即具有例如將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成角黃素或者將玉米黃素轉(zhuǎn)變成蝦青素活性的，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

其中，序列表中的SEQ ID NO:8的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M1，相對于野生型SEQ ID NO:16的氨基酸其第165位的組氨酸突變成了精氨酸；序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M2，相對于野生型其第264位的纈氨酸突變成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M3，相對于野生型其第298位的苯丙氨酸變成了蘇氨酸；序列表中SEQ ID NO:11的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M12，其相對于野生型第165位的組氨酸突變成了精氨酸、第264位的纈氨酸突變成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:12的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M13，其相對于野生型第165位的組氨酸突變成了精氨酸、第298位的苯丙氨酸變成了蘇氨酸；序列表中SEQ ID NO:13的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKT-M23，相對于野生型其第264位的纈氨酸突變成了天冬氨酸、第298位的苯丙氨酸變成了蘇氨酸；序列表中SEQ ID NO:13的氨基酸序列編碼的β-胡蘿卜素酮化酶命名為OBKTM，相對于野生型其第165位的組氨酸突變成了精氨酸、第264位的纈氨酸突變成了天冬氨酸、第298位的苯丙氨酸變成了蘇氨酸。

本發(fā)明進一步涉及包含本發(fā)明的β-胡蘿卜素酮化酶基因的釀酒酵母重組表達載體。所述表達載體通過如下方法構(gòu)建得到：將SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:7所示的β-胡蘿卜素酮化酶基因ObktM1、ObktM2、ObktM3、ObktM12、ObktM13、ObktM23、ObktM插入到釀酒酵母整合型載體PUMRI-11(NCBI號：KM216413)中，得到包含ObktM1、ObktM2、ObktM3、ObktM12、ObktM13、ObktM23、ObktM基因的釀酒酵母整合型表達質(zhì)粒PUMRI-11-ObktM1,PUMRI-11-ObktM2,PUMRI-11-ObktM3，PUMRI-11-ObktM12,PUMRI-11-ObktM13,PUMRI-11-ObktM23，PUMRI-11-ObktM.

本發(fā)明進一步涉及相應(yīng)的表達β-胡蘿卜素酮化酶基因的工程菌株，將所述釀酒酵母整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，使得所述的β-胡蘿卜素酮化酶基因在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母中表達。

本發(fā)明還提供了利用β-胡蘿卜素酮化酶來產(chǎn)生酮基化類胡蘿卜素的方法。將所述的β-胡蘿卜素酮化酶在特定的產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株中進行表達。

本發(fā)明還涉及到產(chǎn)類胡蘿卜素的條件下培養(yǎng)酵母菌株以及抽提產(chǎn)生的類胡蘿卜素的步驟。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明以雨生紅球藻來源并根據(jù)在釀酒酵母中進行密碼子優(yōu)化后的β-胡蘿卜素酮化酶OBKT為研究對象，采用易錯PCR技術(shù)，利用釀酒酵母表達體系，建立了β-胡蘿卜素酮化酶突變庫，通過高通量篩選方法篩選出對β-胡蘿卜素催化活力提高的突變株，并通過基因測序分析，將突變點進行組合突變，進一步提高催化活力，并將篩選到的突變株應(yīng)用的釀酒酵母酮基化類胡蘿卜素的生產(chǎn)中。

附圖說明

圖1為用于定向進化的質(zhì)粒圖譜。

圖2為定向進化β-胡蘿卜素酮化酶的策略圖。

圖3為β-胡蘿卜素酮化酶突變體與野生型的活性比較圖。

圖4為含OBTKM與野生型的釀酒酵母菌株類胡蘿卜素HPLC分析比較圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1β-胡蘿卜素酮化酶突變基因的分子克隆與表達

1.1材料與方法

1.1.1試劑與培養(yǎng)基配方

高保真酶DNA聚合酶Prime STAR^TM HS DNA polymeras、T4DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶購于Takara公司，Easy Taq DNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，DNA marker(1kb DNAL ladder)(Thermo Scientific)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒(Axygen，杭州)等分子生物學(xué)試劑盒用于基因克隆等操作；PCR引物合成及測序服務(wù)由上海生物工程有限公司或者博尚生物公司提供。

無氨基酵母氮堿(Yeast nitrogen base without amino acids，YNB)(碧迪醫(yī)療器械，上海)用于合成培養(yǎng)基的制備；蝦青素標準品由浙江新和成有限公司提供，角黃素標準品購自阿拉丁公司，β-胡蘿卜素的標準品購自Sigma-Aldrich公司；0.22μm混合纖維素針式濾頭購自上海生物工程有限公司；其它未做特殊說明的試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

100mg/mL氨芐青霉素(Ampicillin)：稱量1g氨芐青霉素置于15mL離心管中，用滅菌水定容到10mL充分混合溶解后，利用無菌0.22μm的針式過濾器過濾除菌，分裝到1.5mL離心管后于-20℃保存。工作濃度為100μg/mL。

50mg/ml卡那霉素：

0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液(含80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)：稱取MgCl₂·6H₂O16.26g，CaCl₂ 2.22g，用去離子水溶解并定容至1L，121℃滅菌15min，冷卻后于4℃冰箱保存。

甘油-CaCl₂溶液(含0.1mol/L的CaCl₂和20％甘油)：稱取CaCl₂ 11.1g用20％的甘油溶液溶解并定容到1L，121℃滅菌15min，冷卻后于4℃冰箱保存。

1mol/L山梨醇：稱量182.17g山梨醇，加去離子水定容到1L，121℃高壓滅菌15min，冷卻后于4℃冰箱保存。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，1mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH＝7.2，固體LB培養(yǎng)基添加2％的瓊脂粉，121℃滅菌15min。

Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD)培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固體YPD培養(yǎng)基添加2％的瓊脂粉，115℃滅菌15min。

10×氨基酸儲液(10×Dropout Solution，10×DO)：稱量以下各種氨基酸，混合，溶于滅菌水中，使其終濃度為：L-Adenine hemisulfate salt 200mg/L，L-Arginine HCl 200mg/L，L-Histidine HCl monohydrate 200mg/L，L-Isoleucine 300mg/L，L-Leucine 1000mg/L，L-Lysine HCl 300mg/L，L-Methionine 200mg/L，L-Phenylalanine 500mg/L，L-Threonine 2000mg/L，L-Tryptophan 200mg/L，L-Tyrosine 300mg/L，L-Uracil 200mg/L，L-Valine 1500mg/L。配制上述氨基酸儲液時，根據(jù)篩選不同選擇標記所需要，缺失相應(yīng)的氨基酸。氨基酸母液利用0.22μm的針式過濾器過濾除菌，于4℃冰箱存放。

10×葡萄糖溶液(20g/L)：稱取20g葡萄糖，加水定容到1L，115℃滅菌15min，4℃冰箱保存。

10×半乳糖溶液(20g/L)：稱取20g半乳糖，加水定容到1L，115℃滅菌15min，4℃冰箱保存。

Synthetic Defined培養(yǎng)基：稱取YNB 1.7g，無水硫酸氨5g，瓊脂粉20g(制作平板時添加)，10×DO 100mL，加水定容至900mL，115℃滅菌15min。待冷卻到室溫后，根據(jù)實驗需要加入100mL 10×葡萄糖，或者10×半乳糖溶液，配制成相應(yīng)的SD或者SG培養(yǎng)基。若培養(yǎng)基中缺少DO中相應(yīng)的營養(yǎng)成分則在其后標注，如SD-URA表示無鳥嘧啶的SD培養(yǎng)基。

1.1.2大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備

大腸桿菌的MgCl₂-CaCl₂感受態(tài)細胞制作方法及轉(zhuǎn)化參照分子克隆操作手冊。若無特別說明，大腸桿菌質(zhì)粒抽提、DNA凝膠回收、DNA片段的連接、RNA抽提等均按照相應(yīng)的試劑盒的說明書進行操作。

轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌克隆采用菌液PCR的方法進行鑒定。從平板上挑取單個菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素的LB試管中。菌體長到輕微霧花狀后，取菌液作為模板，利用Easy Taq DNA聚合酶進行菌液PCR驗證。挑選陽性克隆對應(yīng)試管進行質(zhì)粒抽提，并對克隆區(qū)段進行DNA測序鑒定。

1.1.3釀酒酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制作過程如下：

(1)從平板上挑取酵母菌落接種到5mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12h。轉(zhuǎn)50μl培養(yǎng)物到50mL YPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，使菌體濃度到OD₆₀₀＝2左右。

(2)菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，3000×g離心5min，去上清。

(3)使用30mL冰上預(yù)冷的滅菌水重懸細胞，3000×g離心5min離心去上清。

(4)使用20mL冰上預(yù)冷的1M的山梨醇洗滌細胞沉淀，3000×g離心5min，離心去上清。

(5)使用200μl-500μl 1M的山梨醇重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5mL離心管中，即做成酵母感受態(tài)細胞。每次酵母電轉(zhuǎn)化應(yīng)制備新鮮的感受態(tài)細胞以保證足夠的轉(zhuǎn)化率。

酵母轉(zhuǎn)化步驟如下：

(1)取2-5μl質(zhì)?；蛘呔€性化片段，加入到預(yù)冷的1.5mL離心管中。

(2)若使用2mm的電轉(zhuǎn)杯，往離心管中加入40μl的感受態(tài)細胞；若使用1mm的電轉(zhuǎn)杯，加入20μl的感受態(tài)細胞。細胞與DNA在離心管中用槍輕輕吹打混勻后轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，冰上預(yù)冷5min。

(3)將電轉(zhuǎn)化杯外圍的水用吸水紙擦干凈，于750V/mm的電擊強度下進行電擊。

(4)往電擊后的電轉(zhuǎn)杯中加入1mL YPD培養(yǎng)基，輕輕懸浮細胞，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，于30℃培養(yǎng)箱靜置復(fù)蘇2h。

(5)復(fù)蘇后的細胞用滅菌水清洗兩遍，取適量的細胞涂布到相應(yīng)的瓊脂平板。30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天至單菌落出現(xiàn)。

1.2通過易錯PCR獲得β-胡蘿卜素突變基因

首先將經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成的Obkt基因(NCBI號:KP866870)克隆到p416XWP-P_CYC1質(zhì)粒上，然后以p416XWP-P_CYC1-Obkt t為模板，用PCYC1F2(ACACACACTAAATTAATAGAATTCAAC)和ADH1tR2(CAACCTTGATTGGAGACTTGAC)作為引物，使用Taq DNA聚合酶，通過易錯PCR的方法獲取Obkt突變體庫。由于Mn²⁺可以增加PCR過程的堿基錯配率，在利用Taq酶進行易錯PCR時，在體系中加入一定量的MnCl₂以增加PCR過程中的基因突變率。易錯PCR體系為：

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 3min，然后進入溫度循環(huán)，變性，95℃ 30s；退火，54℃30s；延伸72℃，1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min，終止溫度為4℃。

將易錯PCR產(chǎn)物清洗后與線性化的p416XWP-P_CYC1質(zhì)粒(用NotI和SacI進行雙酶切)，通過電轉(zhuǎn)的方法共同轉(zhuǎn)入含有tHMG1、crtE、crtYB、crtI基因的產(chǎn)β-胡蘿卜素的YXWP-77菌株中，涂布在SD-URA缺陷的平板上，培養(yǎng)3天；然后，通過顏色篩選，挑取顏色變紅加深的菌株。用釀酒酵母提取試劑盒提取陽性突變株質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中擴增，測序。

突變體的序列分析結(jié)果如下表1所示

實施例2包含β-胡蘿卜素酮化酶突變體的釀酒酵母表達載體的構(gòu)建及線性化

2.1表達載體構(gòu)建

將實施例1.2中得到的含有陽性突變株的質(zhì)粒用NotI和SacI雙酶切，得到β-胡蘿卜素酮化酶突變基因與同樣NotI和SacI雙酶切后的PUMRI-11質(zhì)粒(NCBI號：KM216413)連接做轉(zhuǎn)化。

雙酶切體系：總體系20μl

基因/質(zhì)粒:17μl

10×buffer:2μl

NotI酶：0.5μl

SacI酶：0.5μl

酶切條件:放置37℃，酶切1.5-2個小時

連接體系:

基因：5.5μl，質(zhì)粒3μl，10×T4DNA ligase buffer 1μl,T4DNA連接酶；0.5μl。

感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化:將10μl的連接產(chǎn)物加入到100μl冰上融化的感受態(tài)細胞中，用移液槍輕輕混勻，冰浴20-40min；42℃熱擊90s，迅速放入冰中，冰浴5min；添加1ml LB培養(yǎng)基，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)50min,1200rpm離心1min中，去上清，剩余200μl混勻涂布在卡那抗性的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過夜得到的陽性克隆用于質(zhì)粒抽提。

2.2重組的表達載體線性化

重組載體含有DPP1同源臂，同源臂處含有SfiI位點，通過SfiI酶切方法線性化。

酶切體系：總體系50μl，質(zhì)粒43.5μl,10×G buffer 5μl,SfiI酶1.5μl。

酶切條件：放置50℃酶切2-3個小時

實施例3將β-胡蘿卜素酮化酶突變株整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母的染色上進一步驗證

實施例2中得到重組線性化的質(zhì)粒按照實施例1.1.3中的方法整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母染色體上，涂布在含有G418抗性的YPD平板上。突變體OBKTM1、OBKTM2、OBKTM3顯示活性提高，促進β-胡蘿卜素向蝦青素的轉(zhuǎn)化。與野生型比較的結(jié)果如圖3所示。

實施例4通過組合突變進一步的提高β-胡蘿卜素酮化酶的活力

將實施例1.2得到三個突變點進行組合突變，得到含有兩個突變點的突變體OBKTM12(H165R/V264D)、OBKTM13(H165R/F298Y)、OBKTM23(V264D/F298Y)以及含有三個點的突變體OBKTM(H165R/V264D/F298Y)，將這幾個突變體根據(jù)實施例2構(gòu)建整合型載體，轉(zhuǎn)到產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母中。組合突變的活力比單點突變高，優(yōu)選的三個點突變體OBKTM活性最高，先比野生型提高了2.5倍，前體β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為海膽烯酮和角黃素，從而β-胡蘿卜素的產(chǎn)量下降了50％，具體結(jié)果如圖3所示。含OBKTM與野生型基因的釀酒酵母菌株各類胡蘿卜素成分液相分析如圖4所示。用于做定點突變的引物以及用于PCR測序的引物GAL10F和ADH1tR2如表2所示

實施例5將ObktM突變體和β-胡蘿卜素羥化酶整合到釀酒酵母中以產(chǎn)蝦青素

以PUMRI-11-ObktM為模板用Obkt-F1(BamHI)(CAGGGATCCATGCACGTTGCTTCTGCT)和Obkt-R(SalI)(GGAAGTCGACTTAAGCCAAAGCTGGAACCA為引物擴增含有BamHI和SalI酶切位點的ObktM基因，并將其用BamHI和SalI雙酶切,然后與同樣用BamHI和SalI雙酶切之后的載體PIMRI-11-OcrtZ連接轉(zhuǎn)化做克隆，操作同實施例2將得到的重組質(zhì)粒pUMRI-11-OcrtZ-ObktM以及之前構(gòu)建的pUMRI-11-OcrtZ-Obkt(Zhou et al.,2015)用SfiI線性化之后各自轉(zhuǎn)到含有β-胡蘿卜素的釀酒酵母中。得到菌株經(jīng)HPLC分析后發(fā)現(xiàn)含有OBKTM突變的蝦青素產(chǎn)量比含有野生型的提高了48％。

實施例6從釀酒酵母細胞提取類胡蘿卜素并通過HPLC分析類胡蘿卜素的產(chǎn)量

將產(chǎn)類胡蘿卜素的釀酒酵母工程菌挑取單菌落至5mlYPD試管中，220rpm 30℃進行過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到50mlYPD培養(yǎng)基中至終OD為0.05。220rpm 30℃培養(yǎng)84小時。類胡蘿卜素的抽提采取熱酸法進行，操作方法如下：

(1)取發(fā)酵后培養(yǎng)物1mL于15mL離心管中，4000×g離心1min去上清。

(2)細胞沉淀用5mL純凈水懸浮，4000×g離心1min去上清。

(3)用1mL 3M鹽酸懸浮細胞，沸水浴中3min進行細胞破碎，然后立即置于冰水浴中冷卻3-5min，離心后去上清。

(4)使用5mL純凈水重懸細胞沉淀，4000×g離心1min倒掉上清以除去其中殘留的鹽酸。

(5)在離心管中加入4mL丙酮，蓋緊離心管，漩渦振蕩使細胞沉淀徹底分散，萃取其中的類胡蘿卜素。

(6)將上述含有提取物的離心管置于超聲清洗儀中超聲10min，徹底提取其中的類胡蘿卜素。

(7)4℃，4000×g離心2min，將上清用0.45μm的有機系針式濾頭進行過濾，濾液可用于總類胡蘿卜素測定和HPLC分析。

在收集菌液用于抽提類胡蘿卜素的同時取2mL菌液到2mL離心管中，12000×g離心1min，去除培養(yǎng)基，加水洗滌一遍，再離心去上清。將帶菌體沉淀的離心管放置于90℃烘箱中處理8h左右以得到干菌體。根據(jù)抽提得到的類胡蘿卜素和菌體的干重計算出類胡蘿卜素的單位干重含量(mg/g DCW)。

使用下列條件，通過HPLC檢測釀酒酵母中類胡蘿卜素組成及含量。液相分析儀器為島津的LC-20AT，色譜柱為Amethyst C18-H反相柱(4.6×150mm,5μm,Sepax Technologies,Inc)。柱溫40℃，檢測波長470nm。采用梯度洗脫，流動相為A泵為乙腈和水(90:10)，B泵為甲醇和異丙醇(60:40),流速為1mL/min，洗脫條件如下：0-15min，B泵流動相從0升到90％；15-30min保持B泵的流動相90％；30-35min B泵流動相從90％降到0。以下是各種類胡蘿卜素保留時間：蝦青素,7.6min；角黃素,11.5min；海膽烯酮,17.6min；β-胡蘿卜素,24.5min。