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基因飽和突變庫及其構(gòu)建方法、應用與流程

文檔序號:12411780閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種基因飽和突變庫的構(gòu)建方法,其特征在于,以含有表達目的蛋白的基因的環(huán)狀雙螺旋DNA質(zhì)粒為模板,采用一對序列完全反向互補的正向突變引物和反向突變引物,通過聚合酶鏈式反應構(gòu)建獲得基因飽和突變庫;

所述正向突變引物和所述反向突變引物的序列中分別含有9個以上連續(xù)排列的兼并堿基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述含有表達目的蛋白的基因的環(huán)狀雙螺旋質(zhì)粒的長度不小于8kb。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述聚合酶鏈式反應的循環(huán)數(shù)不高于18。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的構(gòu)建方法,其特征在于,獲得所述基因飽和突變庫后還包括經(jīng)DpnI酶消化除去模板后,直接轉(zhuǎn)化到宿主菌進行培養(yǎng)基平板篩選的步驟。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述正向突變引物由三部分序列組成:5’-模板序列、兼并堿基序列和3’-模板序列,其中所述兼并堿基序列是以兼并堿基代替了目的基因中待突變的序列,5’-模板序列是目的基因中待突變序列5’端上游的序列,3’-模板序列是目的基因中待突變序列3’端下游的序列;

所述反向突變引物的序列為所述正向突變引物的反向互補序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的Tm值相差不高于5℃,所述5’-模板序列和所述3’-模板序列的長度均不低于所述兼并堿基序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述正向突變引物和所述反向突變引物的序列如SEQ ID No.7~SEQ ID No.112所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述聚合酶鏈式反應的體系為:所述環(huán)狀雙螺旋DNA質(zhì)粒20~100ng、所述正向突變引物100~200nM、所述反向突變引物100~200nM、Q5高保真聚合酶1U、1×Q5反應緩沖液。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的構(gòu)建方法,其特征在于,所述聚合酶鏈式反應的條件為:98℃預變性1~2.5min、以如下條件進行10~18個循環(huán):98℃0.5~1min、退火0.5~2min、72℃延伸15s/kb,最后以72℃再進行2~5min延伸。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的構(gòu)建方法獲得的基因飽和突變庫。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因飽和突變庫在蛋白質(zhì)功能位點的快速篩選定位和/或高效突變改造中的應用。

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