本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法。

背景技術(shù)：

黑蒜又名黑大蒜，發(fā)酵黑蒜，是用新鮮的生蒜，帶皮放在發(fā)酵容器內(nèi)發(fā)酵制成的食品。與生蒜相比黑蒜的營養(yǎng)保健功能和藥用價值有了較大的提高，比如在抗氧化性、防癌抗癌、殺菌消炎、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖水平、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫功能、治療高血壓和心腦血管疾病等方面。近幾年來關(guān)于黑蒜藥用價值的研究較多，尤其是黑蒜的防癌、抗癌功能更加受到科研工作者的重視。研究表明黑蒜水提液對肝癌腫瘤有明顯的抑制生長作用，抑瘤有效率可大于 40%；采用黑蒜水提液聯(lián)合放射治療肝癌，降低了腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，提高了患者的生存質(zhì)量；黑蒜提取液聯(lián)合放療可明顯抑制荷H22小鼠移植瘤的生長，其作用機(jī)制可能與其下調(diào)抗凋亡 Bcl－2蛋白及上調(diào)促凋亡Bax蛋白的表達(dá)和提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

蒜氨酸（Alliin），化學(xué)名S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（S-Allyl-L-(+)-Cysteine Sulfoxid，SACS），是大蒜中主要生物活性物質(zhì)之一，作為大蒜中獨特的非蛋白類含硫氨基酸，占大蒜干重的0.6%-2%。在水中極易溶解，不溶于純無水乙醇、氯仿、丙酮、乙醚和苯，以稀丙酮和乙醇結(jié)晶可得到白色針簇狀結(jié)晶。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明：蒜氨酸具有抗腫瘤、協(xié)同降血壓、抗菌殺毒、清除自由基、保肝護(hù)肝及抗糖尿病等多種藥理功效。蒜氨酸無氣味，未受損大蒜里面含量最豐富的有機(jī)硫化物。

目前，針對鮮蒜中蒜氨酸的提取工藝已有眾多研究。例如中國專利申請03100420公開了一種從鮮蒜中提取蒜氨酸生產(chǎn)工藝，按以下步驟進(jìn)行：第一步進(jìn)行預(yù)處理：將蒜瓣進(jìn)行微波殺酶處理；第二步進(jìn)行有機(jī)物提?。簩⑺獍昴コ伤鉂{，并加入乙醇或酒精，分離得到提取液，并減壓濃縮提取液；第三步用陽離子交換樹脂吸附濃縮提取液中的蒜氨酸；第四步用氨水解析蒜氨酸；第五步得到結(jié)晶的蒜氨酸。中國專利申請201110139510公開了從大蒜中提取蒜氨酸的方法，其特征是包括如下步驟：(1)原料處理：將去皮鮮蒜滅酶，絞碎；(2)與水混合，浸提，過濾得濾液；(3)調(diào)pH值，保溫，分離得上清液；(4)使pH值為7，保溫分離得上清液，調(diào)節(jié)pH值；(5)將上清液采用離子交換樹脂柱進(jìn)行吸附；用氨水解析，收集解析液；(6)調(diào)節(jié)解析液的pH，過孔徑為150Da 的納濾膜，得到濾液；(7)將濾液濃縮干燥得到蒜氨酸。中國專利申請201210322853公開了一種一種脈沖超聲輔助提取大蒜中蒜氨酸的方法，按照下述步驟進(jìn)行：將鮮大蒜去皮、清洗后加入蒸餾水，采用水浴加熱法對大蒜中的蒜氨酸酶進(jìn)行滅活，再進(jìn)行打漿破碎，漿液在一定條件下進(jìn)行脈沖超聲波處理，超聲過的溶液經(jīng)過離心得到上清液，再經(jīng)超濾處理除去多糖、蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，收集濾液，冷凍干燥得到產(chǎn)品，測定產(chǎn)品的蒜氨酸含量并計算得率。

然而目前并沒有從黑蒜中提取蒜氨酸的相關(guān)方法。鮮蒜中的蒜氨酸酶會將蒜氨酸轉(zhuǎn)化成蒜辣素，因此從鮮蒜中提取蒜氨酸通常需要滅活蒜氨酸酶的步驟，通常采用微波或加熱等方式，該步的加入使得蒜氨酸的提取工藝相對更為復(fù)雜，耗時更長，且如果蒜氨酸酶滅活不充分，在提取過程中會造成蒜氨酸的損失。此外鮮蒜中含有大量多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在蒜氨酸提取過程中若處理不夠徹底，將會造成制成品純度相對較低的問題。

研究表明在黑蒜的生產(chǎn)過程中，蒜氨酸酶幾乎完全被滅活，在制得的黑蒜成品中檢測不到蒜氨酸酶的活性；且蛋白質(zhì)和多糖等生物大分子被大量降解，因此從黑蒜中提取蒜氨酸將會比從鮮蒜中提取更加容易便捷。目前，仍未有從黑蒜中提取蒜氨酸的相關(guān)工藝，本發(fā)明將填補(bǔ)該領(lǐng)域的技術(shù)空缺。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法，以期更加高效地利用黑蒜資源。

一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）、原料處理：將黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-10～-2℃冷凍2～6小時后，再于20～50℃下放置1～3小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）2～4次，得到原料B；

（4）、浸提：按照1:1～5:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于2000～5000rpm下離心后收集上清液；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，采用陽離子交換樹脂吸附其中的蒜氨酸，用氨水解析，收集解析液；

（6）、調(diào)節(jié)解析液的pH，過濾，得到濾液，將濾液濃縮干燥得到蒜氨酸。

所述的提取方法步驟（2）中冷凍的溫度優(yōu)選為-8～-4℃；進(jìn)一步優(yōu)選為-7～-5℃；更進(jìn)一步優(yōu)選為-6℃。

所述的提取方法步驟（2）中冷凍的時間優(yōu)選為3～5小時；進(jìn)一步優(yōu)選為3.5～4.5小時；更進(jìn)一步優(yōu)選為4小時。

所述的提取方法步驟（2）中冷凍后放置的溫度優(yōu)選為25～45℃；進(jìn)一步優(yōu)選為30～42℃；更進(jìn)一步優(yōu)選為40℃。

所述的提取方法步驟（2）中冷凍后放置的時間優(yōu)選為1.5～2.5小時；進(jìn)一步優(yōu)選為2小時。

所述的提取方法步驟（4）中的浸提液為體積濃度為5～15%的乙醇水溶液；優(yōu)選為7～13%的乙醇水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選為8～11%的乙醇水溶液；更進(jìn)一步優(yōu)選為9%的乙醇水溶液；所述的浸提液中還含有質(zhì)量體積濃度為0.5～2.0%的氯化鈉。

所述的提取方法步驟（4）中的液料比指體積質(zhì)量比，優(yōu)選為1.5：1～4.5：1；進(jìn)一步優(yōu)選為2:1～4:1；更進(jìn)一步優(yōu)選為3:1。

所述的提取方法步驟（5）中采用的陽離子交換樹脂包括但不限于732型陽離子交換樹脂、D001×7型陽離子交換樹脂或D61型陽離子交換樹脂；優(yōu)選為D001×7型陽離子交換樹脂。

如無特別說明，本發(fā)明中采用的水均為純凈水。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的從黑蒜中提取蒜氨酸的方法的有益效果為：

（1）本發(fā)明填補(bǔ)了從黑蒜中提取蒜氨酸的技術(shù)空缺。

（2）黑蒜中的蒜氨酸酶幾乎完全被滅活，從其中提取蒜氨酸，和從鮮蒜中提取蒜氨酸相比，不需要滅活蒜氨酸酶的步驟，也避免了由于酶滅活不完全造成蒜氨酸損失的情況，使得蒜氨酸的提取更加簡便高效。

（3）現(xiàn)有技術(shù)通常從鮮蒜中提取蒜氨酸，由于鮮蒜中含有大量多糖蛋白質(zhì)等大分子化合物，通常采用醇沉或超濾等方式分離蒜氨酸。醇沉法不能完全除去多糖；醇沉周期長，不但需要將提取液濃縮并降溫到一定程度，而且所需的時間過長，一般需要至少8h，且需要多次醇沉；乙醇消耗量大，每次醇沉都需要大量的乙醇，且醇沉次數(shù)增多，乙醇用量也增大；排渣困難，一般需要加入熱水使沉淀融化才可以將渣排出，不但浪費(fèi)，而且操作麻煩。超濾法需要加壓，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中難以實現(xiàn)，且得到的濃度一般只有10%～ 50%，無法滿足蒜氨酸工業(yè)制品的純度要求。此外還有也相色譜等方法分離蒜氨酸，但由于對設(shè)備要求高、成本高等原因，均不適用于大規(guī)模生產(chǎn)要求。

本發(fā)明從黑蒜中提取蒜氨酸，黑蒜在制備過程中，鮮蒜中多糖以及蛋白質(zhì)等生物大分子幾乎完全降解，因此不需要分離多糖和蛋白這一步驟，采用簡單的柱吸附方式即可獲得高純度的蒜氨酸。

（4）在常規(guī)鮮蒜中提取蒜氨酸通常需要浸提3-10小時，2-3次以達(dá)到盡可能完全浸提出蒜氨酸的目的。本發(fā)明的預(yù)處理步驟中，采用多次高低溫交替處理，大大縮短了蒜氨酸的浸提時間，加入浸提液后直接打漿過濾即可。

（5）本發(fā)明提供的提取方法中采用的浸提液能夠使得蒜氨酸高效的釋放出來，不需要長時間浸泡或反復(fù)浸提。

（6）本發(fā)明提供的方法得到的蒜氨酸純度比現(xiàn)有技術(shù)更高，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量大于 97.5％。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法簡單、高效、快捷，能夠便捷高效地獲取蒜氨酸，成本低廉，對設(shè)備要求低，填補(bǔ)了黑蒜中提取蒜氨酸的技術(shù)空缺。

具體實施方式

以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。

除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

實施例1一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-10℃冷凍2小時后，再于50℃下放置1小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）2次，得到原料B；

（4）浸提：按照1:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于2000rpm下離心20min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為15%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為2.0%的氯化鈉；

（5）吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為1.8后，用732型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為1.2BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以1.2BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為97.9%。

實施例2一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-2℃冷凍6小時后，再于20℃下放置3小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）4次，得到原料B；

（4）浸提：按照5:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于5000rpm下離心10min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為5%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為0.5%的氯化鈉；

（5）吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5后，用D61型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為1.8BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以1.8BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為97.5%。

實施例3一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-8℃冷凍3小時后，再于25℃下放置2.5小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）3次，得到原料B；

（4）、浸提：按照1.5：1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于3000rpm下離心18min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為7%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為0.8%的氯化鈉；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5后，用D001×7型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為2.0BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以2.0BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）、采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為97.6%。

實施例4一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-4℃冷凍5小時后，再于45℃下放置1.5小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）2次，得到原料B；

（4）、浸提：按照4.5:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于4000rpm下離心15min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為13%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為1.8%的氯化鈉；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5后，用D001×7型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為2.0BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以2.0BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）、采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為98.2%。

實施例5一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-7℃冷凍3.5小時后，再于30℃下放置1.5小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）3次，得到原料B；

（4）、浸提：按照2:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于5000rpm下離心10min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為11%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為1.5%的氯化鈉；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5后，用D001×7型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為2.0BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以2.0BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）、采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為98.7%。

實施例6一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-5℃冷凍4.5小時后，再于42℃下放置1.5小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）4次，得到原料B；

（4）浸提：按照4:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于4000rpm下離心12min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為8%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為0.8%的氯化鈉；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0后，用D001×7型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為2.0BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以2.0BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）、采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為98.5%。

實施例7一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

（1）、原料處理：將100g黑蒜絞碎，得到原料A；

（2）、高低溫交替處理：將原料A在-6℃冷凍4小時后，再于40℃下放置2小時；

（3）、重復(fù)步驟（2）3次，得到原料B；

（4）、浸提：按照3:1的液料比向原料B中加入浸提液后，打漿、過濾，將濾液于5000rpm下離心10min后收集上清液；其中浸提液為體積濃度為9%的乙醇水溶液，其中還含有質(zhì)量體積濃度為1.4%的氯化鈉；

（5）、吸附分離：將步驟（4）得到的上清液減壓濃縮后，使用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5.0后，用D001×7型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，流速為1.6BV/h；吸附完成后用純凈水進(jìn)行洗滌后，采用1M的氨水以1.6BV/h的流速進(jìn)行解析，收集解析液；

（6）、采用HCl溶液調(diào)節(jié)解析液的pH值為6.0，在壓力為0.5MPa，30℃下將解析液過孔徑為150Da的納濾膜，得到濾液，將濾液減壓干燥既得蒜氨酸，經(jīng)檢測，蒜氨酸的質(zhì)量含量為99.6%。

對比例1一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

基本同實施例7，與實施例7的差別為：去掉步驟（2）和（3）。

經(jīng)檢測料渣中仍殘存24.6%的蒜氨酸，最終制得品蒜氨酸的質(zhì)量含量為89.3%。

對比例2一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

基本同實施例7，與實施例7的差別為：去掉步驟（2）和（3），且將步驟（4）中浸提液換成9%的乙醇水溶液。

經(jīng)檢測料渣中仍殘存13.1%的蒜氨酸，最終制得品蒜氨酸的質(zhì)量含量為91.5%。

對比例3一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

基本同實施例7，與實施例7的差別為：去掉步驟（2）和（3），且將步驟（4）中浸提液換成純凈水。

經(jīng)檢測料渣中仍殘存15.9%的蒜氨酸，最終制得品蒜氨酸的質(zhì)量含量為92.8%。

對比例4一種從黑蒜中提取蒜氨酸的方法

基本同實施例7，與實施例7的差別為：去掉步驟（3）。

經(jīng)檢測料渣中仍殘存10.8%的蒜氨酸，最終制得品蒜氨酸的質(zhì)量含量為94.1%。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。