本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種對腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測引物。
背景技術(shù)：
：腫瘤循環(huán)DNA(ctDNA)是人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的、并具有某些特征(包括點突變、甲基化修飾異常、染色體的缺失、插入、重排和拷貝數(shù)異常等)的來源于腫瘤細(xì)胞基因組的DNA片段，屬于游離核酸的一種，其主要來源包括：1、凋亡的腫瘤細(xì)胞；2、壞死的腫瘤細(xì)胞；3、循環(huán)腫瘤細(xì)胞；4、腫瘤細(xì)胞分泌的外排體。其含量約占整個循環(huán)DNA的0.01～1％，對血液中的腫瘤循環(huán)DNA進(jìn)行檢測，可作為腫瘤的早期診斷的生物標(biāo)志物和預(yù)后評估指標(biāo)，對腫瘤的普查、篩查和風(fēng)險評估、早期診斷、分期分型及治療監(jiān)測都具有重要意義。腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本包括腫瘤細(xì)胞和或癌細(xì)胞死亡或者凋亡后釋放到外周血循環(huán)中的腫瘤循環(huán)DNA，所述待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本來源于人類正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、血清游離DNA、血漿游離DNA、體液游離DNA或者排泄物細(xì)胞DNA和游離DNA。DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個重要因素，這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態(tài)。由于CpG島的局部高度甲基化要早于細(xì)胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預(yù)測，而全基因組水平的低水平甲基化狀態(tài)，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進(jìn)一步降低，使其可用于腫瘤的診斷以及分級。甲基化可作為腫瘤等早期診斷的生物標(biāo)記物和預(yù)后評估指標(biāo)，對腫瘤的篩查和風(fēng)險評估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測都具有重要的意義。Septin基因家族至少由13個基因組成，它們編碼保守的GTPase結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與腫瘤發(fā)生相關(guān)。Septin基因家族蛋白質(zhì)的主要功能是胞質(zhì)分裂、膜泡運輸、膜融合、胞外分泌、細(xì)胞凋亡。Septin9基因通過選擇性剪接有5種不同的轉(zhuǎn)錄本，其蛋白質(zhì)涉及到許多細(xì)胞過程，Septin9行為異常將引起細(xì)胞不完整分裂。已有研究表明Septin9基因的第二種轉(zhuǎn)錄本啟動子的甲基化和大腸癌的發(fā)生有關(guān)。由此可見，檢測mSEPT9基因甲基化異常修飾可作為大腸癌早期診斷的一個生物標(biāo)志物。目前，傳統(tǒng)的甲基化檢測方法包括：直接測序法(亞硫酸氫鹽測序法)，專利申請CN104046686A采用此方法，原理是：重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴(kuò)增后，尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。但此方法實驗過程長，需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣，實驗檢測的費用高。甲基化特異性PCR法，用重亞硫酸鹽使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，進(jìn)行引物設(shè)計(每個基因設(shè)計兩對引物，分別為：甲基化引物M、非基因化引物U，對應(yīng)擴(kuò)增甲基化和非甲基化的目的片段)，有時需設(shè)計巢式引物；PCR擴(kuò)增：對甲基化和非甲基化的目的片段分別進(jìn)行擴(kuò)增，此時應(yīng)盡可能使用梯度PCR儀，同時使用不同的退火溫度，以篩選到合適的退火溫度；對PCR產(chǎn)物電泳。該方法檢測時間相對較長，不能及時獲得檢測結(jié)果。甲基熒光法是基于Taqman熒光實時定量技術(shù)的甲基化檢測技術(shù)。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設(shè)計一個能與待測位點區(qū)互補(bǔ)的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后一般采用MSP引物進(jìn)行實時定量PCR。Methylight法最大的優(yōu)勢在于其高通量和高敏感性，且無需在PCR后再進(jìn)行電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。但該方法多為單重PCR檢測，沒有內(nèi)參基因的擴(kuò)增，不能確保模板DNA的硫化修飾質(zhì)量。專利申請CN103732759A提到可以使用甲基化特異性PCR法和甲基熒光法，但是其通過測量Septin9、甲基化RASSF2A和HB14基因的三重測定方法測定Septin9和甲基化RASSF2A的水平?？梢砸詥沃?、二重、三重、四重或多重(multiplex)方式進(jìn)行類似的測定。其方法既操作繁瑣也沒有顯示具體可行的實驗結(jié)果，限制了其在臨床實驗室的廣泛應(yīng)用。甲基化敏感性解鏈曲線分析法是將PCR擴(kuò)增和溶解曲線分析結(jié)合在一起，由于目的片段的微小序列差異引起PCR溶解溫度的改變，從而可以對基因突變、基因分型、基因甲基化等進(jìn)行檢測。國內(nèi)專利申請CN104164516A即采用此方法。但該方法需要不同甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)品，實驗結(jié)果讀取復(fù)雜繁瑣。并且該方法用的熒光染料為飽和熒光染料，結(jié)果只能檢測一個熒光信號通道，不能同時分析樣本內(nèi)參基因的擴(kuò)增情況，不能推斷硫化修飾的效果，容易出現(xiàn)重亞硫酸鹽處理不完全的問題以及假陰性。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE法)。這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對甲基化區(qū)的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進(jìn)行分析。缺點是：1.由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；2.只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點的甲基化狀態(tài)時,該檢測方法的結(jié)果才有意義；3.相對而言，Southern方法較復(fù)雜，且需要樣本的量大；4.存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；5.不適用于混合樣本?？傊?，目前腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測技術(shù)由于提取游離核酸的回收率不高，區(qū)分基因位點CpG島甲基化修飾技術(shù)的局限性和后續(xù)熒光定量PCR檢測ctDNA標(biāo)本低濃度(50pg以下)低純度、高背景的非靶點DNA(100倍)等原因，導(dǎo)致目前檢測靈敏度50％左右，特異性75％左右并且檢測重復(fù)性不高。而甲基化程度的檢測結(jié)果并不能直接診斷結(jié)直腸癌或大腸癌，必須結(jié)合有效的對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷分析的方法才能對結(jié)直腸癌或大腸癌進(jìn)行有效診斷。開發(fā)出特異性和靈敏地擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域含甲基化DNA片段的方法是進(jìn)行后續(xù)癌癥早期診斷的前提之一。要特異性和靈敏地擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域含甲基化DNA片段，對于開發(fā)能夠特異性和靈敏地擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域含甲基化DNA片段的引物是關(guān)鍵之一。目前，盡管對于Septin基因的序列已經(jīng)知道，但是如何找到影響基因轉(zhuǎn)錄的CpG甲基化位點并設(shè)計出能夠特異性識別該位點且能夠有效應(yīng)用于相應(yīng)的檢測方法的引物仍然是本領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的難題。在甲基化特異性PCR檢測中，一個重要的環(huán)節(jié)是阻斷片段的選擇，阻斷片段在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的退火階段發(fā)揮作用，其能夠阻斷未甲基化修飾DNA序列擴(kuò)增，目前的阻斷片段的選擇通?；诮?jīng)驗，但是本發(fā)明人基于特殊算法設(shè)計開發(fā)出的阻斷片段能有效保證特定甲基化修飾DNA序列的擴(kuò)增，阻斷其他多種可能的未甲基化或者不完全甲基化修飾DNA序列的擴(kuò)增，從而完成本發(fā)明可有效區(qū)分檢測靶點與非靶點序列。本申請的發(fā)明人針對特定的CpG甲基化位點開發(fā)了特異性引物和簡單有效的PCR檢測方法，同時，精確調(diào)整PCR反應(yīng)體系中的引物和探針的用量，合理選擇能夠有效阻礙非靶點序列的擴(kuò)增反應(yīng)的阻斷片段，以及能夠非常靈敏且特異的檢出靶點序列的探針可以進(jìn)一步增加檢測的靈敏度和特異性，確保能夠在100倍以上的背景非靶點中檢出濃度低于50pg/反應(yīng)靶點序列，例如本發(fā)明實施例中所用的陽性質(zhì)控品PC即為此類標(biāo)本，其甲基化修飾異常DNA含量小于1％，背景DNA即未發(fā)生甲基化修飾異常的DNA含量大于99％，相對靈敏度高于100：1。目前，尚未報道能夠在100倍以上的背景非靶點中檢出濃度低于50pg/反應(yīng)靶點序列的靈敏度的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測的引物，其能夠特異性擴(kuò)增甲基化的mSEPT9基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種腫瘤循環(huán)DNA檢測的探針，其能夠特異性檢測擴(kuò)增出的mSEPT9基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種腫瘤循環(huán)DNA檢測的阻斷片段，其能夠有效降低在腫瘤循環(huán)DNA的PCR檢測中的非特異性信號，從而大大提高靈敏度。本發(fā)明的另一個目的是提供一種腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測的試劑盒，其包括靶基因的引物、探針和阻斷片段，所述的靶基因為mSEPT9。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點是：1、靈敏度高，本方法的絕對靈敏度50pg即可檢出10-15個基因組拷貝數(shù)，相對靈敏度高于100:1，即可在100個非靶點序列中，有效擴(kuò)增1個靶點序列。2、特異性強(qiáng)。3、重復(fù)性好，每個檢測批次間的精密度CV≤5％。4、操作簡單，安全，這個反應(yīng)體系無任何有毒有害物質(zhì)，無需開管檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對實驗操作人員及環(huán)境都無危害。本發(fā)明的一個目的是提供一種腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測方法，其檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)。所述方法包括：將待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本、內(nèi)參基因、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，其中PCR反應(yīng)中DNA標(biāo)本是經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理的、轉(zhuǎn)化后的DNA標(biāo)本，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括3`端進(jìn)行了去羥基化修飾的阻斷片段，根據(jù)PCR的結(jié)果測量所述待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本、所述陽性質(zhì)控品和所述陰性質(zhì)控品的Ct值或者CP值。本發(fā)明的另一個目的是提供一種大腸癌或結(jié)腸癌的診斷方法，所述診斷方法可以根據(jù)對腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測的結(jié)果對大腸癌或結(jié)腸癌進(jìn)行有效診斷。本發(fā)明的一個目的是提供用于確定Septin9的基因或基因組序列的表達(dá)水平的引物在制備用于檢測和/或分類個體中癌癥的方法的試劑盒中的用途。優(yōu)選地，mSEPT9基因的正向引物mS9-F、反向引物mS9-R序列如下：名稱序列mS9-FcctctacatacgccgaatmS9-Rtttttttttcggacgtcg優(yōu)選地，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括阻斷片段和內(nèi)參基因的引物、探針。所述的內(nèi)參基因為ACTB(Beta-actin)。優(yōu)選地，內(nèi)參基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探針ACTB-P的序列如下：名稱序列ACTB-FgaggaggtttagtaagttACTB-RccaataaaacctactcctACTB-Pacccaacacacaataaca優(yōu)選地，所述的阻斷片段為寡核苷酸鏈，更優(yōu)選地，所述的阻斷片段的3`端修飾為：磷酸化處理、脫羥基化處理或者間臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer中的一種或者多種。最優(yōu)選地，所述阻斷片段的序列為C3Spacer修飾。優(yōu)選地，所述的靶基因和內(nèi)參基因的探針的5`端報告熒光基團(tuán)為FAM、JOE、TAMRA、HEX、TexasRed、Cy3、Cy5中的一種或者多種，所述靶基因和內(nèi)參基因的探針的3`端猝滅基團(tuán)為BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一種或者多種。優(yōu)選地，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。更優(yōu)選地，所述的陽性質(zhì)控品為甲基化人類基因組DNA，所述陰性質(zhì)控品為未甲基化人類基因組DNA。優(yōu)選地，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括：1-10×PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、鎂離子溶液和無核酸酶純凈水。更優(yōu)選地，所述的1-10×PCR反應(yīng)緩沖液包含Tris-HCL和氯化鉀。所述的待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本為人類基因組DNA，包括腫瘤細(xì)胞和或癌細(xì)胞死亡或者凋亡后釋放到外周血循環(huán)中的腫瘤循環(huán)DNA，所述待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本來源于人類正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、血清游離DNA、血漿游離DNA、體液游離DNA或者排泄物細(xì)胞DNA和游離DNA。所述引物序列含有部分CpG甲基化修飾異常位點，探針序列含有部分CpG甲基化修飾異常位點，阻斷片段序列不含有CpG甲基化修飾異常位點。優(yōu)選地，所述的所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為：1-10×PCR反應(yīng)緩沖液(無Mg2+)、0.1-2mMdNTPs、0.1-2uM靶基因引物序列、0.1-2uM內(nèi)參基因引物序列、0.2-4uM阻斷片段、0.025-35ng/ul模板DNA、0.1-2uMm靶基因TaqMan水解探針、0.1-2uM內(nèi)參基因TaqMan水解探針、0.02-0.2U/ulDNA聚合酶、0.5-5mM鎂離子。優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)擴(kuò)增的具體過程為：93-95℃活化15-25分鐘，擴(kuò)展階段，92-94℃變性15-35秒，60-65℃退火2-10秒，52-58℃延伸20-40秒(收集信號)，并進(jìn)行30-55個循環(huán)，94-95℃變性30-60秒，35-45℃降溫25-35秒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益結(jié)果是：本發(fā)明的對腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測的方法具靈敏度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單、安全等優(yōu)點，檢測結(jié)果具有較高的精密度和重復(fù)性。附圖說明圖1是mSEPT9基因(紅色)及內(nèi)參基因ACTB(綠色)的擴(kuò)增曲線。圖2是本發(fā)明涉及到的探針與診斷片段(P-B)工作系統(tǒng)，對靶序列(甲基化異常、M)進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增，而阻斷非靶序列(無甲基化異常、U)的PCR擴(kuò)增。圖3是阻斷片段在靶序列(甲基化異常、M)與非靶序列(無甲基化異常、U)中的作用。具體實施方式1、一種PCR檢測引物，其特征在于，所述引物序列為2、一種PCR檢測探針，其特征在于，所述探針序列為3、一種PCR檢測阻斷片段mS9-B，其特征在于，阻斷片段mS9-B序列為4、一種腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，其包括實施方案1的引物。5、如實施方案4所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括靶基因的探針，優(yōu)選地所述探針是權(quán)利要求2的探針。6、如實施方案4或5所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括阻斷片段，優(yōu)選地，所述阻斷片段是權(quán)利要求3的阻斷片段。7、如實施方案4-6所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括內(nèi)參基因的引物、探針，優(yōu)選所述的內(nèi)參基因為ACTB(Beta-actin)，更優(yōu)選內(nèi)參基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探針ACTB-P的序列如下：8、如實施方案4-7所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的阻斷片段為寡核苷酸鏈，優(yōu)選所述的阻斷片段存在3`端修飾，更優(yōu)選所述3`端修飾為：磷酸化處理、脫羥基化處理或者間臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。9、如實施方案4-8所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的靶基因和內(nèi)參基因的探針的5`端報告熒光基團(tuán)為FAM、JOE、TAMRA、HEX、TexasRed、Cy3、Cy5中的一種或者多種，所述靶基因和內(nèi)參基因的探針的3`端猝滅基團(tuán)為BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一種或者多種。10、如實施方案4-9任一項所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，優(yōu)選所述的陽性質(zhì)控品為甲基化人類基因組DNA，所述陰性質(zhì)控品為未甲基化人類基因組DNA。11、一種腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測方法，其特征在于，所述方法包括(1)對待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾處理；(2)將處理后的待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本、靶基因引物、靶基因探針、內(nèi)參基因、內(nèi)參基因引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；(3)測量所述待測腫瘤循環(huán)(ct-DNA)標(biāo)本、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的Ct值或者CP值。12、如實施方案11所述方法，其特征在于，所述方法使用實施方案1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)展反應(yīng)。13、如實施方案11或12所述方法，其特征在于，所述方法還包括實施方案2的探針和/或?qū)嵤┓桨?的阻斷片段。14、如實施方案11-13所述方法，其特征在于，所述方法還包括內(nèi)參基因的引物、探針，優(yōu)選所述的內(nèi)參基因為ACTB(Beta-actin)，更優(yōu)選內(nèi)參基因ACTB的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R、探針ACTB-P的序列如下：15、如實施方案11-14所述方法，其特征在于，所述的阻斷片段為寡核苷酸鏈，優(yōu)選所述的阻斷片段存在3`端修飾，更優(yōu)選所述3`端修飾為：磷酸化處理、脫羥基化處理或者間臂：C3Spacer、C6Spacer、C12Spacer。16、如實施方案11-15所述方法，其特征在于，所述的靶基因和內(nèi)參基因的探針的5`端報告熒光基團(tuán)為FAM、JOE、TAMRA、HEX、TexasRed、Cy3、Cy5中的一種或者多種，所述靶基因和內(nèi)參基因的探針的3`端猝滅基團(tuán)為BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL中的一種或者多種。17、如實施方案11-16所述方法，其特征在于，所述的腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測試劑盒還包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，優(yōu)選所述的陽性質(zhì)控品為甲基化人類基因組DNA，所述陰性質(zhì)控品為未甲基化人類基因組DNA。18、如實施方案11-17所述方法，其特征在于，所述方法還包括PCR結(jié)果的判讀步驟：優(yōu)選地，單個PCR反應(yīng)按照下表進(jìn)行判讀：PCR結(jié)果mSEPT9Ct值A(chǔ)CTBCt值+Ct值≤45Ct值≤32.5-無擴(kuò)增信號Ct值≤32.5無效任何結(jié)果Ct值≥32.519、如實施方案11-18所述方法，其特征在于，所述方法還包括判讀標(biāo)本中是否存在甲基化DNA的步驟，優(yōu)選地，所述步驟為根據(jù)待測標(biāo)本三次PCR結(jié)果按照下表進(jìn)行判定：20、實施方案1的引物或?qū)嵤┓桨?的探針或?qū)嵤┓桨?的阻斷片段在制備用于檢測和/或分類個體中癌癥的試劑盒中的用途。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測引物的設(shè)計靶基因的引物和探針針對所述mSEPT9基因的位點為啟動子區(qū)的CpG島，定位于17q25染色體，序列為77281410-77500596區(qū)mS9-F5`CCTCTACATACGCCGAAT3`引物長度為18nt，GC％為50％，理論Tm值為50.3℃；mS9-R5`TTTTTTTTTCGGACGTCG3`引物長度為18nt，GC％為38.88，理論Tm值為48.9℃。實施例2腫瘤循環(huán)DNA甲基化檢測引物靈敏度測試1、材料與試劑(1)靶基因的引物、探針和阻斷片段，內(nèi)參基因的引物、探針和阻斷片段，其中所述的靶基因為mSEPT9，mSEPT9的正向引物mS9-F、反向引物mS9-R、探針mS9-P、阻斷片段mS9-B的序列以及所述的內(nèi)參基因為ACTB(Beta-actin)的正向引物ACTB-F、反向引物ACTB-R和探針ACTB-P的序列如下表1所示：表1(2)進(jìn)行熒光定量PCR所需的一般試劑：TaqDNA聚合酶(Roche)、10×PCR反應(yīng)緩沖液(無Mg2+)(Roche)、100mMdNTPs(Roche)、Mg2+(Sigma)無核酸酶純凈水，所述PCR反應(yīng)緩沖液(無Mg2+)包含Tris-HCL和氯化鉀。所述100mMdNTPs中包括25mMdATP、25mMdUTP、25mMdCTP、25mMdGTP。(3)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，所述的陽性質(zhì)控品為甲基化人類基因組DNA，其甲基化修飾異常DNA含量小于1％，背景DNA即未發(fā)生甲基化修飾異常的DNA含量大于99％，相對靈敏度高于100：1，所述陰性質(zhì)控品為未甲基化人類基因組DNA，未甲基化人類基因組DNA和甲基化人類基因組DNA均購自NEB。每個PCR反應(yīng)含有甲基化人類基因組DNA45pg，每個PCR反應(yīng)含有未甲基化人類基因組DNA750pg。2、儀器：AB7500/7500Fast/7500FastDx、NanoDrop2000、離心機(jī)、渦旋儀、量程可調(diào)100ul、1000ul移液器、100ul8道移液器、超凈工作臺和冰箱。3、檢測方法：(1)待測腫瘤循環(huán)DNA(ct-DNA)標(biāo)本為EDTA抗凝的血漿標(biāo)本，通過富集與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理。(2)將陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和步驟(1)中處理得到的待測腫瘤循環(huán)DNA標(biāo)本分別作為模板DNA，一式三份配制PCR反應(yīng)體系。(3)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中(a)陰性質(zhì)控品中mSEPT9無擴(kuò)增信號，內(nèi)參基因ACTB有擴(kuò)增信號，擴(kuò)增曲線呈S型，內(nèi)參基因ACTB的Ct值應(yīng)≤35；陽性質(zhì)控品中靶基因mSEPT9基因與內(nèi)參基因ACTB均有擴(kuò)增信號，擴(kuò)增曲線呈S型，靶基因mSEPT9基因Ct值應(yīng)≤40并且內(nèi)參基因ACTB的Ct值應(yīng)≤30；質(zhì)控品檢測符合標(biāo)準(zhǔn)后，證明實驗結(jié)果有效，可對待測標(biāo)本的實驗結(jié)果進(jìn)行分析與判讀。(b)待測標(biāo)本實驗結(jié)果分析與判讀：待測標(biāo)本的內(nèi)參基因ACTB有擴(kuò)增信號，且擴(kuò)增曲線呈S型，單個PCR反應(yīng)按照下表2進(jìn)行判讀：表2PCR結(jié)果mSEPT9Ct值A(chǔ)CTBCt值+Ct值≤45Ct值≤32.5-無擴(kuò)增信號Ct值≤32.5無效任何結(jié)果Ct值≥32.54、判斷方法根據(jù)待測標(biāo)本三次PCR結(jié)果按照下表3進(jìn)行判定：表3待測標(biāo)本判定結(jié)果+-無效陽性300陽性210陽性120陰性030陽性201陽性111陰性021無效102無效012無效003無效檢測結(jié)果，須重新檢測。上述實驗操作中，未注明具體條件的，均按照常規(guī)方法，例如分子克隆實驗指南(第三版)中所述進(jìn)行或者按照制造廠商提供條件進(jìn)行實驗操作。5、結(jié)果如下表4所示：在實驗批次名稱為“20151224MK-A3192733H1-24.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，H1標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值為單次PCR反應(yīng)39.15，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。表4在實驗批次名稱為“20160105MK6+2+2.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，H2標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。H3標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。在實驗批次名稱為“20160116-H4H5A21～24.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，H4標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出3次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。H5標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出兩次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。在實驗批次名稱為“20160119H6H7H8.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，H6-1和H6-2標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出3次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。H7標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出一次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。H8標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出一次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。在實驗批次名稱為“20160126-H9C3mix.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，H9標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值檢出兩次PCR陽性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陽性。在實施例1中，包括標(biāo)本H1～H9(H6重復(fù)一次)共計檢測10例大腸癌標(biāo)本，檢出8例陽性結(jié)果，即Septin9基因檢測大腸癌的靈敏度為80％。并且全部5批次實驗中所用PC質(zhì)控品ACTB基因Ct平均值27.41、CV％為0.44％，Septin9基因Ct平均值36.87、CV％為2.11％；NC質(zhì)控品ACTB基因Ct平均值31.66、CV％為1.8％，批次間變異系數(shù)均＜5％，說明反應(yīng)體系重復(fù)性高。在實施例1中，PC質(zhì)控品ACTB基因平均Ct值為27.41，Septin9基因平均Ct值為36.87，相差9.46個循環(huán)，表示兩者濃度相差約為100倍，Septin9基因甲基化修飾異常DNA含量小于1％，且PC和NC質(zhì)控品的批間差均低于5％。如下表5所示：在實驗批次名稱為“20160621-B7-1PC1-6.sds”中使用對照引物mS9-R050(mS9-R050ttttttttttcggacgtcg19nt)檢測PC質(zhì)控品ACTB基因Ct平均值27.66，與實施例1中ACTB基因Ct平均值27.41無明顯差別，表示PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系正常工作；而Septin9基因Ct平均值39.66，與實施例1中Septin9基因Ct平均值36.87相差2.79，且C8孔未檢出，充分說明因使用mS9-R050引物擴(kuò)增微量DNA模板時,擴(kuò)增效率不高，有Ct值滯后明顯，且擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)性不好存在個別反應(yīng)孔未檢出信號情況，導(dǎo)致PC質(zhì)控品檢測異常，同時說明本專利所述實施例1中所用引物適用于微量DNA模板的檢測情況，其擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好。表5如下表6所示：在實驗批次名稱為“20160621-B7-1PC1-6.sds”中使用對照引物mS9-R150(mS9-R150tttttttttttcggacgtcg20nt)檢測PC質(zhì)控品ACTB基因Ct平均值28.39，表示PCR擴(kuò)增反應(yīng)正常；而Septin9基因Ct平均值39.09，與實施例1中Septin9基因Ct平均值36.87相差2.22，且C9孔未檢出，充分說明因使用mS9-R150引物擴(kuò)增微量DNA模板時,擴(kuò)增效率不高，有Ct值滯后明顯，且擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)性不好存在個別反應(yīng)孔未檢出信號情況，導(dǎo)致PC質(zhì)控品檢測異常，同時說明本專利所述實施例1中所用引物mS9-F和mS9-R適用于微量DNA模板的檢測情況，其擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好。表6實施例3驗證陽性標(biāo)本中Septin9基因甲基化修飾異常的檢測試劑盒、儀器、檢測方法、判斷方法同實施例2樣品來源，陽性DNA標(biāo)本來自人腫瘤細(xì)胞系基因組DNA(注：CpG島發(fā)生甲基化修飾)，陰性DNA標(biāo)本來自另一種人腫瘤細(xì)胞系基因組DNA(注：CpG島無甲基化修飾)均購自NEB。檢測結(jié)果如下：陽性DNA標(biāo)本如下表7所示：陽性DNA標(biāo)本可同時檢出Septin9基因和ACTB基因，線性擬合：Septin9基因Ct值與檢測濃度的對數(shù)值，R值為0.9999。ACTB基因Ct值與檢測濃度的對數(shù)值，R值為0.9925。表7陰性DNA標(biāo)本如下表8所示：陰性DNA標(biāo)本只檢出ACTB基因(內(nèi)參基因)，未檢出靶點基因(Septin9基因)無非特異性擴(kuò)增，線性擬合：ACTB基因Ct值與檢測濃度的對數(shù)值，R值為0.9882。表8上述實驗操作中，未注明具體條件的，均按照常規(guī)方法，例如分子克隆實驗指南(第三版)中所述進(jìn)行或者按照制造廠商提供條件進(jìn)行實驗操作。實施例4驗證Septin9基因甲基化修飾異常是否于手術(shù)后在外周血中清除試劑盒、儀器、檢測方法、判斷方法同實施例2樣品來源，為同一大腸癌確診患者大腸癌術(shù)前與術(shù)后血漿標(biāo)本。實驗結(jié)果如下：驗證Septin9基因甲基化修飾異常是否于手術(shù)后在外周血中清除，將大腸癌術(shù)前與術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行檢測。在實驗批次名稱為“20151214Mk-4Sampletest，PC1-4NC1-4.sds”中檢測術(shù)前標(biāo)本10#其ATCB基因Ct值為：27.58、27.75、27.69；Septin9基因Ct值為：34.10、35.46、34.78；三重復(fù)PCR反應(yīng)為陽性，在實驗批次名稱為“20160105MK6+2+2.sds”中檢測術(shù)后標(biāo)本B2其Septin9基因Ct值為：未檢出、未檢出、未檢出；三重復(fù)PCR反應(yīng)為陰性。上述檢測結(jié)果說明：患者體內(nèi)的腫瘤組織釋放的ct-DNA進(jìn)入外周血循環(huán)，并且可以檢出；手術(shù)后，因腫瘤組織移除，已經(jīng)釋放到外周血中的ct-DNA將被被清除。即ct-DNA腫瘤標(biāo)志物可實時反應(yīng)受檢者情況，并且提示此檢測在手術(shù)評估及預(yù)后的應(yīng)用潛力。實施例5驗證非大腸癌標(biāo)本檢測是否為陰性試劑盒、儀器、檢測方法、判斷方法同實施例2樣品來源，為經(jīng)腸鏡檢查后，確診為非大腸癌的健康人血漿標(biāo)本。實驗結(jié)果如下：在實驗批次名稱為“20151214MK-4Sampletest，PC1-4NC1-4.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，9#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。11#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。12#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。在實驗批次名稱為“20151207MK-PCNC4Sampletest.sds”中PC和NC質(zhì)控品檢測結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)，1#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。2#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。3#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。4#標(biāo)本ACTB基因Ct值顯示PCR擴(kuò)增有效，Septin9基因Ct值未檢出，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本最終檢測結(jié)果為陰性。上述標(biāo)本均為非大腸癌標(biāo)本，檢測結(jié)果中都未檢出Septin9信號，可檢出ACTB基因Ct值，證明PCR擴(kuò)增反應(yīng)有效，各標(biāo)本檢測結(jié)果為陰性，即Septin9檢測大腸癌的特異性為100％，假陽性結(jié)果出現(xiàn)率為零。在實驗批次名稱為“20160126-H9C3mix.sds”中使用mS9-P-C3探針檢測PC和NC質(zhì)控品結(jié)果：PC質(zhì)控品ACTB基因Ct值為27.33、27.22、27.28；Septin9基因Ct值為36.75、36.391、38.62；結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)。NC質(zhì)控品ACTB基因Ct值為31.18、31.32、31.92；Septin9基因Ct值為未檢出、未檢出、43.55，結(jié)果不符合判定標(biāo)準(zhǔn)，未能有效區(qū)分陰性DNA，特異性不好。當(dāng)前第1頁1 2 3