本發(fā)明涉及一種細菌檢測方法，具體是一種食品中李斯特菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌，它廣泛存在于自然界中。該菌在4°C的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。食品中存在的李斯特菌威脅著人類的健康，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。
目前，對食源性致病菌的檢測主要有標準方法、生化儀器法(API，VETEK)、酶聯(lián)熒光免疫檢測法(VIDAS)、膠體金試紙法、PCR法、基因芯片法等。微生物的傳統(tǒng)檢測方法除操作繁瑣外，檢驗時間也較長，一般需要5-15天的培養(yǎng)鑒定時間，時間上不能滿足快速檢測的要求。
近年來發(fā)展起來的環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因定性檢測方面得到廣泛應用，并且已經(jīng)成為當前病毒核酸定性檢測的重要方法之一。
環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)是一種新型等溫核酸擴增方法,該法針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物,利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件(65℃左右)保溫約60min,即可完成核酸擴增反應,產(chǎn)生肉眼可見的反應副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術(shù)具有不需要PCR儀、擴增產(chǎn)物不需要開蓋，用肉眼即可判斷結(jié)果及反應時間短，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的食品中李斯特菌的檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中李斯特菌的檢測方法，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為32-38℃，培養(yǎng)時間為18-20h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述LAMP Visible Dye為20-40倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為8-15mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7-1.9；
所述聚色氨酸溶液的濃度為20-40mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，60-64℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（1）中培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為19h。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述LAMP Visible Dye為30倍稀釋。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為11mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述隨機引物的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（2）中所述聚色氨酸溶液的濃度為30mmol/L。
作為本發(fā)明進一步的方案：具體步驟（3）中62℃保持1h。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明具有特異性好，靈敏度高，快速簡便，可重復性高以及肉眼可判斷結(jié)果等優(yōu)點，可對工業(yè)食品中李斯特菌進行快速定性檢測，可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學診斷方法。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
實施例1
一種食品中李斯特菌的檢測方法，其特征在于，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時間為18h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述LAMP Visible Dye為20倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為8mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述聚色氨酸溶液的濃度為20mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，60℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
實施例2
一種食品中李斯特菌的檢測方法，其特征在于，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為33℃，培養(yǎng)時間為18h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.7；
所述LAMP Visible Dye為25倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為9mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.7；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.7；
所述聚色氨酸溶液的濃度為25mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，61℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
實施例3
一種食品中李斯特菌的檢測方法，其特征在于，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為19h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.8；
所述LAMP Visible Dye為30倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為11mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.8；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.8；
所述聚色氨酸溶液的濃度為30mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，62℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
實施例4
一種食品中李斯特菌的檢測方法，其特征在于，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時間為20h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述LAMP Visible Dye為35倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為13mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.9；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述聚色氨酸溶液的濃度為35mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，63℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
實施例5
一種食品中李斯特菌的檢測方法，其特征在于，采用LAMP擴增方法，以李斯特菌prfA基因特異序列為靶序列，LAMP Visible Dye為可見光染料，隨后進行熒光定量檢測分析；具體過程包括如下步驟：
（1）預處理：
在無菌環(huán)境下，將食品加入到LB肉湯中，培養(yǎng)溫度為38℃，培養(yǎng)時間為20h，培養(yǎng)結(jié)束后，反復使用生理鹽水進行清洗，隨后進行提取總RNA，加入液氮研磨菌體，隨后經(jīng)過乙醇沉淀并溶解在DEPC水中；
（2）構(gòu)建LAMP擴增反應體系：
DNA模板 2μL，LAMP Visible Dye 0.5μL，10×Buffer 2.5μL，DNA聚合酶 5U，反轉(zhuǎn)錄酶 10U，硫酸鋁鉀溶液0.3μL，dNTP 3μL，隨機引物 2μL，DNA引物 3μL，聚色氨酸溶液 1μL，其余用dd H2O補足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值為1.9；
所述LAMP Visible Dye為40倍稀釋；
所述Buffer中含有NaCl、Tris-HCl（pH 8.3）、聚乙烯吡咯烷酮和三聚磷酸鈉；
所述DNA聚合酶采用Bst聚合酶；
所述硫酸鋁鉀溶液的濃度為15mmol/L；
所述隨機引物的OD260/OD280值為1.9；
所述DNA引物的OD260/OD280值為1.9；
所述聚色氨酸溶液的濃度為40mmol/L；
（3）擴增反應：
將LAMP擴增加入到LAMP試劑盒中，隨后進行擴增，64℃保持1h；
（4）檢測分析：
反應結(jié)束后，離心，肉眼觀察沉淀，對樣品進行定性分析；所述的結(jié)果判斷在陰性對照反應管液體為橙色，陽性對照反應管液體呈綠色的條件下：待檢樣品反應管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽性；待檢樣品反應管液體呈橙色則可報告單核增生李斯特氏菌檢驗結(jié)果為陰性；若陰陽性對照反應管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應重新檢測。
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。