本發(fā)明涉及微生物檢測
技術領域：
，具體說是涉及一種快速并且可實時定量檢測急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP試劑盒及其應用。
背景技術：
：急性肝胰腺壞死綜合癥(AcuteHepatopancreasNecrosisSyndrome，AHPNS)主要引起仔蝦和幼蝦階段的患病對蝦大量死亡，死亡對蝦的肝胰腺呈現明顯的病變?yōu)樘卣?，為當前危害我國對蝦產業(yè)的嚴重病害。該病于2009年在越南暴發(fā)，隨后相繼在馬來西亞和泰國暴發(fā)流行。因與越南等國比鄰且多有對蝦交易往來，我國于2010年開始在沿海養(yǎng)殖區(qū)域發(fā)現AHPNS流行，海南、福建、廣東和廣西部分地區(qū)對蝦的死亡率高達80％。據統(tǒng)計，2013年全球養(yǎng)殖對蝦產量較2012年減少23％，而我國的蝦產量則下降約17％，估計每年給我國對蝦產業(yè)造成的直接經濟損失超過10億元人民幣。除大規(guī)模減產外，該病還帶來諸多負面影響，例如：對蝦養(yǎng)殖人員就業(yè)問題、對蝦供求問題和全球對蝦市場價格問題等?？梢姡珹HPNS已對東南亞國家乃至全球的對蝦養(yǎng)殖及相關產業(yè)造成了前所未有的打擊和經濟損失。對急性肝胰腺壞死綜合癥病原的確定，各國科學家眾說紛紜，觀點不一，但各方都沒能拿出令“其它觀點支持者”信服的證據，對該病的研究更多是建立在猜測和設想的基礎上。中國蝦產業(yè)體系首席科學家何建國認為導致對蝦發(fā)病死亡之快的原因可能有兩方面，即副溶血性弧菌致病和不明原因的中毒。中國蝦產業(yè)體系北方區(qū)病害防控崗位科學家黃倢則認為AHPNS的暴發(fā)可能與黃頭病毒(YHV)的新型變異病毒株的感染相關，美國Lightner教授認為其病原為副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的特異菌株。最近羅竹芳教授及其團隊認為AHPNS的暴發(fā)可能與致病性質粒所攜帶的PriA和PriB毒素蛋白密切相關，他們在Lightner教授的研究基礎上發(fā)現了PVA-1質粒的自殺基因機制，發(fā)現PVA-1質粒中除了有PriA和PriB兩種毒素基因以外，還有自殺毒素基因(pndA)和自殺解毒基因(pndB)。pndA的mRNA半衰期為20min，而pndB的mRNA僅有30sec。當把PVA-1質粒從弧菌細胞內移除后，細胞質內殘余的pndAmRNA繼續(xù)翻譯出自殺毒素，而pndB的mRNA則尚未翻譯出足夠的解毒蛋白，使得自殺毒素累積，造成弧菌死亡。他們發(fā)現PriA和PriB毒素基因可誘導AHPNS癥狀，其中PriB毒力較PriA強，同時還發(fā)現兩個基因操縱子位于不穩(wěn)定的序列上，且可能在其他微生物間自由進出。后續(xù)研究表明PriA和PriB毒素蛋白的三維結構與蘇云金芽孢桿菌分泌的一種昆蟲毒素蛋白非常相似，暗示蘇云金芽孢桿菌也可能引起對蝦肝胰腺的壞死。另外，研究還發(fā)現P.asymbiotica中PriA和PriB之間的DNA序列含有一段腸桿菌基因鍵重復序列(ERIC)，該序列與mRNA的穩(wěn)定性和表達密切相關，提示通過基因工程技術對該序列進行干預，將有可能破壞PriA和PriB之間的相互作用或表達的穩(wěn)定性，從而實現“去毒”的可能，這或許可在因受PriA和PriB毒素蛋白作用而中毒的對蝦解毒策略上提供借鑒。解旋酶活性與復制叉底物結合活性的相互作用，決定了PriA是進行復制體裝載還是模板解螺。由此可見，如果此兩種毒素基因能自由出入其他微生物，致病性質粒所攜帶的毒素基因是AHPNS的致病原因的科學假說無疑對深入研究該病帶來了希望。PriA是一種3'5'解旋酶,是SF2解旋酶超級家族中一員，這個蛋白由三個重要的功能域組成：N一末端DNA結合域,DNA解旋酶域，以及嵌在解旋酶域中的鋅指序列。研究已發(fā)現了PriA與DNA穩(wěn)定結合的兩種形式。一種是PriA與雙鏈DNA上的一段單鏈結合，這反映了PriA的解旋酶活性。另一種是PriA與三鏈交叉處結合,反映了PriA的D-loop結合活性。由于缺乏對病原的認識，目前未能制定出合理有效的防制措施。因此，檢測急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因對該病的致病因素及其傳播途徑以及與機體的相應作用進行研究就顯得十分必要。目前，急性肝胰腺壞死綜合癥檢測技術主要有常規(guī)方法和分子生物學方法。常規(guī)方法是通過對細菌的表型特征和生化指標進行鑒定。鑒定急性肝胰腺壞死綜合癥的生化指標主要包括：革蘭氏染色、氧化酶實驗、過氧化氧酶實驗、CAMP實驗、V-P反應(福格斯-普利斯考爾)產物實驗、凝集實驗、ELISA實驗等。但常規(guī)鑒定方法存在操作復雜,所需時間長以及特異性不強的缺點。另外，也建立了急性肝胰腺壞死綜合癥的特異性副溶血性弧菌的PCR方法檢測方法。雖然PCR方法較常規(guī)方法快速準確，但需要復雜的儀器設備，成本較高，不適合基層和現場檢測，而且該方法不能保證與每個可能的非急性肝胰腺壞死綜合癥細菌的樣本或者其它有機體沒有交叉反應，也不能保證這種方法能檢測出每一株可能引起對蝦AHPND的細菌。該PCR方法只是作為一個臨時檢測工具。LAMP方法具有以下幾個顯著特點：第一、特異性高。第二、方便、快速、無需昂貴儀器。第三、高靈敏度。LAMP方法的靈敏性極高，有文獻報道，只要反應體系內存在有6個拷貝的基因，反應結果便會出現陽性。第四、檢測結果判定簡單方便。LAMP反應結束后，在可見光下將陽、陰性管進行比較，通過肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性對照管透明；短暫離心后，陽性反應管底部有明顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性管底部無沉淀物；或加入熒光染料，用肉眼便可觀察實驗結果?？傊?，LAMP技術僅應用簡單的實驗儀器,能夠滿足基層、現場、即時、大批量樣本檢測的需要，克服了傳統(tǒng)PCR方法的不足之處。目前尚無建立有用于檢測急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP方法，本發(fā)明的LAMP實時濁度法有別于一般的LAMP顯色法，可實時監(jiān)測反應過程中所產生的白色沉淀，從而實現對LAMP整個反應過程的實時監(jiān)控，有效的排除非特異性擴增，增加診斷準確性。技術實現要素：本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的方法，公開一種快速、實時定量的檢測急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP試劑盒及其檢測方法。為實現本發(fā)明目的所使用的技術方案為：一種急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2×ReactionMix、BstDNAPolymerase、熒光目視檢測試劑、DNA模板和DistilledWater，所述LAMP引物包括外引物是F3與B3和內引物是FIP與BIP；其中引物的序列分別為：F3GCCATCAATGGAATATTGGATB3GAAGACTTACAGTTGTTGCTAAFIPCAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCGBIPTTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGC。優(yōu)選的，所述的DNA模板取自通用型柱式基因組DNA。優(yōu)選的，所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠色熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。一種急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP試劑盒的應用，采用該試劑盒檢測PriA基因，具體檢測步驟包括：(1)LAMP引物的設計與合成(2)通用型柱式基因組DNA提取(3)LAMP反應體系建立(4)LAMP檢測方法。優(yōu)選的，所述的LAMP反應體系建立LAMP反應體系以25μl計，優(yōu)選的，所述的LAMP檢測方法采用實時、定量的檢測方式。優(yōu)選的，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。優(yōu)選的，所述的LAMP檢測方法進行密閉全程監(jiān)控。本發(fā)明的實質性特點和進步是：1)特異性強所檢測的陰性對照株均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。2)靈敏度高普通的PCR檢測方法的靈敏度為5.02×10-5ng/μL數量級，而使用本發(fā)明檢測方法，檢測限約為5.02×10-6ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3)迅速得出結果普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數建立的LAMP反應方法在反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從通用型柱式基因組DNA提取到獲取試驗結果，需要4-5小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應在30-40min間出現擴增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判定方式簡便—擴增結束即可判斷結果，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從質粒提取到獲得最終結果可在2-3小時內完成。4)不造成污染目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在反應前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋。5)可實時定量本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320濁度儀來實時分析LAMP反應的結果，不同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的PriA基因拷貝數，達到定量檢測產物的目的。附圖說明圖1是本方明LAMP方法特異性檢測結果；其中A1：PriA陽性質粒；A2：發(fā)光桿菌；A3：美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種；A4：蘇云金芽孢桿菌殺蟲亞種；A5：副溶血弧菌；A6：副溶血弧菌；A7：軍團菌；A8：溶藻弧菌；C1：鰻弧菌；C2：釀酒酵母菌：C3：蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種；C4：空白對照(水)。結果顯示PriA陽性質粒反應管出現濁度的上升曲線，10株對照菌反應管和水對照反應均無擴增。圖2和圖3是本發(fā)明LAMP方法及傳統(tǒng)PCR方法的敏感性檢測結果；其中A1：5.02×10ng/μL、A2：5.02×100ng/μL、A3：5.02×10-1ng/μL、A4：5.02×10-2ng/μL、A5：5.02×10-3ng/μL、A6：5.02×10-4ng/μL、A7：5.02×10-5ng/μL、A8：5.02×10-6ng/μL、A9：5.02×10-7ng/μL、A10：5.02×10-8ng/μL、A11：5.02×10-9ng/μL；重組質粒pMD18-T-PriA的起始濃度為5.02×10ng/μL，經10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結果顯示LAMP法檢測限約為5.02×10-6ng/μL，而PCR法檢測限為5.02×10-5ng/μL。圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結果：左管為PriA陽性質粒為模板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。圖5是本發(fā)明急性肝胰腺壞死綜合癥中priB基因定量標準曲線；利用不同的標準樣品的濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的急性肝胰腺壞死綜合癥中priB基因拷貝數。圖6是本發(fā)明LAMP方法臨床樣品檢測結果：A1-A5為健康蝦1-5號；A6為病蝦9號；C1-C8為病蝦1-8號。結果顯示C1、C2、C4、C6、C7、C8和A6出現濁度的上升曲線，C3、C5及A1-A5反應管均無擴增。具體實施方式1、材料的準備PriA陽性質粒、發(fā)光桿菌、美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種、蘇云金芽孢桿菌殺蟲亞種、副溶血弧菌、副溶血弧菌、軍團菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、釀酒酵母菌、蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種為廣西壯族自治區(qū)水產研究院分離保存。LAMP法DNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司，貨號SLP204，通用型柱式基因組提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2298。2、LAMP引物的設計與合成根據GenBank中的PriA基因序列，利用LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorerV4軟件設計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，FIP、BIP為內引物，其中F3、B3為PriA基因PCR檢測引物，其中F3GCCATCAATGGAATATTGGATSEQIDNO：1B3GAAGACTTACAGTTGTTGCTAASEQIDNO：2FIPCAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCGSEQIDNO：3BIPTTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGCSEQIDNO：43、通用型柱式基因組DNA提取使用康為世紀生物科技有限公司生產的通用型柱式基因組提取試劑盒提取通用型柱式基因組DNA。4、LAMP反應體系建立按照試劑盒說明書，按25μl體系配置：LAMP反應在以實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測本方法的檢出情況，濁度儀實時監(jiān)控擴增情況，可繪制標準曲線，通過獲得未知樣品達到0.1濁度值對應的時間值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數，反應溫度以試劑盒推薦的63℃做為反應溫度。5、LAMP檢測方法1)特異性檢測分別提取PriA陽性質粒、發(fā)光桿菌、美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種、蘇云金芽孢桿菌殺蟲亞種、副溶血弧菌、副溶血弧菌、軍團菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、釀酒酵母菌、蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種的基因組DNA作為LAMP反應的模板，同時進行各菌株的LAMP擴增，檢驗LAMP方法的特異性。2)敏感性檢測以提取的病蝦基因組DNA為模板，用外引物F3和B3進行PCR擴增，將目的基因連接載體pMD-18T，進行克隆，提取單克隆菌質粒，測定其濃度，經測序驗證。用RNA-FreeWater連續(xù)10倍倍比稀釋成10個稀釋度，取各稀釋度質粒2μL作為模板進行LAMP擴增和PCR擴增，對比本發(fā)明的LAMP方法和普通PCR方法對檢測PriA基因的敏感性。3)熒光可視化檢測根據濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63℃下反應40分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實施例1LAMP檢測方法的特異性結果對PriA陽性質粒、10株陰性對照菌和水對照進行LAMP擴增，結果如圖1所示，PriA陽性質粒反應管在15分鐘左右出現濁度的上升曲線，為陽性結果，10株陰性對照菌反應管和水對照反應管曲線均無擴增情況出現，為陰性結果。實施例2LAMP檢測方法的敏感性結果重組質粒pMD18-T-PriA的起始濃度為5.02×10ng/μL，經10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結果如圖2、圖3所示，顯示LAMP法檢測限約為5.02×10-6ng/μL，而PCR法檢測限為5.02×10-5ng/μL。實施例3LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結果根據濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，反應器加入熒光染料，63℃反應40分鐘后，在紫外燈下觀察，圖4為觀察結果，左管為PriA陽性質粒為模板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。試驗結果表明本發(fā)明建立的方法可以方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設計的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃40分鐘，即可快速觀察結果，且無需開蓋，避免了污染。實施例4急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因定量標準曲線的繪制設置對照：濃度為5.02×101ng/μL、5.02×100ng/μL、5.02×10-1ng/μL、5.02×10-2ng/μL、5.02×10-3ng/μL、5.02×10-4ng/μL、5.02×10-5ng/μL、5.02×10-6ng/μL、5.02×10-7ng/μL、5.02×10-8ng/μL、5.02×10-9ng/μL的標準樣品各一個，因為濃度的負對數值與濁度值為0.1的時間值成線性關系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時間做成標準曲線，獲得標準曲線方程，y＝0.3791x-7.8516如圖5所示。從標準曲線方程來看相關系數R2為0.9965，呈良好的線性關系。以時間為X值，可求出Y值即濃度的負次方數。如某試驗樣品達到濁度值為0.1的時間為21分鐘時，帶入所建立的標準曲線方程，求出Y等于0.1095，則濃度為10-0.1095，再乘以基數5.02，即為該試驗樣品點的濃度，從而達到定量的效果。時間(分鐘)182123262931標準值(-LOG)-101234實施例5LAMP方法臨床樣品檢測結果對隨機采集的健康蝦和病蝦進行LAMP擴增，結果如圖6所示：A1-A5健康蝦及病蝦C3，C5反應管曲線均無擴增情況出現，為陰性結果；A6及C1-C2、C4、C6-C8病蝦反應管出現濁度的上升曲線，為陽性結果；也即健康蝦1-5檢測及病蝦3、5結果均為陰性，病蝦1、2、4、6、7、8、9檢測結果均為陽性。<110>廣西壯族自治區(qū)水產科學研究所<120>一種急性肝胰腺壞死綜合癥中priA基因的LAMP試劑盒及其應用<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1GCCATCAATGGAATATTGGAT<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2GAAGACTTACAGTTGTTGCTAA<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>3CAGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCAAAATCAAAGAGACACGCG<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>4TTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGGCAATATCGCATAACCAAGC當前第1頁1 2 3