本發(fā)明屬于香料制備領(lǐng)域，具體是一種新型薄荷腦的精制方法。

背景技術(shù)：

生物體感知香料、香精的香氣是通過(guò)生物體內(nèi)的酶或細(xì)胞表面的受體分子完成的，而生物體內(nèi)的酶或細(xì)胞表面的受體分子都是具有手性的分子，它們的基本單元例如碳水化合物、氨基酸等也都是手性的，所以就造成了具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，由于它們的手性不同而具有不同的香氣。1961年，Ohloff發(fā)表了第一個(gè)手性香料(+)-β-香茅醇1的香味屬性。(+)-1具有香茅醛香味,(-)-1具有香葉油香味。隨后，人們發(fā)現(xiàn)不同的對(duì)映異構(gòu)體可表現(xiàn)為不同的香味或香味的程度不同。不同光學(xué)純度的手性香料也可表現(xiàn)出不同的嗅閾。由于對(duì)映體純的手性香料有許多優(yōu)勢(shì)，與消旋體混合物相比具有更好的香氣品質(zhì)，因此手性在香料中的重要性日益受到重視。隨著不對(duì)稱(chēng)合成、生物轉(zhuǎn)化、分離提純等技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的手性香料被揭開(kāi)神秘的面紗，對(duì)映體純的手性香料的應(yīng)用已經(jīng)成為香料香精工業(yè)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)，迄今為止，有文獻(xiàn)報(bào)道的手性香料已達(dá)到約500種。但是由于對(duì)映體純的手性香料的制備成本通常較高，對(duì)映體純的手性香料的應(yīng)用還非常有限。手性香料的研究在近些年受到了較為普遍的關(guān)注，但很多手性香料的制備方法還缺乏實(shí)用性，距離工業(yè)應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)。低成本實(shí)用可行的不對(duì)稱(chēng)合成方法還亟待進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。

對(duì)于薄荷腦而言，由于薄荷醇分子中存在3個(gè)手性中心，理論上有8個(gè)異構(gòu)體，在4對(duì)外消旋化合物中，D-和L-薄荷醇是目前具有最重要工業(yè)價(jià)值的化合物。但是，D-和L-薄荷醇的氣味存在極大差異。L-薄荷醇具有新鮮、輕快、擴(kuò)散性的氣味，并帶有甜的辛辣的刺激性氣味；其特征與胡椒的主要?dú)馕断嗨?，而D-異構(gòu)體卻具有辛辣刺激性氣味，稱(chēng)為木樣–薄荷氣味，微帶樟腦氣味。L-薄荷醇具有很強(qiáng)的清涼效果，而這種性質(zhì)在D-薄荷醇中幾乎不存在。正是這種性質(zhì)的區(qū)別使得L-薄荷醇比D-薄荷醇的價(jià)值大得多。

現(xiàn)有L-薄荷醇有的是合成的，如日本高砂公司通過(guò)烯烴異構(gòu)化技術(shù)不對(duì)稱(chēng)合成法生產(chǎn),并生產(chǎn)鈴蘭香精等達(dá)千余噸,成為目前手性催化工業(yè)應(yīng)用規(guī)模最大實(shí)例。但合成的L-薄荷醇的香氣沒(méi)有天然L-薄荷醇的自然清新，這對(duì)于香精香料行業(yè)來(lái)說(shuō)是一個(gè)致命缺陷；而且合成的原料不可避免的有一些溶劑、化學(xué)試劑的殘留，這對(duì)于煙草這個(gè)食品行業(yè)來(lái)說(shuō)是一個(gè)安全隱患；并且這種方法分離步驟多且得率不高。天然L-薄荷醇多采用同時(shí)結(jié)晶法拆分，是在過(guò)飽和溶液兩個(gè)區(qū)域分別加入相反手性的晶種,同時(shí)得到兩種對(duì)映體結(jié)晶。這種直接結(jié)晶法拆分較方便、經(jīng)濟(jì)，但其應(yīng)用范圍有限，因?yàn)檎麄€(gè)外消旋體中以混合物存在的僅占10％。因此對(duì)天然薄荷素油中的外消旋薄荷醇(D,L-薄荷醇)進(jìn)行拆分有很重要的意義。

酶是常用的生物催化劑，能夠催化構(gòu)成細(xì)胞代謝的所有反應(yīng)，同一般的化學(xué)催化劑相比酶有以下優(yōu)點(diǎn)：催化效率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，活性可調(diào)控，來(lái)源廣泛。目前，酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于釀造，檢測(cè)，醫(yī)藥，生物化工等領(lǐng)域。雖然酶能夠在生物體內(nèi)催化許多化學(xué)反應(yīng)，但是作為工業(yè)催化劑仍然有缺陷。因?yàn)槊傅幕瘜W(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其催化特性嚴(yán)格地依賴(lài)于蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，以及底物與蛋白質(zhì)活性基團(tuán)間準(zhǔn)確的功能定位。游離酶存活的溫度、pH值范圍較窄，對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等均不夠穩(wěn)定，容易失活和變性，在催化反應(yīng)中還存在著其它難以克服的缺點(diǎn)，對(duì)于現(xiàn)代工業(yè)來(lái)說(shuō)游離酶并不是一種理想的催化劑。為了克服游離酶的缺點(diǎn)，人們開(kāi)始探索將水溶性酶與不溶性載體結(jié)合起來(lái)，使之成為不溶于水的酶的衍生物。同時(shí)，又能保持酶的大部分活性，而在催化反應(yīng)中不易流失，這就是所謂的“固定化酶”。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專(zhuān)一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還具有很多優(yōu)點(diǎn)：酶的穩(wěn)定性高；能夠重復(fù)或連續(xù)使用；從反應(yīng)產(chǎn)物中分離比較容易；操作連續(xù)及可控；工藝簡(jiǎn)單；具有調(diào)節(jié)催化性質(zhì)的作用；防止蛋白質(zhì)的中毒，以及防止微生物受污染。在化學(xué)、生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域得到迅速發(fā)展，而且，因?yàn)榫哂泄?jié)省資源與能源、減少或防治污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。

固定化酶應(yīng)用的主要障礙之一是載體問(wèn)題。因?yàn)檩d體必須便宜，易于活化，且制備的固定化酶活性和穩(wěn)定性高。載體的選擇應(yīng)考慮兩方面：一是其物理、機(jī)械性能和化學(xué)、生物穩(wěn)定性；二是其表面基團(tuán)的反應(yīng)活性和酶結(jié)合的化學(xué)鍵型。性能優(yōu)良的固定化酶需要根據(jù)應(yīng)用目的和酶的特性，選擇合適的固定化載體和固定化方法。

海藻酸鈉又名褐藻酸鈉、海帶膠、褐藻膠、藻酸鹽，是由海帶中提取的天然多糖碳水化合物。廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、印染、造紙、日用化工等產(chǎn)品。褐藻酸鈉不僅是一種安全的食品添加劑，而且可作為仿生食品或療效食品的基材，由于它實(shí)際上是一種天然纖維素，可減緩脂肪糖和膽鹽的吸收，具有降低血清膽固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥等現(xiàn)代病。它在腸道中能抑制有害金屬如鍶、鎘、鉛等在體內(nèi)的積累，正是因?yàn)楹衷逅徕c這些重要作用，在國(guó)內(nèi)外已日益被人們所重視。日本人把富含有褐藻酸鈉的食品稱(chēng)為“長(zhǎng)壽食品”，美國(guó)人則稱(chēng)其為“奇妙的食品添加

劑”。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種新型薄荷腦的精制方法，該法材料安全、拆分選擇性高，制備的L-薄荷醇光學(xué)純度高，煙用效果佳。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案：一種新型薄荷腦的精制方法，包括如下步驟：

(1)取摩爾比為1:1～2:1的乙酸乙酯和薄荷醇，將其溶于無(wú)水乙醇中，加熱回流反應(yīng)10h，停止反應(yīng)后旋蒸出溶劑乙醇，得到粗產(chǎn)品，用蒸餾水洗脫3次，得到薄荷醇酯；

(2)取海藻酸鈉，加入其50倍重量的蒸餾水，振蕩溶解，再加入其重量的1.1％～10.8％的高碘酸鈉，在4℃下避光反應(yīng)24h，得到氧化的海藻酸鈉；

化學(xué)反應(yīng)過(guò)程如下反應(yīng)方程式所示：

(3)將氧化后的海藻酸鈉，滴入到氯化鈣溶液中，浸泡30-60min，蒸餾水洗3次并滲析，過(guò)濾得到海藻酸鈣微球；

(4)取脂肪酶，加入步驟(3)所得的海藻酸鈣微球，溶于pH4～6的緩沖溶液，室溫下攪拌1-3h，用濾網(wǎng)過(guò)濾，分離海藻酸鈣微球載體和濾液，得到固定化脂肪酶；

(5)稱(chēng)取步驟(1)中合成的薄荷醇酯，溶解于無(wú)水乙醇中，并加入一定量步驟(4)所得的固定化脂肪酶，在30-40℃、150-200r/min攪拌1h-8h，再分離固定化脂肪酶和酶解底物，即得到拆分后的L-薄荷醇。

所述步驟(1)中加入的乙酸乙酯和薄荷醇的總量與無(wú)水乙醇的質(zhì)量比為20:90。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中所得氧化的海藻酸鈉的氧化度為0.5％～10％。

進(jìn)一步的，所述步驟(3)中氯化鈣溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％～5％，氧化的海藻酸鈉與氯化鈣溶液的質(zhì)量比是1:10-1:50。

進(jìn)一步的，所述步驟(4)中脂肪酶的加酶量比例為10-30mg/0.1g海藻酸鈣微球。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中薄荷醇酯以1mmol溶于3mL無(wú)水乙醇的比例溶解于無(wú)水乙醇中。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中薄荷醇酯與固定化脂肪酶的反應(yīng)比例100mL:1g～100mL:3g。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將自主合成的改性海藻酸鈣用于固定脂肪酶的載體，制備了具有手性拆分性能的材料。本發(fā)明利用海藻酸鈉線性結(jié)構(gòu)中重復(fù)單元上的鄰位二羥基，用高碘酸鈉等氧化劑打斷連接鄰位羥基的C-C鍵，得到表面富含醛基的海藻酸鈉，即氧化的海藻酸鈉，氧化的海藻酸鈉遇到鈣離子可以形成獨(dú)特的凝膠性能來(lái)得到海藻酸鈣微球，利用改性海藻酸鈣凝膠表面的醛基，來(lái)作為與脂肪酶上氨基殘基的結(jié)合點(diǎn)，從而固定脂肪酶，用于L-薄荷醇的提純。所得固定化脂肪酶安全、拆分選擇性高，制備的L-薄荷醇光學(xué)純度高，煙用效果佳；且工藝條件溫和，產(chǎn)品可多次循環(huán)使用，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

(1)取摩爾比為1:1的乙酸乙酯和薄荷醇，將其溶于4.5倍乙酸乙酯和薄荷醇總質(zhì)量的無(wú)水乙醇中，加熱回流反應(yīng)10h，停止反應(yīng)后旋蒸出溶劑乙醇，得到粗產(chǎn)品，用蒸餾水洗脫3次，得到薄荷醇酯；

(2)取海藻酸鈉，加入其50倍重量的蒸餾水，振蕩溶解，再加入其重量的1.2％的高碘酸鈉，在4℃下避光反應(yīng)24h，得到氧化的海藻酸鈉，所得氧化的海藻酸鈉的氧化度為0.9％；

(3)將氧化后的海藻酸鈉，滴入到其10倍質(zhì)量的2％的氯化鈣溶液中，浸泡35min，蒸餾水洗3次并滲析，過(guò)濾得到海藻酸鈣微球；

(4)取10mg脂肪酶，加入/0.1g步驟(3)所得的海藻酸鈣微球，溶于pH4的緩沖溶液，室溫下攪拌1h，用濾網(wǎng)過(guò)濾，分離海藻酸鈣微球載體和濾液，得到固定化脂肪酶；

(5)稱(chēng)取步驟(1)中合成的薄荷醇酯100mL，溶解于無(wú)水乙醇中，并加入一定量步驟(4)所得的固定化脂肪酶1g，在32℃、150r/min攪拌7h，再分離固定化脂肪酶和酶解底物，即得到拆分后的L-薄荷醇。

實(shí)施例2

(1)取摩爾比為1.4:1的乙酸乙酯和薄荷醇，將其溶于4.5倍乙酸乙酯和薄荷醇總質(zhì)量的無(wú)水乙醇中，加熱回流反應(yīng)10h，停止反應(yīng)后旋蒸出溶劑乙醇，得到粗產(chǎn)品，用蒸餾水洗脫3次，得到薄荷醇酯；

(2)取海藻酸鈉，加入其50倍重量的蒸餾水，振蕩溶解，再加入其重量的5.4％的高碘酸鈉，在4℃下避光反應(yīng)24h，得到氧化的海藻酸鈉，所得氧化的海藻酸鈉的氧化度為4.7％；

(3)將氧化后的海藻酸鈉，滴入到其20倍質(zhì)量的3％的氯化鈣溶液中，浸泡50min，蒸餾水洗3次并滲析，過(guò)濾得到海藻酸鈣微球；

(4)取脂肪酶16mg，加入0.1g步驟(3)所得的海藻酸鈣微球，溶于pH5的緩沖溶液，室溫下攪拌2.5h，用濾網(wǎng)過(guò)濾，分離海藻酸鈣微球載體和濾液，得到固定化脂肪酶；

(5)稱(chēng)取步驟(1)中合成的薄荷醇酯100mL，溶解于無(wú)水乙醇中，并加入一定量步驟(4)所得的固定化脂肪酶2g，在35℃、175r/min攪拌4h，再分離固定化脂肪酶和酶解底物，即得到拆分后的L-薄荷醇。

實(shí)施例3

(1)取摩爾比為2:1的乙酸乙酯和薄荷醇，將其溶于4.5倍乙酸乙酯和薄荷醇總質(zhì)量的無(wú)水乙醇中，加熱回流反應(yīng)10h，停止反應(yīng)后旋蒸出溶劑乙醇，得到粗產(chǎn)品，用蒸餾水洗脫3次，得到薄荷醇酯；

(2)取海藻酸鈉，加入其50倍重量的蒸餾水，振蕩溶解，再加入其重量的10％的高碘酸鈉，在4℃下避光反應(yīng)24h，得到氧化的海藻酸鈉，所得氧化的海藻酸鈉的氧化度為9.5％；

(3)將氧化后的海藻酸鈉，滴入到其50倍質(zhì)量的4％的氯化鈣溶液中，浸泡55min，蒸餾水洗3次并滲析，過(guò)濾得到海藻酸鈣微球；

(4)取26mg脂肪酶，加入0.1g步驟(3)所得的海藻酸鈣微球，溶于pH6的緩沖溶液，室溫下攪拌3h，用濾網(wǎng)過(guò)濾，分離海藻酸鈣微球載體和濾液，得到固定化脂肪酶；

(5)稱(chēng)取步驟(1)中合成的薄荷醇酯100mL，溶解于無(wú)水乙醇中，并加入一定量步驟(4)所得的固定化脂肪酶3g，在40℃、200r/min攪拌2h，再分離固定化脂肪酶和酶解底物，即得到拆分后的L-薄荷醇。

氧化度定義為被氧化的糖醛酸單元占總海藻酸鈉糖醛酸單元的摩爾百分?jǐn)?shù)。氧化度的測(cè)量方法：將0.5mL的淀粉指示劑與正進(jìn)行氧化的海藻酸鈉溶液反應(yīng)，海藻酸鈉溶液中未消耗的高碘酸鈉與碘化鈉發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，釋放出的碘與淀粉發(fā)生顯色反應(yīng)而呈紅棕色，在480nm處測(cè)定其吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定剩余高碘酸鈉的量，差減法得到高碘酸鈉消耗量，從而得到海藻酸鈉的氧化度，具體計(jì)算公式如下：

其中N為高碘酸鈉的消耗量，m₀為改性前海藻酸鈉的質(zhì)量，M為海藻酸鈉重復(fù)單元相對(duì)分子質(zhì)量。

將未精制的薄荷醇和按本發(fā)明方法精制得到的L-薄荷醇進(jìn)行評(píng)吸評(píng)價(jià)。選用黃鶴樓軟藍(lán)的不加香煙絲，將薄荷醇用95％乙醇溶解，按照1ppm噴施在煙絲上并手工卷制評(píng)吸煙。按(GB/T16447-1996煙草及煙草制品調(diào)節(jié)與測(cè)試的大氣環(huán)境)調(diào)節(jié)卷煙樣品含水率，委托煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站組織湖北省評(píng)煙委員，按(GB5606.4-1996卷煙感官技術(shù)要求)的規(guī)定，進(jìn)行評(píng)吸。評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，固定化酶處理后的精制L-薄荷醇在香氣量、口感和煙氣特征方面具有比較明顯的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)為干凈程度、刺激性、雜氣、香氣質(zhì)等方面的改善。而固定化酶雖然用量大，但通過(guò)酶與載體的共價(jià)結(jié)合，很好的防止了酶蛋白對(duì)底物的“污染”，同時(shí)其用量的增大彌補(bǔ)了其動(dòng)力學(xué)上的缺陷，能夠較好的促進(jìn)L-薄荷醇的拆分，獲得效果上乘的L-薄荷醇。

表1薄荷醇的感官評(píng)價(jià)表

以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，并不以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路上所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。