本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù)制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法及其制備用7α-類(lèi)固醇脫氫酶。
背景技術(shù)：
：3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸又名7-酮石膽酸，是制備熊去氧膽酸的重要中間體。而熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽的主要有效成分，具有增加膽汁酸分泌、并使膽汁成分改變、降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂等功效，主要用于治療膽石疾病。眾所周知，熊膽是一種非常稀缺的資源，原因在于其獲取的傳統(tǒng)途徑主要是依賴(lài)于人工養(yǎng)殖活熊取膽的方法。目前，這種周期長(zhǎng)、收率低且不人道的傳統(tǒng)途徑逐漸被人工合成方法所取代，而現(xiàn)知的人工合成熊去氧膽酸的方法中，3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸都是極為重要的中間體。目前3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的工業(yè)化生產(chǎn)多采用化學(xué)法，但是存在操作條件苛刻、選擇性低、污染環(huán)境、使用大量有機(jī)溶劑、存在有機(jī)溶劑殘留、有毒有害等缺點(diǎn)。為了解決化學(xué)法存在的諸多缺點(diǎn)，人們另辟蹊徑，尋找更好的生產(chǎn)途徑。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利CN1912192B公開(kāi)了一種采用電化學(xué)合成制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，但是此種方法依然需要使用有機(jī)溶劑，并且成本較高。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN105368828A公開(kāi)了一種采用全細(xì)胞催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，但是此種方法需進(jìn)行細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)，存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、產(chǎn)物復(fù)雜等缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的新的制備方法，以解決上述
背景技術(shù)：
中提到的現(xiàn)有制備方法所存在的有機(jī)溶劑殘留、條件苛刻、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、成本較高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)，本發(fā)明同時(shí)提供了該新制備方法適用的生物酶。為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期大量的實(shí)驗(yàn)摸索，在經(jīng)歷上百次的失敗嘗試之后，終于篩選出適用于細(xì)胞外生物催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的生物酶，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，從而開(kāi)發(fā)出一種新的制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的方法，其特征在于：以鵝去氧膽酸為底物，在NAD、乳酸脫氫酶、丙酮酸鈉以及緩沖溶液存在的條件下，用7α-類(lèi)固醇脫氫酶催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶來(lái)源于Brevundimonasnaejangsanensis，所述乳酸脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，在整個(gè)催化反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為50～100mg/mL，所述NAD的濃度為0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸鈉的濃度為10～30mg/mL。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶、固態(tài)酶以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。優(yōu)選地，控制所述催化過(guò)程在溫度為25～35℃，pH值為7.5～8.5的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述緩沖溶液為50～100mM磷酸鉀緩沖液。優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下提純步驟：待所述催化過(guò)程反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH值為1.0～2.0，攪拌20～30min，待冷卻后再經(jīng)過(guò)濾水洗干燥后即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品。更優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下精制步驟：將獲得的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品用8-15倍無(wú)水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，過(guò)濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入4-5倍純水?dāng)嚢?h，過(guò)濾，將濾餅真空干燥過(guò)夜，即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品。優(yōu)選地，上述制備方法中所使用的7α-類(lèi)固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7α-類(lèi)固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。更優(yōu)選地，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。本發(fā)明還提供了一種7α-類(lèi)固醇脫氫酶，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶來(lái)源于Brevundimonasnaejangsanensis，用于催化鵝去氧膽酸制備3α-羥基-7氧代-5β膽烷酸，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NAD存在下以鵝去氧膽酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7α-類(lèi)固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變：第40位、第41位、第66位、第67位、第144位、第157位、第190位以及第192位。優(yōu)選地，所述7α-類(lèi)固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變：D40K、L41R、D66K、V67R、S144A、Y157W、I190R以及T192A。有益效果：1、與現(xiàn)有的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法相比，本發(fā)明提供的方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和易控、反應(yīng)時(shí)間短、不使用有機(jī)溶劑、無(wú)毒無(wú)污染且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)實(shí)踐證明，本發(fā)明提供的方法的反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)僅需4～12小時(shí)，其對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.8%以上，所獲得的產(chǎn)品的含量在96.8%以上。2、本發(fā)明篩選出了適用于細(xì)胞外生物催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的7α-類(lèi)固醇脫氫酶基因，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，這些突變體酶表現(xiàn)出高的選擇性使得該方法不會(huì)形成副產(chǎn)物，這些突變體酶的高催化活性和高專(zhuān)一性使得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸酶法大規(guī)模生產(chǎn)的成本更低，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋?zhuān)景l(fā)明并不局限于以下實(shí)施例，實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或者制造商建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明提供的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法的具體實(shí)施過(guò)程如下：將鵝去氧膽酸懸浮于50～100mM磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中，用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入終濃度為10～30mg/mL的丙酮酸鈉并用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0，加入7α-類(lèi)固醇脫氫酶和乳酸脫氫酶，最后加入終濃度為0.01～0.25mg/mL的NAD，底物終濃度為50～100mg/mL，反應(yīng)在溫度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為4h～12h。每隔一定時(shí)間取反應(yīng)液用流動(dòng)相稀釋50～100倍，微孔過(guò)濾后進(jìn)樣進(jìn)行液相分析。液相檢測(cè)使用PhenomenxGemini5μmNX-C18110A250×4.6mm為分析柱，流動(dòng)相為乙腈:緩沖溶液（取磷酸二氫鈉0.78g,溶解1L水中，用磷酸調(diào)pH值為3，即可）:甲醇=30:37:40，用0.45um濾膜過(guò)濾后備用。柱溫為40℃，示差檢測(cè)器（RID），流速為0.8mL/min。待催化過(guò)程反應(yīng)結(jié)束后，在快速攪拌的情況下加入鹽酸至pH為1.0～2.0，繼續(xù)攪拌20～30min，待冷卻后過(guò)濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥后即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品。成品再用8-15倍無(wú)水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，過(guò)濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入4-5倍純水?dāng)嚢?h，過(guò)濾，將濾餅真空干燥過(guò)夜，即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶、固態(tài)酶以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。實(shí)施例1含有親本基因的共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-AH1-LDH的制備將來(lái)源于Brevundimonasnaejangsanensis的7α-類(lèi)固醇脫氫酶基因AH1和來(lái)源于魏斯氏菌（Weissellasp）的乳酸脫氫酶基因LDH分別利用引物對(duì)5'CGCCATATGATGGACGCACATTTCCGACT3'和5'CCGGAATTCTCAGTCCAGCTCCTGAACGC3'以及引物對(duì)5'CCGGAATTCAAGGAGATATACATATGAAGATCTTCGCGTACGGTA3'和5'CCGCTCGAGTTAATATTCCACCGCAATGC3'通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得PCR產(chǎn)物后經(jīng)過(guò)酶切處理，同時(shí)插入到表達(dá)載體pET22b（+）的NdeI和EcoRI位點(diǎn)以及EcoRI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)，得到共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-AH1-LDH。經(jīng)DNA測(cè)序，確定該被克隆的親本7α-類(lèi)固醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；確定該被克隆的親本乳酸脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。實(shí)施例2含有7α-類(lèi)固醇脫氫酶突變體的共表達(dá)重組質(zhì)粒的制備通過(guò)反向PCR技術(shù)對(duì)7α-類(lèi)固醇脫氫酶親本進(jìn)行定點(diǎn)突變，在突變位置通過(guò)設(shè)計(jì)反向引物，利用上下游突變引物擴(kuò)增目的片段，并在引物上引入相應(yīng)突變，以重組質(zhì)粒pET22b-AH1-LDH作為模板進(jìn)行反向PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化模板處理后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(de3)，經(jīng)過(guò)Amp的篩選后挑取菌落送測(cè)序。突變位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)如表1所示。PCR體系為：TaKaRaEXTaqHS0.25ul；10×ExTaqBuffer5ul；模板質(zhì)粒1ul；dNTP（2.5mMeach）4ul；上游引物1ul;下游引物1ul；無(wú)菌水upto50ul。PCR程序?yàn)椋菏紫?8℃2min；然后98℃10s，55-56℃30s，72℃7min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。表1引物名稱(chēng)引物序列（5′至3′）D40K+L41R上游GCCGTCACCAAAAGGGACGCGGCCD40K+L41R下游GGCCGCGTCCCTTTTGGTGACGGCD66K+V67R上游CTGGCCTGCAAAAGGACCGATGAAD66K+V67R下游TTCATCGGTCCTTTTGCAGGCCAGS144A上游AACATCACCGCGATGGCGGGCS144A下游GCCCGCCATCGCGGTGATGTTY157W上游ATGGCGTCCTATGGCTCGTCCY157W下游GGACGAGCCATAGGACGCCATI190R+T192A上游GGCGCCAGAAAGGCCGACGCCI190R+T192A下游GCCGTCGGCCTTTCTGGCGCC實(shí)施例3酶液的制備將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的親本和突變體共表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(de3)，再將獲得的重組大腸桿菌接種在小體積的LB培養(yǎng)基（含有100μg/mL的Amp），30～37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，以1～5%的接種量轉(zhuǎn)接到一定體積的LB培養(yǎng)基中（含有100μg/mL的Amp），在30～37℃繼續(xù)培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6～1.0加入終濃度為0.1mM～1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃誘導(dǎo)表達(dá)10～20h后離心收集菌體。發(fā)酵菌體懸浮于一定體積的50～100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中并超聲波破胞，離心即得含有乳酸脫氫酶與7α-類(lèi)固醇脫氫酶親本或者與7α-類(lèi)固醇脫氫酶突變體的粗酶液，可用于酶活力的測(cè)定以及3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的生物催化制備。實(shí)施例4酶活力的測(cè)定7α-類(lèi)固醇脫氫酶的酶活測(cè)定方法：以鵝去氧膽酸為底物，在一個(gè)3mL的反應(yīng)體系中加入10uL的150mM鵝去氧膽酸，100uL的稀釋酶液，NAD+終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時(shí)間，在340nm處測(cè)定吸光值增加。乳酸脫氫酶的酶活測(cè)定方法：以丙酮酸鈉為底物，在一個(gè)3mL的反應(yīng)體系中加入100uL的50mM丙酮酸鈉，100uL的稀釋酶液，NADH終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時(shí)間，在340nm處測(cè)定吸光值減少。酶活力的測(cè)定結(jié)果如表2所示，其中LDH為乳酸脫氫酶，7α-HSDH為7α-類(lèi)固醇脫氫酶。表2類(lèi)型酶活力U/ml溫度穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性LDH1089.5±15.84-45℃6.0-9.07α-HSDH親本712.2±24.34-50℃6.0-9.0D40K+L41R756.8±15.94-50℃6.0-9.5D66K+V67R1026.2±25.44-45℃6.5-9.0S144A726.4±22.54-50℃6.0-9.0Y157W789.6±17.24-55℃6.0-9.5I190R+T192A918.8±26.74-45℃6.0-9.0實(shí)施例53α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備參照前述3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法的具體實(shí)施過(guò)程，使用實(shí)施例3制備的粗酶液，酶液的投入量以酶液的重量占整個(gè)反應(yīng)體系的體積計(jì)，控制底物鵝去氧膽酸的終濃度為100mg/mL，其余各具體參數(shù)如表3所示。反應(yīng)4h～12h后測(cè)得，底物轉(zhuǎn)化率在99.8%以上，成品含量在96.8%以上，收率為85～95%。表3類(lèi)型酶液投入量（W/V）丙酮酸鈉投入量NAD+投入量反應(yīng)溫度反應(yīng)pH親本20%20mg/ml0.1mg/ml25℃8.0D40K+L41R20%20mg/ml0.075mg/ml25℃8.0D66K+V67R15%15mg/ml0.05mg/ml30℃8.5S144A20%20mg/ml0.1mg/ml25℃8.0Y157W20%20mg/ml0.1mg/ml25℃8.0I190R+T192A18%18mg/ml0.075mg/ml30℃8.0實(shí)施例63α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備總體系1L，取50g含量為99%的鵝去氧膽酸，懸浮于100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0），用10MNaOH的調(diào)節(jié)pH到8.0后加入終濃度30g/L的丙酮酸鈉，并依次加入0.09g7α-類(lèi)固醇脫氫酶凍干粉（Y157W突變體酶）和0.07g乳酸脫氫酶凍干粉，最后加入終濃度為0.1g/L的NAD，底物終濃度為50g/L。在25℃、250rpm和pH8.0左右進(jìn)行反應(yīng)6h，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.8%。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液滴加鹽酸溶液至pH為1.2，繼續(xù)攪拌30min后待冷卻過(guò)濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥得到3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸成品58g。成品用900ml無(wú)水乙醇60℃水浴條件下攪拌回流1h，過(guò)濾取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至200ml體積，再加入1L純水?dāng)嚢?h，過(guò)濾，將濾餅真空干燥過(guò)夜即得3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸精制品52g。SEQUENCELISTING<110>眉山市新功生物科技有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司<120>一種3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的制備方法及其制備用酶3<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>762<212>DNA<213>Brevundimonasnaejangsanensis<400>1atggacgcacatttccgactggatgggcacgtcgccctggtgacgggggctggcgctgga60atcggccgcgccatcgctgagaccttcgctgcggcgggcgccgcggtggccgtcaccgat120ctggacgcggccaaggccctggctgtggcggacggggttacgcaggcgggcggacgcgcc180gtcggcctggcctgcgacgtcaccgatgaagaccagcgcatcgccgccgttcaggccgtc240gtggcggcctttggcaagctgaccctgctggtgaacaatgcgggcggcggcggacccaag300ccgttcgacatgccgatgagcgatttcgagcgcgcctatcagctcaacgtcttcgccccc360ttccgtttcatgcagctgacggcgccgcatatgcaggccgcaggcggcggggcggtgctg420aacatcacctcgatggcgggcgacaacaagaacgcccgcatggcgtcctacggctcgtcc480aaggcggcggtcagccacctgacccgcaacgtcgccttcgatctcggccccgccggaatc540cgcgtcaacgccatcgcgccgggcgccatcaagaccgacgccctggccagcgtcctgacg600ccgcagatcgaagaggccatgctgaagcacaccccgctggggcggctcggaacggccgac660gacatcgcccgggcggcgctgttcctgtgttcgcccgccgcgtcctggatcagcggccag720attctgacggtctccggcggcggcgttcaggagctggactga762<210>2<211>253<212>PRT<213>Brevundimonasnaejangsanensis<400>2MetAspAlaHisPheArgLeuAspGlyHisValAlaLeuValThrGly151015AlaGlyAlaGlyIleGlyArgAlaIleAlaGluThrPheAlaAlaAla202530GlyAlaAlaValAlaValThrAspLeuAspAlaAlaLysAlaLeuAla354045ValAlaAspGlyValThrGlnAlaGlyGlyArgAlaValGlyLeuAla505560CysAspValThrAspGluAspGlnArgIleAlaAlaValGlnAlaVal65707580ValAlaAlaPheGlyLysLeuThrLeuLeuValAsnAsnAlaGlyGly859095GlyGlyProLysProPheAspMetProMetSerAspPheGluArgAla100105110TyrGlnLeuAsnValPheAlaProPheArgPheMetGlnLeuThrAla115120125ProHisMetGlnAlaAlaGlyGlyGlyAlaValLeuAsnIleThrSer130135140MetAlaGlyAspAsnLysAsnAlaArgMetAlaSerTyrGlySerSer145150155160LysAlaAlaValSerHisLeuThrArgAsnValAlaPheAspLeuGly165170175ProAlaGlyIleArgValAsnAlaIleAlaProGlyAlaIleLysThr180185190AspAlaLeuAlaSerValLeuThrProGlnIleGluGluAlaMetLeu195200205LysHisThrProLeuGlyArgLeuGlyThrAlaAspAspIleAlaArg210215220AlaAlaLeuPheLeuCysSerProAlaAlaSerTrpIleSerGlyGln225230235240IleLeuThrValSerGlyGlyGlyValGlnGluLeuAsp245250<210>3<211>996<212>DNA<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>3atgaagatcttcgcgtacggtattcgtgaagacgagcagccggcgctgaaagcgtggatc60gcggcgcacccggaagtgaccgttgaattcaccgaccaactgctggatccggagaccgcg120aagctggcggaaggctttgacgcggtgaacgtttaccagcaactggattatacccgtgag180accctgaccgcgctgcacgaactgggtatcaacaaaatgagcctgcgtaacgttggcacc240gacaacattgactttgatgcggcgcgtgagttcgattttagcatcagcaacgtgccggtt300tatagcccgaacgcgattgcggaacacagcatcattcagatgagccgtctgctgcgtcgt360accaaggcgatggacgcgaaggtggcgaaacacgatctgcgttgggcgccgaccatcggt420cgtgagatgcgtatgcaaaccgtgggtgttatcggtaccggcaacattggccgtgttgcg480atgaagatcctgaaaggtttcggcgcgaaagtgattgcgtacgacctgtatcacaacgcg540gaagttgaggcggaaggtctgtacgtggacaccctggaggaactgtatgcgcaggcggat600gttattaccctgtacgtgccgggcgttccggcgaatcaccacatgatcaacgcggacagc660attgcgaagatgaaagatggtgtggttatcgttaactgcagccgtggcaacctgatggac720atcgacgatgtgattgcgggtctggatagcggcaagattagcgactttgcgatggatgtg780tatgaggaagaggttggtctgttcaacgtggattggagcaacaaggagtttccggacgcg840aaaatcgcggatctgattgcgcgtgaaaacgtgctggttaccccgcacaccgcgttctac900accaccaaggcggtgctggaaatggttacccaaagcatgaacgcgagcctggcgtttatc960aacggcgagaaaccgagcattgcggtggaatattaa996<210>4<211>331<212>PRT<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>4MetLysIlePheAlaTyrGlyIleArgGluAspGluGlnProAlaLeu151015LysAlaTrpIleAlaAlaHisProGluValThrValGluPheThrAsp202530GlnLeuLeuAspProGluThrAlaLysLeuAlaGluGlyPheAspAla354045ValAsnValTyrGlnGlnLeuAspTyrThrArgGluThrLeuThrAla505560LeuHisGluLeuGlyIleAsnLysMetSerLeuArgAsnValGlyThr65707580AspAsnIleAspPheAspAlaAlaArgGluPheAspPheSerIleSer859095AsnValProValTyrSerProAsnAlaIleAlaGluHisSerIleIle100105110GlnMetSerArgLeuLeuArgArgThrLysAlaMetAspAlaLysVal115120125AlaLysHisAspLeuArgTrpAlaProThrIleGlyArgGluMetArg130135140MetGlnThrValGlyValIleGlyThrGlyAsnIleGlyArgValAla145150155160MetLysIleLeuLysGlyPheGlyAlaLysValIleAlaTyrAspLeu165170175TyrHisAsnAlaGluValGluAlaGluGlyLeuTyrValAspThrLeu180185190GluGluLeuTyrAlaGlnAlaAspValIleThrLeuTyrValProGly195200205ValProAlaAsnHisHisMetIleAsnAlaAspSerIleAlaLysMet210215220LysAspGlyValValIleValAsnCysSerArgGlyAsnLeuMetAsp225230235240IleAspAspValIleAlaGlyLeuAspSerGlyLysIleSerAspPhe245250255AlaMetAspValTyrGluGluGluValGlyLeuPheAsnValAspTrp260265270SerAsnLysGluPheProAspAlaLysIleAlaAspLeuIleAlaArg275280285GluAsnValLeuValThrProHisThrAlaPheTyrThrThrLysAla290295300ValLeuGluMetValThrGlnSerMetAsnAlaSerLeuAlaPheIle305310315320AsnGlyGluLysProSerIleAlaValGluTyr325330當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3