本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體涉及沙門氏菌噬菌體和噬菌體抗菌組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根據(jù)我國的食源性疾病檢測體系數(shù)據(jù)顯示，由食源性微生物引起的食品安全問題所占構(gòu)成比達(dá)43％。而其中由沙門氏菌引起的食源性疾病爆發(fā)數(shù)量占70％-80％。近十年(2004-2015)美國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)各地區(qū)食源性疾病暴發(fā)報(bào)告顯示，全球沙門氏菌引起食源性疾病暴發(fā)率逐年上升，暴發(fā)位列第一。而世界衛(wèi)生組織(WHO)則將沙門氏菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原菌并已組建全球沙門氏菌監(jiān)測網(wǎng)(WHO-GSS)，加強(qiáng)了對沙門氏菌污染的監(jiān)控。沙門氏菌分布廣泛，血清型多達(dá)2500余種，以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌這2種對人和動(dòng)物均有致病性的沙門氏菌引發(fā)沙門氏菌病的病例最多，多發(fā)于夏秋季?？赏ㄟ^腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血液引發(fā)敗血癥，并產(chǎn)生內(nèi)毒素，引發(fā)急性腸胃炎，食物中毒等疾病。肉與肉制品，蛋制品，乳制品，水產(chǎn)品及速凍食品是食源性沙門氏菌在食品體系中污染的主要來源。此外，由以上原材料或制品可能在食品運(yùn)輸、儲藏和加工操作過程給其他產(chǎn)品如果蔬帶來交叉污染，增加病原擴(kuò)散和引起感染的風(fēng)險(xiǎn)。

目前對于食源性病原的控制，可以大致在兩個(gè)階段進(jìn)行控制：對于“收獲前”階段，也就是對于生產(chǎn)肉禽制品，乳制品的動(dòng)物，主要采用化學(xué)藥物(抗生素和抑菌化合物)、疫苗免疫，或剔除隔離病原陽性畜禽的方法來起到預(yù)防和控制病原的作用；對于“收獲后”階段的產(chǎn)品，也就是食品原材料和制品，主要通過化學(xué)方法(如：消毒劑、抗生素和抑菌物質(zhì))和物理方法(如：加熱、射線和低溫)來消除或控制病原。

添加化合物進(jìn)行抑菌的化學(xué)方法目前在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)收到極大的質(zhì)疑和甚至禁止。如，2006年，歐盟全面禁用抗生素和生長促進(jìn)劑在畜禽飼料中使用。物理方法中通過射線進(jìn)行殺菌的方法的安全性一直存在爭議，同時(shí)需要特殊設(shè)備，其應(yīng)用也遭受質(zhì)疑。最常用的熱殺菌方法在某些食品原料、半成品或者制品中卻無法應(yīng)用，例如需要保持生鮮的原料畜禽肉、生鮮果蔬，以及生鮮雞蛋和液蛋，他們在送達(dá)消費(fèi)者和加工地之前不合適通過熱處理殺菌。通過保持低溫處理以上食品原料或成品的方法僅僅只能一定程度上抑制病原生長增殖，卻不能殺滅病原，在合適的條件下，他們依然具有感染和導(dǎo)致交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

目前國際上開始嘗試使用噬菌體來預(yù)防和控制食源性病原菌。例如，2006年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)ListShield^TM噬菌體產(chǎn)品可作為食品添加劑，用于即食食品和禽肉制品中控制單核細(xì)胞增生李斯特菌污染。噬菌體是一類能特異性感染細(xì)菌且增殖速度快的病毒。其中烈性噬菌體通過特異性識別宿主菌細(xì)菌，在宿主菌體內(nèi)大量繁殖并最終裂解釋放大量子代噬菌體起到抑菌的效果。

本研究小組研發(fā)了一種利用噬菌體防控的方法來預(yù)防和控制沙門氏菌。噬菌體具有以下優(yōu)點(diǎn)，使得其能夠在預(yù)防沙門氏菌傳播過程中發(fā)揮作用：

(1)其特異性強(qiáng)，不影響機(jī)體正常菌群；

(2)綠色環(huán)保，噬菌體是由蛋白質(zhì)及核酸組成的小分子，對人或動(dòng)物來講并非異源物質(zhì)，其進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程可被視為自然過程，對環(huán)境無污染；

(3)一次使用可實(shí)現(xiàn)多次預(yù)防，噬菌體可以實(shí)現(xiàn)自我繁殖，無論在動(dòng)物還是在產(chǎn)品上均可實(shí)現(xiàn)一次使用可以實(shí)現(xiàn)多次預(yù)防；

(4)可攜帶性強(qiáng)。制備成制劑之后，不需要依賴特殊儀器設(shè)備和條件，不需要特殊保存環(huán)境。

(5)應(yīng)用范圍廣，不受應(yīng)用對象和場所限制?？蓱?yīng)用于畜禽養(yǎng)殖過程和場所、畜禽屠宰加工設(shè)備和場所、食品原材料運(yùn)輸設(shè)備、食品加工設(shè)備、食品原材料、半成品和成品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體LPSE1，所述的沙門氏菌噬菌體已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：腸炎沙門氏菌噬菌體(Salmonella enteritidis bacteriophage)LPSE1，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016472，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國 武漢 武漢大學(xué)。

本發(fā)明的目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體LPST10，所述的沙門氏菌噬菌體已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(Salmonella typhimurium bacteriophage)LPST10，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016473，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國 武漢 武漢大學(xué)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體混合物，該混合物包括沙門氏菌噬菌體LPSE1和LPST10，該組合物的兩種噬菌體之間存在協(xié)同作用，對沙門氏菌有良好的抑制作用。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體LPSE1的應(yīng)用，包括將該噬菌體用于抑制食品中沙門氏菌的污染，或制備用于抑制沙門氏菌的藥物。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體LPST10的應(yīng)用；包括將該噬菌體用于抑制食品中沙門氏菌的污染，或制備用于抑制沙門氏菌的藥物。

本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了一種沙門氏菌噬菌體混合物的應(yīng)用，包括將該噬菌體用于抑制食品中沙門氏菌的污染，或制備用于抑制沙門氏菌的藥物。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

發(fā)明人自污水中分離得到兩株沙門氏菌噬菌體，分別命名為沙門氏菌噬菌體LPSE1和沙門氏菌噬菌體LPST10。

所述的沙門氏菌噬菌體LPSE1已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：腸炎沙門氏菌噬菌體(Salmonella enteritidis bacteriophage)LPSE1，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016472，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國 武漢 武漢大學(xué)。

所述的沙門氏菌噬菌體LPST10已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(Salmonella typhimurium bacteriophage)LPST10保藏號為：CCTCC N O：M 2016473，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國 武漢 武漢大學(xué)。

兩種噬菌體在固體平板上均可以形成較大透亮空斑，邊緣清晰規(guī)則。其中噬菌體LPSE1可形成具有2mm噬菌斑,而噬菌體LPST10在固體平板上直徑在0.5mm左右。

所述的噬菌體LPSE1和LPST10無論是單獨(dú)使用還是混合使用，均能用于制備食品抑菌劑或沙門氏菌抑制劑。

具體方案詳見具體實(shí)施方式。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)經(jīng)富集后的噬菌體原液效價(jià)高。在本發(fā)明中，噬菌體LPSE1和LPST10的效價(jià)≥10⁹pfu/mL。

(2)在不同條件下，裂菌能力強(qiáng)。在本發(fā)明中，分別比較了噬菌體LPSE1和LPST10在MOI＝10，MOI＝1，MOI＝0.1，MOI＝0.01，MOI＝0.001的條件下對腸炎沙門氏菌ATCC13076和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌作用，并發(fā)現(xiàn)在不同的MOI條件下均具有一定的活性。

(3)pH范圍更廣。在本發(fā)明中，噬菌體LPST10的pH穩(wěn)定性范圍3-13；噬菌體LPSE1的pH穩(wěn)定性4-12，無論是LPST10單獨(dú)使用還是兩者聯(lián)合使具有較寬的pH適用范圍。

(4)熱穩(wěn)定性好。在本發(fā)明中，噬菌體LPST10和LPSE1在30-60℃效價(jià)基本不變。

綜上所述，本生物制劑包含能有效抑制、裂解沙門氏菌的噬菌體，該制劑不僅能在動(dòng)物處于活體狀態(tài)的時(shí)候使用以預(yù)防沙門氏菌，也可以在動(dòng)物成為食品原料或產(chǎn)品進(jìn)行應(yīng)用，還可以應(yīng)用于養(yǎng)殖、和食品生加工場地。

附圖說明

圖1：沙門氏菌噬菌體LPSE1雙層平板噬菌斑圖。

圖2：沙門氏菌噬菌體LPST10雙層平板噬菌斑圖。

圖3：噬菌體LPSE1裂解不同血清型沙門氏菌的宿主譜陽性結(jié)果圖；

其中：圖3中A表示ATCC13076，圖3中B表示SJTUF10978，圖3中C表示SJTUF10984，圖3中D表示ATCC14028，圖3中E表示ATCC13311，圖3中F表示CMCC50094。

圖4：噬菌體LPST10裂解不同血清型沙門氏菌的宿主譜陽性結(jié)果圖；

其中：圖4中A表示ATCC13076，圖4中B表示SJTUF10978，圖4中C表示SJTUF10984，圖4中D表示ATCC14028，圖4中E表示ATCC13311，圖4中F表示CMCC50094。

圖5：沙門氏菌噬菌體LPSE1的電鏡觀察圖。

圖6：沙門氏菌噬菌體LPST10的電鏡觀察圖。

圖7：沙門氏菌噬菌體LPSE1的生長曲線。

圖8：沙門氏菌噬菌體LPST10的生長曲線。

圖9：在MOI值為10條件下，噬菌體LPSE1和LPST10組合物對腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌裂菌能力結(jié)果圖。

圖10：不同pH對噬菌體LPSE1的作用結(jié)果圖。

圖11：不同pH對噬菌體LPST10的作用結(jié)果圖。

圖12：不同溫度對噬菌體LPSE1的作用結(jié)果圖。

圖13：不同溫度對噬菌體LPST10的作用結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

實(shí)施例中2×YT培養(yǎng)基的配制方法為：蛋白胨1.6g，酵母浸粉1.0g，NaCl 0.5g，加蒸餾水至100mL。

實(shí)施例1:

沙門氏菌噬菌體的篩選、純化及保藏

1、沙門氏菌噬菌體的篩選

取污水樣品10mL，用直徑為0.22μm的微孔濾器過濾。分別加入至裝有20mL 2×YT培養(yǎng)基的50mL滅菌三角瓶中，另加入培養(yǎng)至對數(shù)期的敏感指示菌菌液5mL。37℃振蕩培養(yǎng)12-18h使樣品中可能存在的噬菌體達(dá)到增殖富集的效果。

將上述培養(yǎng)液于50mL離心管中，以4℃下，8000×g離心15min，取上清液用0.22μL的濾膜過濾。按照上述方法加入滅菌的培養(yǎng)基及對數(shù)生長期宿主菌菌液反復(fù)富集三次。分別采用點(diǎn)樣法，涂布法初步驗(yàn)證：有明顯空斑樣品進(jìn)一步采用雙層平板法，經(jīng)梯度稀釋，觀察噬菌斑形態(tài)，最終獲得兩株噬菌體，分別為噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10，結(jié)果如圖1和圖2所示。

2、噬菌體原液的無菌檢測

取噬菌體分離所得原液8000×g離心15min，4℃；小心取上清，用0.22μm濾膜過濾。取濾液均勻涂布于固體瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)12h后觀察平板上有無菌落。

3、噬菌體的擴(kuò)增培養(yǎng)和純化

采用固體增殖法，在培養(yǎng)噬菌體原液的雙層平板中挑取相對獨(dú)立、大而邊緣光滑的噬菌斑，接種于1mL 2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)8h左右。4℃下，8000×g離心15min，0.22μm濾膜過濾除菌，將噬菌體原液按照細(xì)菌平板劃線的方法分離，按從稀釋倍數(shù)高向稀釋倍數(shù)低的方向加入混有200μL菌液的上層培養(yǎng)基。重復(fù)上述步驟3-5次反復(fù)純化噬菌體，直至得到大小較均一的噬菌斑，即為純化的噬菌體。并利用雙層平板法測定所分離噬菌體的效價(jià)。

4、噬菌體的保藏

采用液體增殖法，以MOI值為1的比例分別加入效價(jià)為10⁹pfu/mL噬菌體液10μL及菌數(shù)為10⁸cfu/mL對應(yīng)培養(yǎng)至對數(shù)期的宿主菌100μL(對于噬菌體LPSE1于其宿主菌腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis ATCC13076中培養(yǎng)；而噬菌體LPST10于其宿主菌鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium ATCC14028中培養(yǎng))，接種于5mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃充分振蕩過夜培養(yǎng)。在4℃條件下，8000×g離心15min。小心取上清，用0.22μm濾膜過濾后分裝至無菌小管。此時(shí)兩種噬菌體效價(jià)均≥10⁹pfu/mL采用-80℃(含18％甘油)保藏。

本發(fā)明的兩個(gè)沙門氏菌噬菌體的形態(tài)特征：兩種噬菌體在固體平板上均可以形成較大透亮空斑，邊緣清晰規(guī)則。其中噬菌體LPSE1可形成具有2mm噬菌斑,而噬菌體LPST10在固體平板上直徑在0.5mm左右。

純化的腸炎沙門氏菌噬菌體LPSE1已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：腸炎沙門氏菌噬菌體(Salmonella enteritidis bacteriophage)LPSE1保藏號為：CCTCC NO：M 2016472，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國武漢武漢大學(xué)。

純化的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體LPST10已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：

鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(Salmonella typhimurium bacteriophage)LPST10保藏編號為：CCTCC NO：M 2016473，保藏日期為2016年9月9日，地址：中國武漢武漢大學(xué)。

實(shí)施例2：

宿主譜的測定：

試驗(yàn)選擇8種沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和7種其他種屬菌株來做噬菌體LPSE1和LPST10的宿主譜分析，具體操作如下：

分別培養(yǎng)宿主菌菌株至對數(shù)期。取100μL對數(shù)期上述菌液。待上層瓊脂溫度降至46℃左右時(shí)，取3mL上層瓊脂與菌液混勻，倒入15mL下層瓊脂培養(yǎng)基上。靜置晾干約10min，待上層培養(yǎng)基凝固后，滴加5μL各噬菌體液，另取5μL生理鹽水做對照組，隔夜觀察。

結(jié)果如表1所示，表中“++++”“+++”“++”“+”“-”分別表示完全清澈；澄清但有依稀朦朧的背景；澄清區(qū)域大幅混濁；多個(gè)獨(dú)立斑塊；無澄清現(xiàn)象，但可能會在槍頭接觸處由于接觸有一個(gè)小斑點(diǎn)。

結(jié)果顯示：噬菌體LPSE1和LPST10可裂解多種不同血清型的沙門氏菌，可裂解腸炎沙門氏菌ATCC 13076，腸炎沙門氏菌SJTUF 10978，腸炎沙門氏菌SJTUF 10984，鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028，鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，乙型副傷寒沙門氏菌CMCC 50094，可裂解6種不同的沙門氏菌，表現(xiàn)出廣譜性；對所收集的15株細(xì)菌中的6株有裂解作用，裂解率為40％。但所有沙門氏菌噬菌體均不能裂解金黃色葡萄球菌，李斯特菌，副溶血弧菌，大腸桿菌，具有種屬間特異性。

表1噬菌體LPSE1和LPST10宿主譜的測定

實(shí)施例3：

噬菌體的電鏡觀察

噬菌體原液經(jīng)50,000×g低溫超速離心后，于1mL SM緩沖液重懸，冰浴靜置1-2小時(shí)。分別取50μL樣品(10⁸-10¹⁰pfu/mL)和50uL體積分?jǐn)?shù)2％，pH 7.0的磷鎢酸(phosphotun gstic acid，PTA)滴加在封口膜上。輕取銅網(wǎng)，置于樣品液滴中靜置沉淀5-10min，吸去多余液體。取出銅網(wǎng)，靜置5min,左右至銅網(wǎng)上的懸浮液將要干燥但未完全干燥之際，用鑷子將銅網(wǎng)置于磷鎢酸(PTA)染料中染色3min后吸去多余液體，自然晾干至完全干燥，在透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)，并用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小。

結(jié)果如圖5-6所示，經(jīng)純化后的噬菌體LPSE1頭部呈二十面體結(jié)構(gòu)，經(jīng)純化后的噬菌體LPSE1頭部呈二十面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約70nm,噬菌體含收縮性尾，尾寬16.6nm，尾長116.6nm。

噬菌體LPST10頭部呈二十面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約83.26nm,噬菌體含收縮性尾，尾寬10.9nm,尾長144.89nm。噬菌體LPSE1和LPST10均符合肌尾病毒科(Myoviridae)特征。

實(shí)施例4：

噬菌體生長曲線的繪制

1、制備對數(shù)生長早期的宿主菌菌液：

對于噬菌體LPSE1，宿主菌為腸炎沙門氏菌ATCC13076(本發(fā)明或簡稱為13076)；對于噬菌體LPST10，宿主菌為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028(本發(fā)明或簡稱為14028)；以不含細(xì)菌的2×YT液為空白調(diào)零，測定其OD₆₀₀值為0.4-0.5，計(jì)算菌液濃度。

2、取上述經(jīng)稀釋的宿主菌菌液1mL，按最佳感染復(fù)數(shù)(MOI＝0.01)的比例加入10⁸pfu/mL噬菌體10μL，混勻，37℃溫育15min后4℃下，7000×g離心2min，盡量棄去上清，用1ml 2×YT液洗滌2次，棄上清。用2×YT培養(yǎng)基等體積重懸，

3、取50μL重懸液于經(jīng)37℃預(yù)熱的50mL 2×YT培養(yǎng)基中并充分混勻，迅速置于37℃搖床中160rpm/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0時(shí)刻和每隔10min取樣50μL，13,000×g離心30sec，立刻吸取上清液20μL于180μL 2×YT培養(yǎng)基作梯度稀釋。按上述操作每間隔10分鐘，選擇合適的稀釋梯度，測定噬菌體效價(jià)。

結(jié)果如圖7和圖8所示，噬菌體LPSE1在0-30min噬菌體潛伏期約為30min，30～110min處于裂解期，裂解時(shí)間約為90min，裂解量為94pfu/cfu。而噬菌體LPST10在0-30min噬菌體潛伏期約為30min，30～60min處于裂解期，裂解時(shí)間約為50min，裂解量為101pfu/cfu。

實(shí)施例5：

噬菌體及噬菌體組合物裂菌能力的評價(jià)

1、測定沙門氏菌菌數(shù)與OD₆₀₀值的關(guān)系以及測定噬菌體效價(jià)。

對于噬菌體LPSE1，接種腸炎沙門氏菌ATCC13076；對于噬菌體LPST10，接種鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。培養(yǎng)8小時(shí)左右至對數(shù)期，取200μL測定其OD₆₀₀值，并同時(shí)測定其菌數(shù)。確定在該OD₆₀₀值條件下，所含菌數(shù)的數(shù)量級。

兩種沙門氏菌的混合液以腸炎沙門氏菌ATCC13076(濃度為10⁸cfu/mL)和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028(濃度為10⁸cfu/mL)按體積比1:1(v:v)比例混合所得混合液。

測定噬菌體效價(jià)：稀釋至合適梯度，通過雙層平板法測定效價(jià)。

2、噬菌體裂菌能力曲線的繪制

取噬菌體液LPSE1，LPST10梯度稀釋至10⁵pfu/mL，分別按照MOI＝10,1,0.1,0.01,0.001加入100μl經(jīng)梯度稀釋后對應(yīng)濃度的噬菌體液至實(shí)驗(yàn)組，并加入100μL對數(shù)期沙門氏菌菌液混勻，所述的沙門氏菌菌液的濃度為10⁸cfu/mL。

噬菌體組合物以MOI＝10添加100μL至不同的100μL宿主菌液(宿主菌液中的菌濃度為10⁸cfu/mL)中，所述的噬菌體組合物為LPSE1：LPST10＝1：1(pfu/pfu)；當(dāng)宿主菌液為13076和14028的混合物時(shí)，13076和14028的比例為1:1(cfu/cfu)。

另設(shè)空白組(Blank)加入200μL 2×YT培養(yǎng)基；

對照組(negative control)：100μL對數(shù)期沙門菌菌液(OD₆₀₀為0.4左右)和100μL培養(yǎng)基；

噬菌體空白組(only contain phages)：僅加入噬菌體液(濃度為10⁹pfu/mL)100μL和100μL 2×YT培養(yǎng)基。

酶標(biāo)儀設(shè)定：λ＝600nm，Settle time：20ms，T＝37.0℃，每間隔1h測定OD₆₀₀的變化。在測定過程中，用回旋振蕩器(orbital shaker TS-2)于37℃混勻樣品，控制轉(zhuǎn)速為160rpm。

表2噬菌體LPSE1在不同MOI值下的裂菌能力

表3噬菌體LPST10在不同MOI值下的裂菌能力

結(jié)果如表2-3所示，在6h內(nèi)，與對照組相比，噬菌體LPSE1和LPST10在不同MOI值下均表現(xiàn)出良好的抑菌能力。MOI值越高，OD₆₀₀值下降越快，保持在較低水平，表現(xiàn)出的抑菌作用越明顯。對于噬菌體LPSE1，當(dāng)MOI<1時(shí)，在0-2小時(shí)內(nèi)OD₆₀₀值升高，在2小時(shí)后，OD₆₀₀值開始下降并保持在低于0.1的水平。而當(dāng)MOI≥1時(shí)，OD₆₀₀值在6小時(shí)內(nèi)一直保持在較低水平，沙門氏菌生長一直受到抑制。

對于噬菌體LPST10，當(dāng)MOI≥1時(shí)，在6小時(shí)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組沙門氏菌生長一直受到明顯抑制。而當(dāng)MOI<1時(shí)，在2小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組的沙門氏菌數(shù)量開始明顯減少且明顯低于對照組。

表4噬菌體及噬菌體組合物對腸炎沙門氏菌ATCC13076的抑菌作用(MOI＝10)

表5噬菌體及噬菌體組合物對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌作用(MOI＝10)

結(jié)果如上表4-5所示，對于腸炎沙門氏菌ATCC13076，當(dāng)加入噬菌體LPSE1和LPST10(1:1)組合物時(shí)，OD₆₀₀值在9小時(shí)后為0.082<0.1，低于僅加入噬菌體LPSE1的實(shí)驗(yàn)組(OD₆₀₀值為0.308)，和僅加入噬菌體LPST10的實(shí)驗(yàn)組(OD₆₀₀值為0.450)，遠(yuǎn)小于對照組OD₆₀₀值0.622，故當(dāng)同時(shí)加入噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10時(shí)在9小時(shí)內(nèi)對腸炎沙門氏菌AT CC13076有明顯的抑制效果，優(yōu)于僅加入單一噬菌體LPSE1或者LPST10。

而對于鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，當(dāng)加入噬菌體組合物9小時(shí)后，其OD₆₀₀值為0.274，低于僅加入單一噬菌體LPSE1(OD₆₀₀值為0.378)或者LPST10(OD₆₀₀值為0.308)的實(shí)驗(yàn)組，也低于對照組。故當(dāng)同時(shí)加入噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10時(shí)在9小時(shí)內(nèi)對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028有明顯的抑制效果，優(yōu)于僅加入單一噬菌體LPSE1或者LPST10。

表6噬菌體及噬菌體組合物對兩種沙門氏菌ATCC13076和ATCC14028的抑菌作用(MOI＝10)

結(jié)果如上表6所示，噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10在6小時(shí)內(nèi)OD₆₀₀值分別達(dá)到0.20和0.29，低于對照組OD₆₀₀值0.44，故噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10均能對兩種沙門氏菌(腸炎沙門氏菌ATCC13076和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028)有抑制作用。而當(dāng)同時(shí)加入噬菌體組合物(按1：1比例加入腸炎沙門氏菌噬菌體LPSE1和鼠傷寒沙門氏菌LPST10)，在6小時(shí)后OD₆₀₀值為0.046<0.05，遠(yuǎn)低于對照組0.44，低于僅加入噬菌體LPSE1(OD₆₀₀值為0.20)和噬菌體LPST10(OD₆₀₀值為0.29)的實(shí)驗(yàn)組。說明，以兩種噬菌體組合物的形式添加能更有效抑制兩種沙門氏菌的生長(圖9)。

實(shí)施例6：

噬菌體pH穩(wěn)定性的測定

取不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的緩沖蛋白胨水(BPW)900μL，置于37℃的恒溫水浴中預(yù)熱。待溫度平衡后加入100μL噬菌體純培養(yǎng)液(效價(jià)為10⁸pfu/mL)，37℃恒溫作用2h。待作用時(shí)間結(jié)束，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將樣品做適當(dāng)稀釋后采用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。

結(jié)果如圖10-11所示，,噬菌體LPSE1在pH為4-12之間穩(wěn)定于10⁸pfu/mL，在pH<3時(shí)噬菌體效價(jià)降為0，在pH＝13時(shí)，噬菌體效價(jià)為13pfu/mL，效價(jià)明顯降低，pH為14時(shí)降為0。而噬菌體LPST10在pH為3-13之間時(shí)，噬菌體的效價(jià)穩(wěn)定于10⁸pfu/mL，噬菌體在pH<3或者pH>13時(shí)效價(jià)為0.

表明噬菌體LPSE1在pH在4-12穩(wěn)定，噬菌體LPST10在pH在3-13之間穩(wěn)定，均表現(xiàn)出良好的pH穩(wěn)定性。

實(shí)施例7：

噬菌體熱穩(wěn)定性的測定

用沙門氏菌噬菌體LPSE1和LPST10原液，取100μL效價(jià)為10⁷pfu/mL的噬菌體，加入900μL經(jīng)預(yù)熱的2×YT培養(yǎng)基中；分別于30-80℃，恒溫作用30/60min,充分混勻；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇合適稀釋倍數(shù)倒平板，測定不同處理方式下的噬菌體效價(jià)。

結(jié)果如圖12-13所示，噬菌體LPSE1在30-60℃效價(jià)穩(wěn)定于10⁷pfu/mL，70℃時(shí)處理30min內(nèi)效價(jià)開始降低至10⁵pfu/mL，80℃處理60分鐘后下降為0。表明噬菌體LPSE1在30-60℃內(nèi)較為穩(wěn)定。

噬菌體LPST10在30-60℃噬菌體效價(jià)維持在10⁷pfu/mL，在70℃處理30min后噬菌體效價(jià)下降4.06log pfu/mL，處理60min后噬菌體效價(jià)下降4.17log pfu/mL。與LPSE1相比，噬菌體LPST10在70℃時(shí)，下降更快。80℃處理30min內(nèi)噬菌體效價(jià)降為0。

表明噬菌體LPSE1和噬菌體LPST10均在30-60℃之間效價(jià)均穩(wěn)定在10⁷pfu/mL，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。

實(shí)施例8：

低溫4℃及室溫28℃條件下，噬菌體以不同MOI值(MOI＝1，MOI＝100)加入牛奶中的抑菌效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組分別測定牛奶在4℃和28℃下噬菌體的抑菌效果。先將對照組和實(shí)驗(yàn)組的樣品分別于置于對應(yīng)溫度條件下靜置15min-20min。

對于噬菌體LPSE1加入對應(yīng)宿主菌腸炎沙門氏菌ATCC13076；

噬菌體LPST10加入宿主菌鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。

在4℃和28℃條件下，再分別將實(shí)驗(yàn)組分為2組，分別以MOI＝1的比例，取10⁷cfu/mL菌液10μL于1mL滅菌后牛奶中；而另一組以MOI＝100的比例，取10⁵cfu/mL菌液10μL于1mL滅菌后牛奶中；

實(shí)驗(yàn)組加入100μL噬菌體液(效價(jià)為10⁶pfu/mL)。另設(shè)置不加噬菌體液，加入等體積(100μL)SM緩沖液的對照組。

兩組分別于對應(yīng)溫度(4℃和28℃)下培養(yǎng)0，1，2，4，6小時(shí)后取出，經(jīng)11,000×g離心10分鐘，分別取上清，測定噬菌體效價(jià)；后用渦旋儀混勻，測定對照組及實(shí)驗(yàn)組宿主菌菌數(shù)的變化。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)以噬菌體效價(jià)和菌數(shù)減少量為指標(biāo)。

對于噬菌體LPST10組，

MOI＝1時(shí)：

在4℃條件下，在加入噬菌體LPST10的牛奶中，在6小時(shí)后，菌數(shù)與初始菌數(shù)相比降低0.31log cfu/mL；與對照組相比減少1.07log cfu/mL。

在28℃條件下，在加入噬菌體LPST10的實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)與初始加入菌數(shù)相比，下降1.09log cfu/mL；相比對照組降低3.95log cfu/mL，殺菌效率達(dá)47.9％。

MOI＝100時(shí)：

在4℃條件下，實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)與初始菌數(shù)相比，下降0.84log cfu/mL；相比對照組降低1.22log cfu/mL。

在28℃條件下，在加入噬菌體LPST10兩小時(shí)內(nèi)，菌數(shù)生長受到抑制；而6小時(shí)后，菌數(shù)明顯下降2.05log cfu/mL，與對照組相比，減少5.12log cfu/mL，殺菌效率達(dá)80.4％。對于噬菌體LPSE1組，

MOI＝1時(shí)：

在4℃條件下，噬菌體LPSE1在牛奶中處理6h后實(shí)驗(yàn)組比對照組下降0.24log cfu/mL。處理2h，4h，6h后，殺菌效率分別達(dá)5.8％，5.4％，4.4％；

在28℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入噬菌體LPSE1后，菌數(shù)與對照組菌數(shù)相比，減少2.02log cfu/mL，殺菌效率達(dá)26.37％。

MOI＝100時(shí)：

在4℃條件下，菌數(shù)在6小時(shí)后維持在3.31log cfu/mL，與對照組基本一致。

在28℃條件下，噬菌體LPSE1在牛奶中加入噬菌體處理6小時(shí)后宿主菌菌數(shù)與對照組相比減少1.02log cfu/mL，殺菌效率達(dá)17.11％。

說明這兩種噬菌體在MOI＝1和100時(shí)，均可有效抑制牛奶中腸炎沙門氏菌ATCC13076和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的污染。

實(shí)施例9：

低溫4℃及室溫28℃條件下，噬菌體以不同MOI值加入火腿上的抑菌效果實(shí)驗(yàn)

取火腿于無菌操作臺中切成直徑為2mm，厚度為1mm大小。分為對照組和實(shí)驗(yàn)組兩組。置于平板上編號4片/皿，共需8皿。

實(shí)驗(yàn)組分別測定火腿在4℃和28℃下噬菌體LPSE1和LPST10的抑菌效果。

在對應(yīng)溫度(4℃和28℃)下，分別以MOI值為1和100比例加入宿主菌。

噬菌體LPSE1加入對應(yīng)宿主菌腸炎沙門氏菌ATCC13076；

噬菌體LPST10加入宿主菌鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。

而當(dāng)以MOI值為1的比例，滴加10⁷cfu/mL菌液50μL；而當(dāng)MOI值為100時(shí)，滴加10⁵cfu/mL菌液50μL至火腿表面，靜置風(fēng)干15-20min,；

向?qū)嶒?yàn)組火腿滴加10⁷cfu/mL噬菌體液50μL，而對照組則滴加同體積的SM緩沖液。

分別在對應(yīng)溫度(4℃和28℃)下培養(yǎng)0，1，2，4，6小時(shí)，用無菌鑷子取對應(yīng)平板上火腿于5mL緩沖液中，用超聲清洗機(jī)在功率為96W的條件下清洗15分鐘。取出火腿，將洗液用渦旋儀充分混勻30秒。選擇合適的稀釋梯度，分別測定噬菌體效價(jià)及對照組和實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)的變化。

對于噬菌體LPST10組，

當(dāng)MOI＝1時(shí)：

在4℃條件下，4h后，加入噬菌體LPST10的實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)相比于對照組下降2.09log cfu/sample，殺菌效率達(dá)29.6％。

在28℃條件下，噬菌體LPST10在4h和6h后，菌數(shù)下降1.55log pfu/sample和0.98log pfu/sample，殺菌效率達(dá)16.7％。

當(dāng)MOI＝100時(shí)：

在4℃條件下，加入噬菌體LPST10的實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)生長明顯受到抑制，下降0.46log cfu/sample，從初始加入菌數(shù)比較，降低0.23log cfu/sample。

在28℃條件下，噬菌體LPST10在火腿中6小時(shí)后，與對照組相比下降1.52log cfu/sample，殺菌效率達(dá)33.6％；

對于噬菌體LPSE1組，

當(dāng)MOI＝1時(shí)：

在4℃條件下，加入噬菌體LPSE1的實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)相比于對照組下降0.6log cfu/sample，殺菌效率達(dá)10.8％。

在28℃條件下噬菌體LPSE1在火腿中6小時(shí)后菌數(shù)降低1.86log cfu/sample。殺菌效率達(dá)28.8％。

當(dāng)MOI＝100時(shí)：

在4℃條件下，加入噬菌體的實(shí)驗(yàn)組，與對照組相比菌數(shù)降低0.35log cfu/sample，殺菌效率達(dá)9.3％。

在28℃條件下，噬菌體LPSE1在火腿中在28℃條件下與對照組相比菌數(shù)降低1.74log cfu/sample，同時(shí)噬菌體效價(jià)增加0.79log pfu/sample。

說明這兩種噬菌體在MOI＝1和MOI＝100時(shí)可分別針對腸炎沙門氏菌ATCC13076和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，有效抑制火腿中這兩種血清型沙門氏菌的污染。

實(shí)施例10：

在室溫條件下，噬菌體以不同MOI值在生菜上的抑菌效果實(shí)驗(yàn)

生菜的預(yù)處理：用自來水洗干凈后，再用酒精棉擦拭1遍，得到表面基本無菌的生菜樣品，用滅菌鉆孔器在無菌的砧板上將生菜制成直徑為1.5cm的圓片，之后用滅菌的培養(yǎng)皿裝好樣品，置于超凈臺紫外燈下光照20min滅菌處理，得到無菌生菜樣品。

將樣品置于無菌培養(yǎng)皿中央，平放好，平整的試驗(yàn)切面朝上，用移液槍對于噬菌體LP SE1取10⁵cfu/mL對應(yīng)宿主菌腸炎沙門氏菌ATCC13076 10μL；對于噬菌體LPST10，取10⁵cfu/mL對應(yīng)宿主菌鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 10μL。隨機(jī)滴加于生菜樣表面，得到樣品上人工污染的宿主菌為10⁴cfu/Sample，為了使宿主菌充分吸附到樣品表面，將樣品置于超凈臺中風(fēng)干60min。同時(shí)為了保證生菜葉片在平皿里的相對濕度，我們在平皿里放一張無菌紙片，再在紙片上滴加一定的無菌水。

人工污染樣品后，用噬菌體對生菜樣進(jìn)行處理，取10μL效價(jià)為10⁶pfu/mL的噬菌體滴加于樣品上，盡量覆蓋住滴加宿主菌的位置，最終得到樣品上初始噬菌體為10⁵pfu/Sample，對于不加噬菌體的對照組，滴加10μL無菌的2×YT培養(yǎng)液。將裝有樣品的培養(yǎng)皿蓋好，將樣品置于恒溫箱中進(jìn)行貯藏，試驗(yàn)重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)3個(gè)平行。

分別于0、1、2、3、4、5h取樣，把樣品放入裝有2ml的無菌PBS緩沖液的5mL的離心管中，用渦旋儀全速震蕩30s，梯度稀釋并計(jì)數(shù)。

結(jié)果顯示：

對于噬菌體LPSE1，

在MOI＝1條件下，噬菌體LPSE1對腸炎沙門氏菌ATCC13076的抑菌效果：噬菌體與沙門氏菌作用前2個(gè)小時(shí)菌量幾乎沒有變化，作用3-5h時(shí)，ATCC13076的減少量分別為：0.6、1.1、2.0log cfu/cm²。

在MOI＝10條件下，噬菌體LPSE1對腸炎沙門氏菌ATCC13076的抑菌效果：從MOI＝10的消除效果圖可以看出，噬菌體與沙門氏菌作用前2個(gè)小時(shí)菌量幾乎沒有變化，作用3-5h時(shí)，ATCC13076的減少量分別為：1.2、1.7、1.7log cfu/cm²。

在MOI＝100條件下，噬菌體LPSE1對腸炎沙門氏菌ATCC13076的抑菌效果：LPSE1噬菌體與沙門氏菌ATCC13076作用0小時(shí)菌量減少0.6log cfu/cm²。

對于噬菌體LPST10，

在MOI＝1條件下，噬菌體LPST10對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌效果：作用3-5h時(shí)，ATCC14028的減少量分別為：0.4、1.4、1.7log cfu/cm²。

在MOI＝10條件下，噬菌體LPST10對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌效果：作用3-5h時(shí)，ATCC14028的減少量分別為：1.1、1.9、1.7log cfu/cm²。

在MOI＝100條件下，噬菌體LPST10對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌效果：噬菌體LPST10與ATCC14028沙門氏菌作用0小時(shí)(5min)菌量減少0.3log cfu/cm²，隨著作用時(shí)間的延長消除率不斷上升。

上述的實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，而不應(yīng)視為對于本發(fā)明的限制，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求記載的技術(shù)方案，包括權(quán)利要求記載的技術(shù)方案中技術(shù)特征的等同替換方案為保護(hù)范圍。即在此范圍內(nèi)的等同替換改進(jìn)，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。