本發(fā)明是關于一種基因修飾的間充質干細胞及其用于生產BsAb抗體的方法，具體而言，本發(fā)明涉及基因修飾的間充質干細胞、其制備方法、以及通過基因修飾間充質干細胞生產雙特異性單鏈抗體的方法。

背景技術：

人體的免疫系統(tǒng)中，細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)和殺傷性T細胞(Cytokine induced killer)扮演著重要的角色，它們擁有T細胞受體(T cell receptor，TCR)，能夠對表達目標抗原的細胞進行特異識別與結合，并分泌穿孔素和顆粒酶，從而殺滅病原靶細胞。但是，癌細胞等病變區(qū)域常表現(xiàn)為抗原表達缺陷、缺少免疫粘附分子和共刺激分子等物質，使得機體免疫識別功能“喪失”。近年來，依照基因重組方法構建的雙靶向抗體(Bispecificantibody,BsAb)，能夠同時與T細胞和癌細胞特異性抗原結合，并激活T細胞免疫機制，實現(xiàn)“雙靶向抗體介導T細胞重新定向的抗癌效應作用”(Anticancer effectors of BsAb-Retargeting T cell)。這種BsAb抗體協(xié)助功能性T細胞重新定位病變靶點，恢復了自體免疫功能。

目前臨床治療中，所使用的BsAb抗體主要通過體外基因工程生產，經蛋白純化后由人體靜脈注射，最終只能依靠血液循環(huán)將BsAb抗體遞送到靶區(qū)域。這種方法獲取的BsAb抗體極易在溫度變化下失活、并且該治療方法費用昂貴；同時，BsAb抗體半衰期較短，因此降低了與靶細胞的接觸概率，以至于無法形成理想的治療效果。

另一方面，應用干細胞產生細胞因子和蛋白已有相關報道。目前，對干細胞的基因修飾方法中大部分都選用病毒載體，如慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒。病毒載體轉染雖然能提高干細胞基因修飾的效率，但由于病毒的安全性問題，使得這種方法存在一定的局限性，如對操作環(huán)境的要求嚴格，如感染后病毒基因可能隨機整合到細胞基因組，從而破壞細胞基因組，造成致癌風險，況且病毒載體應用于動物體內其轉染效率是不高的，因為機體本身會啟動沉默病毒功能的機制。此外，現(xiàn)有的應用干細胞進 行基因轉染產生細胞因子和蛋白的研究方法所產生的蛋白和功能因子分子量相對較低，并且多見于應用核糖核酸類(RNA)如mRNA作為基因載體。

目前尚未見到應用干細胞生產分子量較大的雙特異性單鏈抗體的類似報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是應用間充質干細胞創(chuàng)建生物活性載體，提供一種基因修飾的間充質干細胞及其制備方法與用于生產BsAb抗體的方法，從而進一步可利用間充質干細胞的生物學特性遷移至治療區(qū)域，通過細胞自身分泌BsAb抗體進而提高免疫治療效果。

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)來源于間質組織，具備多向分化、免疫調節(jié)和自我復制更新功能。并且，在外界因素作用下，表現(xiàn)出趨向損傷和癌變病變組織的定向遷移能力(歸巢性能)。本發(fā)明通過對間充質干細胞進行基因修飾，將干細胞構建成BsAb抗體的“生產工廠”和靶向性遞送系統(tǒng)，借助干細胞實現(xiàn)將抗體遞送至病變區(qū)域，完成針對如癌癥等疾病的干細胞介導的細胞免疫治療(Stem-cell Driven Cancer-targeted Immunotherapy)。

一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的間充質干細胞，其是利用攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉染間充質干細胞而得到的。該基因修飾的間充質干細胞能夠有效分泌雙特異性單鏈抗體。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，所述間充質干細胞可以來源于脂肪、臍帶、胎盤、骨髓、子宮內膜或牙髓等。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，是利用非病毒類基因載體承載BsAb抗體基因，這些非病毒載體可以選自質粒DNA(Plasmid DNA，下文縮寫為DNA)或微環(huán)質粒DNA(Minicircle Plasmid DNA,下文縮寫為MCDNA)等。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，所述BsAb抗體可以選自antiCD19×antiCD3、antiCD20×antiCD3、antiEGFR×antiCD3、antiGPC3×antiCD3、antiEpCAM×antiCD3、anticMet×antiCD3、antiEGFRvIII×antiCD3、antiIGF1R×antiCD3、antiCD44v6×antiCD3或antiPDL-1×antiCD3等。不限于以上所述的序列模式，同樣適用于antiCD3×anti“靶點”的序列模式。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的基因修飾的間充質干細胞的制備方法，該方法包括：

將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉染至間充質干細胞，完成對間充質干細胞的基因修飾，得到基因修飾的間充質干細胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，是利用化學轉染試劑的化學轉染方法、或電穿孔轉染方法實現(xiàn)針對干細胞的基因修飾。具體而言，所述化學轉染試劑可以包括：脂質體轉染試劑(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000轉染試劑)，聚陽離子轉染試劑(如聚乙烯亞胺、聚氨基酯、殼聚糖等)，或是無機納米顆粒轉染試劑、有機納米顆粒轉染試劑、或無機有機雜化納米顆粒轉染試劑(如磁性納米顆粒、磷酸鹽納米顆粒等)。所述電穿孔轉染方法可以為常規(guī)電轉儀操作方法。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的基因修飾的間充質干細胞用于生產BsAb抗體中的應用。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種生產BsAb抗體的方法，該方法包括：

培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因修飾的間充質干細胞以分泌表達雙特異性單鏈抗體。具體地，所述培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂靜置培養(yǎng)。其中優(yōu)選的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。采用本發(fā)明的方法，通常在培養(yǎng)72-96小時或更長的時間內可持續(xù)表達雙特異性單鏈抗體，在一定程度上實現(xiàn)了BsAb的持續(xù)供給。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的生產BsAb抗體的方法還包括將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉染至間充質干細胞完成對間充質干細胞的基因修飾的過程。如前所述，可以是利用化學轉染試劑的化學轉染方法、或電穿孔轉染方法實現(xiàn)針對干細胞的基因修飾。所述化學轉染試劑可以包括：脂質體轉染試劑(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000轉染試劑)，聚陽離子轉染試劑(如聚乙烯亞胺、聚氨基酯、殼聚糖等)，或是無機納米顆粒轉染試劑、有機納米顆粒轉染試劑、或無機有機雜化納米顆粒轉染試劑(如磁性納米顆粒、磷酸鹽納米顆粒等)。所述電穿孔轉染方法可以為常規(guī)電轉儀操作方法。

根據(jù)本發(fā)明的更具體實施方案，本發(fā)明的生產BsAb抗體的方法可以按照下述方法中的任意一種進行：

方法一：將具有抗體表達基因的質粒DNA或微環(huán)MCDNA 4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時Lipofectamine2000基因轉染試劑 (Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質粒溶液和轉染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000基因載體復合物。將間充質干細胞以每孔5×10⁵個/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個細胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞融合至70％，更換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl基因載體復合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

方法二：將具有抗體表達基因的質粒DNA或微環(huán)MCDNA 4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時取適量的聚陽離子納米顆粒,如ε-己內酯修飾的改性聚乙烯亞胺(專利申請?zhí)?01310390436.1)，溶解于opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl配制成轉染劑溶液，靜置5min后，用移液器將質粒溶液和轉染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成納米復合物。將人臍帶來源的間充質干細胞以每孔5×10⁵個/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個細胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞融合至70％，更換為opti-MEM培養(yǎng)基800μl/孔，然后每孔加入200μl納米復合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

方法三：將18μl Supplement溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]與82μl NucleofectorTM溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]充分混勻，構成電轉液(100μl體系/電轉杯)；用胰酶消化間充質干細胞，使其從培養(yǎng)皿壁上脫落下來，離心(1000rpm，5min)，棄去上清，用100μl電轉液將間充質干細胞重新懸浮，使其密度達到1×10⁷個/ml；向100ul間充質干細胞重懸液中加入6μg具有抗體表達基因的質粒DNA或微環(huán)MCDNA，用移液槍輕輕混勻，使細胞同質粒充分混勻；將混合液加入到電轉杯中，使用Lonza公司生產的AmaxaTM4D-NucleofectorTM細胞核轉染儀，選取轉染儀U-023程序進行電轉；電轉結束后，將提前預熱的細胞培養(yǎng)液加入電轉杯中，靜置5min，用吸管輕輕吸出，加入到6孔盤培養(yǎng)皿中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基更換，繼續(xù)培養(yǎng)。

采用本發(fā)明的方法，應用干細胞作為BsAb抗體生產工廠，可在較長時期內持續(xù)分泌表達BsAb抗體。

綜上所述，本發(fā)明中，主要是利用攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體，借助化學轉染試劑及電轉染方法，完成對間充質干細胞的基因修飾，將干細胞構建成BsAb抗體的“生產工廠”和遞送系統(tǒng)與分泌系統(tǒng)，本發(fā)明與現(xiàn)有BsAb的臨床應用技術相比，其有益效果主要表現(xiàn)為：

(1)現(xiàn)有臨床應用中BsAb抗體主要通過基因工程生產，為防止免疫熱源等有毒物質的危害必須經蛋白純化后注入體內，并且BsAb抗體極易在溫度變化下失活因此增加了保存難度。而本發(fā)明應用干細胞作為BsAb抗體生產工廠，可以將被轉染干細胞注射，減少了純化環(huán)節(jié)；

(2)臨床應用中BsAb抗體只能依靠血液循環(huán)將BsAb抗體遞送到靶區(qū)域，然而現(xiàn)有研究表明腫瘤等病灶的微環(huán)境十分復雜，如實體腫瘤常表現(xiàn)出瘤內的內部高壓，這使得體液中的抗體難以進入病灶區(qū)域。而本發(fā)明將干細胞作為BsAb抗體生產工廠，利用間充質干細胞對腫瘤等病灶的主動趨化歸巢遷移行為，到達目標區(qū)域，實現(xiàn)BsAb抗體的遞送；

(3)BsAb抗體體內半衰期較短(小于12小時)，因此降低了與靶細胞的接觸概率，以至于無法形成理想的治療效果；而本發(fā)明應用干細胞作為BsAb抗體生產工廠，可以在一定時期內(試驗檢測72-96小時)持續(xù)表達，在一定程度上實現(xiàn)了BsAb的持續(xù)供給；

(4)本發(fā)明摒棄了常規(guī)的病毒載體，選用了非病毒基因載體來完成干細胞基因修飾，解決了體內應用可行性的問題；

(5)本發(fā)明中創(chuàng)新地使用了質粒DNA和微環(huán)MCDNA作為BsAb的基因載體對干細胞進行基因修飾，DNA質粒和微環(huán)MCDNA性質穩(wěn)定，且微環(huán)MCDNA生物安全性高并且能持續(xù)穩(wěn)定表達；

(6)本發(fā)明中借助干細胞實現(xiàn)抗體分泌，干細胞作為“生產工廠”產生分子量較大的雙特異性單鏈抗體，生物效應持久，動員大量的免疫細胞完成對靶標的免疫攻擊，并且干細胞能夠歸巢至腫瘤或病灶部位，從而可形成干細胞介導的細胞免疫治療(Stem-cell Driven Cancer-targeted Immunotherapy)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的技術方案的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例1中所用載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA基因圖譜。

圖3為本發(fā)明實施例1中改造后得到重組質粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA基因圖譜。

圖4為Lipofectamine2000/質粒DNA對人源臍帶間充質干細胞轉染96小時后，上清培養(yǎng)基中antiCD20×antiCD3 BsAb抗體的western blot檢測結果。

圖5為針對臍帶間充質干細胞、骨髓間充質干細胞，應用Lipofectamine2000介導質粒DNA和微環(huán)MCDNA進行基因轉染，轉染96小時后，對上清培養(yǎng)基中antiCD20×antiCD3 BsAb抗體的western blot檢測結果。

具體實施方式

為了更清楚地理解本發(fā)明的實質，下面通過具體實施例并配合附圖進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照所屬領域的常規(guī)操作或按照制造廠商所建議的條件進行。

請參見圖1所示，本發(fā)明的技術方案中，主要是利用化學試劑-基因轉染方法、或是電穿孔轉染方法，將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉染至間充質干細胞，得到基因修飾的間充質干細胞，然后培養(yǎng)所述的基因修飾的間充質干細胞以分泌表達雙特異性單鏈抗體。

實施例1、針對人臍帶來源的間充質干細胞進行化學試劑轉染

(1)制備Lipofectamine2000/DNA轉染復合物

a、含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA的制備

本實施例中，先利用分子生物學方法將antiCD20×antiCD3基因序列(SEQ ID No.1，該序列是在人源化單抗anti-CD20序列的基礎上改造而成雙特異性單鏈抗體序列。antiCD20序列來源于：GA101(Obinutuzumab，羅氏Roche)，antiCD3部分來源于專利US008076459)克隆到載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA.(由中國科學院深圳先進技術研究院醫(yī)藥所基因與細胞治療研究室提供，其詳細譜圖如圖2所示，序列如SEQ ID No.2(人工序列)所示，其中藥物篩選標記為卡那霉素Kanamycin)，改造后得到重組質粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA(6880bp)如圖3，該重組質粒即為含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因質粒DNA antiCD20×antiCD3序列。具體制備過程如下：

利用上下游引物,其中PCR引物序列：(5’-3’)正向： GAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATC(SEQ ID No.3)；反向：TGAGTCGACCTAATGATGATGGTGATGA(SEQ ID No.4)和含有目的基因序列模板(antiCD20×antiCD3序列：SEQ ID No.1)使用PCR(聚合酶鏈式反應)技術大量擴增該基因序列，而后利用TaKaRa膠回收試劑盒純化回收得到較高純度的目的基因；利用雙酶切方法對載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA及目的基因進行處理，在37℃條件下進行酶切，酶切位點為Nhe I和Sal I，酶切后利用TaKaRa膠回收試劑盒經過膠回收得到純度較高的載體片段及目的基因片段；酶切后載體片段和目的基因序列，載體片段與目的基因片段按物質的量比1:3混勻，在16℃條件下借助TAKARA T4連接酶連接載體片段和目的基因；獲得得到克隆重組質粒DNA；將連接得到克隆重組質粒DNA進行轉化，10ul重組質粒輕輕加入到大腸桿菌感受態(tài)細胞，輕柔混勻，在冰上放置30分鐘而后置于42℃條件下90秒鐘，再置于冰上5分鐘，加入500ul LB培養(yǎng)基混勻，置于37℃，220rpm條件下擴增1小時，最后涂在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時間不超過16小時；而后，在LB培養(yǎng)板上挑取單克隆，按照質粒提取試劑盒方法，搖菌擴增并提取質粒，得到含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA，即圖3所示重組質粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA(6880bp)；

b、制備Lipofectamine2000/DNA轉染復合物的制備

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時Lipofectamine2000基因轉染試劑(Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質粒溶液和轉染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000/質粒DNA復合物。

(2)針對人臍帶來源的間充質干細胞的化學試劑轉染

人臍帶來源的間充質干細胞(深圳南山醫(yī)院提供)以每孔5×10⁵個/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個細胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞融合至70％，更換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl含有Lipofectamine2000/質粒DNA復合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)96小時收集細胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，取上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

同時按照上述方法設定陰性對照組，應用含有eGFP(綠色熒光蛋白)表達基因的PMAX質粒(編號PMAX-eGFP，購置于Lonza公司)構建Lipofectamine2000/DNA轉染復合物，對干細胞進行轉染，96小時后采集的細胞的上清培養(yǎng)液成分，進行蛋白鑒定。

(3)對針對人臍帶來源的間充質干細胞轉染BsAb，對細胞的上清培養(yǎng)液中蛋白進行western blot檢測。其步驟如下：

(A)SDS-PAGE凝膠配制，先制備分離膠，待膠凝固后，配制濃縮膠，按照下述

配方配制：

10％分離膠：

濃縮膠：

(B)制樣及電泳

從-80℃冰箱取出細胞上清樣品，4℃融化后，取100μl上清，加入25μl 5×SDS-loading buffer，混勻后100℃煮10min。冷卻至室溫，上樣至加樣孔內。80-120V電泳90min。

(C)轉膜后封閉孵育抗體

PVDF用甲醇活化5min后，將膠和膜固定在bio-Rad的標準濕法轉膜裝置內，轉膜電流為300mA，轉膜時間1h。轉膜完畢，將膜取出在TBST洗滌液中洗滌1min，加入至5％的脫脂奶粉中封閉1h。封閉完成后，用TBST洗滌3次，每次5min后，加入MonoclonalM2antibody(1:500，sigma-aldrich)一抗于4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌一抗3次，每次5min，加入Goat anti-mouse-HRP(1:3000，Abcam)二抗溶液，室溫孵育1h，用TBST洗滌一抗5次，每次5min。

(D)ECL法檢測蛋白

500μl Thermo Pierce ECL Western Blotting Substrate顯影底物加至膜上，用凝膠成像儀捕捉化學發(fā)光條帶，成像30s-2min。

檢測結果如圖4所示。應用ANTI-FLAG抗體(購置于Sigma-Aldrich公司)對蛋白進行識別。陽性對照組(Psitive control)為antiCD20×antiCD3 BsAb抗體標準品；陰性對照組(PMAX-eGFP)，其為應用攜帶含有eGFP(綠色熒光蛋白)表達基因的PMAX質粒(購置于Lonza公司)，構建Lipofectamine2000/DNA復合物針對干細胞轉染，細胞培養(yǎng)上清液的蛋白鑒定。其中轉染步驟與實施例1相同；實驗組為將具有antiCD20×antiCD3表達基因的質粒DNA構建成Lipofectamine2000/DNA轉染復合物針對間充質干細胞轉染，細胞培養(yǎng)上清液的蛋白鑒定。結果顯示干細胞表達的antiCD20×antiCD3 BsAb抗體與標準品出現(xiàn)在同一個條帶位置，證實轉染成功，干細胞可以分泌抗體。

實施例2、針對人臍帶來源的間充質干細胞進行電轉染

將18μl Supplement溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]與82μl NucleofectorTM溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]充分混勻，構成電轉液(100μl體系/電轉杯)；用胰酶消化間充質干細胞(深圳南山醫(yī)院提供)，使其從培養(yǎng)皿壁上脫落下來，離心(1000rpm，5min)，棄去上清，用100μl電轉液將間充質干細胞重新懸浮，使其密度達到1×10⁷個/ml；向100μl間充質干細胞重懸液中加入6μg具有antiCD20×antiCD3-BsAb抗體表達基因的質粒DNA質粒(質粒制備參見實施例1)，用移液槍輕輕混勻，使細胞同質粒充分混勻；將混合液加入到電轉杯中，使用Lonza公司生產的AmaxaTM4D-NucleofectorTM細胞核轉染儀，選取轉染儀U-023程序進行電轉；電轉結束后，將提前預熱的細胞培養(yǎng)液加入電轉杯中，靜置5min，用吸管輕輕吸出，加入到6孔盤培養(yǎng)皿中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時后用含10％ 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基更換，而后加入10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)96小時(期間不進行換液)，而后收集細胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進行蛋白鑒定。檢測結果參見圖5。

實施例3、針對人臍帶來源的間充質干細胞進行納米復合物介導轉染

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA質粒(質粒制備參見實施例1)4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時取適量的ε-己內酯修飾的改性聚乙烯亞胺(專利申請?zhí)?01310390436.1)溶解于opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl配制成轉染劑溶液，靜置5min后，用移液器將質粒溶液和轉染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成質粒DNA納米復合物。

人臍帶來源的間充質干細胞以每孔5×10⁵個/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個細胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞融合至70％，更換weiopti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl含有質粒DNA納米復合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，而后在37℃、5％CO₂、含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96小時(期間不進行換液)，而后收集細胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進行蛋白鑒定。檢測結果參見圖5。

實施例4、針對骨髓間充質干細胞進行微環(huán)DNA(MCDNA)和質粒DNA介導的基因轉染

(1)制備Lipofectamine2000/MCDNA轉染復合物

a、含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的MCDNA的制備

本實施例中所用的含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的MCDNA，為針對含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA經過誘導得到攜有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的MCDNA。其具體制備過程如下：

將常規(guī)方法成功構建的antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA的大腸桿菌(菌株名稱DH5α，全式金公司)種加入2ml的TB培養(yǎng)基(含有卡那霉素50μg/ml)，在37℃，250rpm條件下震蕩培養(yǎng)，5小時后對其中1ml菌液按照質粒提取試劑盒方法進行質粒提?。?/p>

將上述質粒DNA的剩余大腸桿菌液100ul加入到400ml的TB培養(yǎng)基中(含有卡 那霉素50μg/ml)，于37℃，250rpm條件下震蕩培養(yǎng)過夜不超過16小時；

而后向400ml攜帶有上述質粒DNA的大腸桿菌液中加入微環(huán)誘導混合試劑(400ml LB培養(yǎng)基中含有1N NaOH，20％Arabinose，具體參見表1)，再置于32℃，250rpm條件下振蕩搖菌5-8小時；將菌液置于6000-rpm，4℃，離心10分鐘，而后利用Qiagen質粒提取大提試劑盒進行質粒提取，最后獲得含有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的MCDNA。

表1、微環(huán)誘導混合試劑(ml)

b、Lipofectamine2000/MCDNA轉染復合物的制備

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒MCDNA4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時Lipofectamine2000基因轉染試劑(Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質粒溶液和轉染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000/MCDNA轉染復合物。

(2)針對人源骨髓間充質干細胞的化學試劑轉染

人源骨髓間充質干細胞(深圳南山醫(yī)院提供)以每孔5×10⁵個/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個細胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞融合至70％，換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后，每孔加入200μl含有Lipofectamine2000/MCDNA的復合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(期間不進行換液)，而后收集細胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進行western blot檢測實驗，檢測結果參見圖5。

參見圖5所示，western blot檢測結果，應用ANTI-FLAG抗體對蛋白進行識別。Western條帶檢測，從左至右分別為①陽性對照組antiCD20×antiCD3 BsAb抗體標準品；②應用Lipofectamine2000/DNA轉染復合物，針對臍帶間充質干細胞轉染具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA，antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達結果；③應用Lipofectamine2000/MCDNA轉染復合物針對骨髓間充質干細胞轉染具有 antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA，antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達結果；④應用Lipofectamine2000/DNA轉染復合物針對骨髓間充質干細胞轉染具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA，96小時檢測的細胞上清培養(yǎng)液中antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達結果；⑤應用納米DNA轉染復合物針對骨髓間充質干細胞轉染具有antiCD20×antiCD3抗體表達基因的質粒DNA，96小時檢測的細胞上清培養(yǎng)液中antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達結果。結果表明干細胞表達的antiCD20×antiCD3 BsAb抗體與標準品出現(xiàn)在同一個條帶位置，證DNA和MCDNA在轉染試劑和納米粒子體系下轉染成功，干細胞可以分泌抗體。

最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的精神和范圍。