本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及一種組合物、含有該組合物的誘導(dǎo)制劑及誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
：心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損壞,是臨床上一種嚴(yán)重的缺血性心臟病。壞死后的心肌細(xì)胞逐漸被癱痕組織所取代，由于癱痕組織缺乏彈性，難以滿足心臟收舒功能的要求,為代償損失心肌細(xì)胞的功能，心臟逐漸發(fā)生退行性左心室重塑，心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭，甚至猝死。臨床藥物和介入治療雖可以改善癥狀，但卻不能挽回受損的心肌細(xì)胞。心臟移植雖可以從根本上解決心室重構(gòu)問(wèn)題,但因?yàn)槠涔w受限，醫(yī)療費(fèi)用太高而難以廣泛應(yīng)用。近年來(lái)的研究表明，心肌細(xì)胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌細(xì)胞也可以發(fā)生分裂和增值，但是，由于其增值能力較弱，不能滿足彌補(bǔ)喪失心肌細(xì)胞數(shù)量的要求而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過(guò)程。近年來(lái)隨著干細(xì)胞技術(shù)和組織工程學(xué)研究的不斷深入，干細(xì)胞移植治療心肌梗死成為臨床研究的熱點(diǎn)。干細(xì)胞的多向分化潛能及可塑性使心肌梗死心肌細(xì)胞再生成為可能，在人體的微環(huán)境作用下，干細(xì)胞定向歸巢至損傷處，可以多項(xiàng)分化成各種組織細(xì)胞及血管。目前用于心肌梗死治療研究的干細(xì)胞主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。牙齦屬于牙周組織，是附于牙齒周?chē)姆指粝路窖乐芙M織和外部空間的粘膜屏障。牙齦包括上皮和固有層兩部分，從發(fā)育來(lái)源上，上皮來(lái)自原始口腔上皮，與口腔粘膜上皮相延續(xù)；固有層則發(fā)育自早期神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移形成的間充質(zhì)，上皮與間充質(zhì)不斷相互作用，最終形成牙齦組織。牙齦組織的一個(gè)典型特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的創(chuàng)傷愈合能力，表現(xiàn)為切除、損傷后能夠無(wú)疤愈合，恢復(fù)牙齦外形。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)是組成牙齦結(jié)締組織的主要間充質(zhì)細(xì)胞,來(lái)源于中胚層的纖維母細(xì)胞，不僅具有活躍的自我更新的能力，并且還具有合成和降解膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的功能：I型和Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便、牙齦組織中細(xì)胞含量大、增值速度快,作為成體間充質(zhì)干細(xì)胞中的一員，在體外使用合適的誘導(dǎo)劑同樣具有分化為心肌樣細(xì)胞的能力。牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞這種功能特性極大地吸引了來(lái)自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)發(fā)展新療法的機(jī)會(huì)。目前對(duì)于GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)的研究報(bào)道尚少。由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的存在多誘導(dǎo)因素的有機(jī)體，因此在心肌組織再生的復(fù)雜微環(huán)境中，多種誘導(dǎo)因子在心肌組織再生的過(guò)程中可能會(huì)起到相互協(xié)同或拮抗的作用。因此，提供一種由兩種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于GMSCs，有效的誘導(dǎo)GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種組合物、含有該組合物的誘導(dǎo)制劑及誘導(dǎo)方法。該組合物能夠有效地誘導(dǎo)GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種組合物，包括5-氮雜胞苷、骨成形蛋白和血管緊張素II。5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一種可改變基因的去甲基化藥物,作為一種誘導(dǎo)劑常用于體外實(shí)驗(yàn)研究。5-aza是胞苷類(lèi)似物，為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，當(dāng)其作用于MSC時(shí)能整合進(jìn)入DNA中，通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶使低DNA甲基化，而DNA的甲基化程度和基因調(diào)節(jié)密切相關(guān)。5-aza誘導(dǎo)MSC心肌化,可能是它和控制向心肌分化的特異啟動(dòng)子基因上阻遏蛋白結(jié)合，使其去甲基化而發(fā)生構(gòu)型改變，從而啟動(dòng)細(xì)胞向心肌分化，使轉(zhuǎn)變成心肌細(xì)胞。骨成形蛋白(BMP)是一個(gè)至少包括20個(gè)成員的家族，屬于TGF-β超家族的一員。骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有多種生物學(xué)功能，參與胚胎時(shí)期骨組織的發(fā)育，成年骨缺損修復(fù)及機(jī)體某些骨疾病的發(fā)生過(guò)程，并且在脂肪、腎臟、骨骼、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起一定作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),骨形態(tài)發(fā)生蛋白參與調(diào)節(jié)某些心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，對(duì)心肌干細(xì)胞的定向分化起重要作用。尤其是BMP-2，在胚胎心臟的發(fā)生以及干細(xì)胞向心肌分化方面發(fā)揮重要作用。血管緊張素II(AngiontensinII，Ang-II)是人體內(nèi)正常存在的一種多肽類(lèi)激素類(lèi)物質(zhì)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展以及血管重塑中起到一定的作用。有研究顯示人類(lèi)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)Ang-II誘導(dǎo)之后表達(dá)平滑肌特異性基因增加，其向平滑肌樣細(xì)胞分化，而且還可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合成增加，也可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向中胚層前體細(xì)胞分化和增殖。Ang-II單獨(dú)可以促使間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，同時(shí)使用5-aza可以進(jìn)一步提高增殖和分化的效率。本發(fā)明還提供了所述組合物在誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)制劑，包括本發(fā)明提供的組合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)制劑中所述5-氮雜胞苷的終濃度為5～15μmol/L。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)制劑中所述骨成形蛋白的終濃度為5～15μg/L。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)制劑中所述血管緊張素II的終濃度為1～10μmol/L。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)制劑還包括細(xì)胞培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)制劑還包括血清。此外，本發(fā)明還提供了所述的誘導(dǎo)制劑在誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，取牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞與本發(fā)明提供的誘導(dǎo)制劑混合后培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：1、GMSCs原代分離培養(yǎng)：1)原材料來(lái)源：取臨床上正畸導(dǎo)萌術(shù)切下的牙齦或阻生拔牙需要而切除包繞在恒牙周?chē)难例l組織。要求患者沒(méi)有牙齦增生、炎癥及使用過(guò)導(dǎo)致牙齦增生的藥物。切取的牙齦組織快速浸入含3倍雙抗的4℃預(yù)冷的PBS中。其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00u/mL青霉素、300u/mL鏈霉素。2)漂洗：用含3倍雙抗的PBS沖洗3次，再將牙齦置于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中浸泡5min；其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00u/mL青霉素、300u/mL鏈霉素。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中含有100u/mL青霉素、100u/mL鏈霉素。3)第一次消化：將牙齦組織剪成1cm3大小，加入適量Ⅰ型膠原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒溫?fù)u床中消化45min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，100um細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾懸液，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。其中，Ⅰ型膠原酶-Dispase酶的比例為1:1，膠原酶濃度為膠原酶3g/L，Dispase酶濃度為Dispase酶4g/L。其中，消化環(huán)境為為37℃，200R恒溫?fù)u床中，消化時(shí)間為45min；其中，所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為100um；其中，離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。4)第二次消化：把步驟3)中過(guò)濾下下來(lái)未消化的組織加入等體積的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒溫?fù)u床中繼續(xù)消化15min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，70um細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾懸液，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。其中，胰蛋白酶與牙齦組織的比例為體積比1:1，胰蛋白酶的濃度為0.125％；其中，所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為70um；其中，離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。5)接種：步驟3)與步驟4)中收集的細(xì)胞用含10ng/mLEGF(表皮生長(zhǎng)因子)的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于六孔板，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，可市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)或自制。其中，完全培養(yǎng)基中EGF(表皮生長(zhǎng)因子)的濃度為10ng/mL；6)純化：待細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90％，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞。將收集的細(xì)胞與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠30min4℃孵育，在磁力設(shè)備作用下篩選出STRO-1+GMSCs，接種于新的六孔板中，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。2、GMSCs傳代：待細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1～3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入5～10mL間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入5～10mL含10ng/mLEGF的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×104cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2～3天換液一次。培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。細(xì)胞接種約4h后開(kāi)始貼壁，3～4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6-8d進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)速度平穩(wěn)，呈單層貼壁生長(zhǎng)。大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)不規(guī)則。3、GMSCs表面標(biāo)志物鑒定：待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90％，收集細(xì)胞(約1×106個(gè))，加入3g/LTriton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室溫封閉2h，分別滴加1:200稀釋的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗體各50μL，同時(shí)對(duì)照組滴加單純PBS50μL，4℃處理16h。次日室溫放置30min，PBS漂洗3遍，各組分別滴加1:500稀釋的FITC標(biāo)記二抗IgG，常溫避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福爾馬林固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定抗原的陽(yáng)性率。檢測(cè)結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞表面抗原CD146、CD105、CD90陽(yáng)性表達(dá)，而CD34、CD45、HLA-DR陰性表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明中得到的GMSCs屬來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)方法具體為：選取第3代GMSCs，按1×104cells/mL密度接種于放有多聚賴氨酸處理的無(wú)菌蓋玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。24h后更換本發(fā)明提供的誘導(dǎo)制劑，在37℃、5％CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)，每隔2～3天更換新的培養(yǎng)液。本發(fā)明提供了一種組合物，包括5-氮雜胞苷、骨成形蛋白和血管緊張素II。還提供了一種誘導(dǎo)制劑，所述誘導(dǎo)制劑中所述5-氮雜胞苷的終濃度為5～15μmol/L，所述骨成形蛋白的終濃度為5～15μg/L，所述血管緊張素II的終濃度為1～10μmol/L。本發(fā)明提供一種有效的GMSCs成心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。其中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液成分包括10％FBS、10μmol/L5-aza、10μg/LBMP-2、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)基。該方法能夠有效地誘導(dǎo)GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。GMSCs自體取材方便、易于體外擴(kuò)增，可以用于自體移植,從而避免了免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明提供一種由多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于GMSCs，能有效的誘導(dǎo)GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。表明GMSCs保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細(xì)胞的能力，可跨胚層分化為心肌樣細(xì)胞，有望成為心肌梗死替代治療的種子細(xì)胞。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示GMSCs形態(tài)圖；其中，圖1(A)示40×，圖1(B)示100×；圖2示GMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物流式檢測(cè)結(jié)果圖；圖3示各組誘導(dǎo)分化率比較。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種組合物、含有該組合物的誘導(dǎo)制劑及誘導(dǎo)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的組合物、含有該組合物的誘導(dǎo)制劑及誘導(dǎo)方法中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例11、GMSCs原代分離培養(yǎng)1)原材料來(lái)源：取臨床上正畸導(dǎo)萌術(shù)切下的牙齦或阻生拔牙需要而切除包繞在恒牙周?chē)难例l組織。要求患者沒(méi)有牙齦增生、炎癥及使用過(guò)導(dǎo)致牙齦增生的藥物。切取的牙齦組織快速浸入含3倍雙抗的4℃預(yù)冷的PBS中。其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00u/mL青霉素、300u/mL鏈霉素。2)漂洗：用含3倍雙抗的PBS沖洗3次，再將牙齦置于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中浸泡5min；其中，3倍雙抗?jié)舛葹?00u/mL青霉素、300u/mL鏈霉素。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中含有100u/mL青霉素、100u/mL鏈霉素。3)第一次消化：將牙齦組織剪成1cm3大小，加入適量Ⅰ型膠原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒溫?fù)u床中消化45min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，100um細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾懸液，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。其中，Ⅰ型膠原酶-Dispase酶的比例為1:1，膠原酶濃度為膠原酶3g/L，Dispase酶濃度為Dispase酶4g/L。其中，消化環(huán)境為為37℃，200R恒溫?fù)u床中，消化時(shí)間為45min；其中，所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為100um；其中，離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。4)第二次消化：把步驟3)中過(guò)濾下下來(lái)未消化的組織加入等體積的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒溫?fù)u床中繼續(xù)消化15min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，70um細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾懸液，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄上清。其中，胰蛋白酶與牙齦組織的比例為體積比1:1，胰蛋白酶的濃度為0.125％；其中，所用細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑為70um；其中，離心速度為1000r/min，離心時(shí)間為5min。5)接種：步驟3)與步驟4)中收集的細(xì)胞用含10ng/mLEGF(表皮生長(zhǎng)因子)的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于六孔板，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，可市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)或自制。其中，完全培養(yǎng)基中EGF(表皮生長(zhǎng)因子)的濃度為10ng/mL；6)純化：待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90％，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞。將收集的細(xì)胞與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠30min4℃孵育，在磁力設(shè)備作用下篩選出STRO-1+GMSCs，接種于新的六孔板中，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。2、GMSCs傳代待細(xì)胞長(zhǎng)滿80～90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1～3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入5～10mL間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入5～10mL含10ng/mLEGF的間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×104cells/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2～3天換液一次。培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。細(xì)胞接種約4h后開(kāi)始貼壁，3～4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～8d進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞生長(zhǎng)速度平穩(wěn)，呈單層貼壁生長(zhǎng)。大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)不規(guī)則。3、GMSCs表面標(biāo)志物鑒定：待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90％，收集細(xì)胞(約1×106個(gè))，加入3g/LTriton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室溫封閉2h，分別滴加1:200稀釋的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗體各50μL，同時(shí)對(duì)照組滴加單純PBS50μL，4℃處理16h。次日室溫放置30min，PBS漂洗3遍，各組分別滴加1:500稀釋的FITC標(biāo)記二抗IgG，常溫避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福爾馬林固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定抗原的陽(yáng)性率。檢測(cè)結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞表面抗原CD146、CD105、CD90陽(yáng)性表達(dá)，而CD34、CD45、HLA-DR陰性表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明中得到的GMSCs屬來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。表1GMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率結(jié)果細(xì)胞表型CD146CD105CD90HLA-DRCD34CD45陽(yáng)性表達(dá)率(％)100.0099.9096.700.300.000.10實(shí)施例2GMSCs分化為了驗(yàn)證本發(fā)明分化誘導(dǎo)的效果，同時(shí)設(shè)置4組對(duì)照組和4組實(shí)驗(yàn)組，選取第3代GMSCs，按1×104cells/mL密度接種于放有多聚賴氨酸處理的無(wú)菌蓋玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。24h后更換各組對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)，每隔2～3天更換新的培養(yǎng)液。對(duì)照組1為陰性對(duì)照組，為常規(guī)培養(yǎng)組，使用的培養(yǎng)液為：含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。對(duì)照組2為陽(yáng)性對(duì)照組，使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、10μmol/L5-aza的DMEM/F12培養(yǎng)液。對(duì)照組3為陽(yáng)性對(duì)照組，使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、10μg/LBMP-2的DMEM/F12培養(yǎng)液。對(duì)照組4為陽(yáng)性對(duì)照組，使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組1中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、5μmol/L5-aza、5μg/LBMP-2、1μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組2中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、5μmol/L5-aza、5μg/LBMP-2、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組3中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、10μmol/L5-aza、10μg/LBMP-2、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組4中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、10μmol/L5-aza、5μg/LBMP-2、10μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組5中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、5μmol/L5-aza、10μg/LBMP-2、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組6中使用的誘導(dǎo)液為：10％FBS、15μmol/L5-aza、15μg/LBMP-2、10μmol/LAng-II的DMEM/F12培養(yǎng)液。各組培養(yǎng)液的配方如表2表2各組分化誘導(dǎo)液配方GMSCs誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)觀察對(duì)照組1為陰性對(duì)照組，細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化，實(shí)驗(yàn)組6細(xì)胞增殖緩慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，3-4周偶見(jiàn)部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長(zhǎng)梭形或橢圓形；其余各組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，誘導(dǎo)2周左右，細(xì)胞多緊密平行排列生長(zhǎng)，細(xì)胞體積變大，紡錘形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長(zhǎng)梭形或橢圓形；3-4周，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組1明顯減少，相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周?chē)糠旨?xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。免疫組化：培養(yǎng)4周后取出細(xì)胞爬片,按照免疫組化染色試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行肌間線蛋白(desmin)、心肌肌鈣蛋白I(troponinI)和心肌肌鈣蛋白T(troponinT)的免疫組化染色，DAB顯色。將各組放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹(shù)膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過(guò)夜。滴加3％過(guò)氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加適量一抗(desmin、troponinI、troponinT)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時(shí)，4℃過(guò)夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5～10分鐘，在光鏡下觀察，用自來(lái)水進(jìn)行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。對(duì)各組所得細(xì)胞經(jīng)免疫組化檢測(cè)后，對(duì)desmin、troponinI、troponinT染色的細(xì)胞按公式：誘導(dǎo)分化率＝染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出各組的分化率進(jìn)行比較。每組取樣3次，分別檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3。表3各組細(xì)胞分化率(*表示p<0.05，，**表示p<0.01)表3、圖3結(jié)果顯示，對(duì)照組1為陰性對(duì)照組，細(xì)胞無(wú)著色；其余各組中，三種蛋白均有細(xì)胞著色，表明desmin、troponinI、troponinT均表達(dá)陽(yáng)性。其中實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)3、實(shí)驗(yàn)組4和實(shí)驗(yàn)組5與對(duì)照組2、對(duì)照組3、對(duì)照組4之間分化率有極顯著性差異(**，p<0.01)；而實(shí)驗(yàn)組1中可能由于Ang-II濃度過(guò)低，并未體現(xiàn)其聯(lián)合5-aza、BMP-2誘導(dǎo)分化的效果；實(shí)驗(yàn)組4雖有細(xì)胞少量著色，但由于5-aza濃度過(guò)高，對(duì)細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞活性受到較大影響，分化效率也為最差；實(shí)驗(yàn)組3與實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組4、實(shí)驗(yàn)組5均有顯著性差異(*，p<0.05)，實(shí)驗(yàn)組3中細(xì)胞著色最多，誘導(dǎo)分化率為42.01±1.63％，顯著高于其他各組,，說(shuō)明本發(fā)明所用分化培養(yǎng)基能有效的誘導(dǎo)GMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3