本發(fā)明屬于海洋生物細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及牙鲆正常和白化皮膚細胞系的構建方法。

背景技術：

自從1962年第一個硬骨魚類細胞系—虹鱒魚性腺細胞系RTG-2(Wolf and Quimby，Science，1962，135:1065-1066)成功構建以來，已有近300株不同的魚類細胞系相繼建立起來，組織來源包括胚胎及成魚的腎臟、心臟、脾臟、鰭條、性腺等。這些細胞系的應用也已經從病毒分離及鑒定擴展到魚類胚胎干細胞、免疫學、病原學、遺傳育種和基因工程、魚類資源保護等領域的研究中。然而，魚類皮膚作為重要的病原防御屏障和色素發(fā)生的組織，迄今為止，僅有少數幾種魚類中有皮膚細胞系的報道(Lei et al.,Fish Physiology&Biochemistry,2012,38(4):1175-1182；Ma et al.,Journal of Fish Biology,2013,83(3):560-573)。高通量測序技術以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一種冷溫性底棲魚類，具有潛沙習性，廣泛分布于中國、日本、韓國沿海。正常牙鲆的有眼側皮膚為褐色，無眼側皮膚為白色。而在牙鲆苗種生產過程中經常出現較高比例的體色白化現象，即有眼側皮膚出現異常的部分白色或全部白色。這種白化現象嚴重影響了牙鲆魚苗的市場價值和個體存活能力。迄今為止，有關牙鲆白化機制研究僅僅停留在餌料營養(yǎng)、環(huán)境條件及生理因素等方面，鮮有分子機制的研究報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于利用牙鲆正常和白化皮膚，提供一種牙鲆皮膚細胞系的構建技術以及其在研究病原及功能基因和microRNA中的應用。

為實現上述技術目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

牙鲆正常和白化皮膚細胞系的構建方法，包括以下步驟：

步驟一：配制細胞培養(yǎng)液：配制細胞培養(yǎng)液：取DMEM/F12培養(yǎng)基和Hepes，充分溶解混合均勻4h后，用NaOH調節(jié)pH值，然后抽濾，將濾液分裝，于4℃保存，使用時，取濾液再加入胎牛血清、50mm的2-巰基乙醇、10ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子、100U/ml青霉素、0.1mg/ml硫酸鏈霉素，并于4℃存放，所述胎牛血清的體積為DMEM/F12培養(yǎng)基總體積的20％；

步驟二：原代培養(yǎng)：首先配置沖洗液，所述的沖洗液包括DMEM/F12培養(yǎng)基、100U/ml青霉素和0.1mg/ml硫酸鏈霉素，然后分別取體重200克正常牙鲆和白化牙鲆，分別用MS-222麻醉之后，用70％酒精浸泡清洗4min，取正常牙鲆、白化牙鲆的有眼側皮膚分別置于不同的細胞培養(yǎng)皿中，使用沖洗液沖洗三次，將皮膚組織剪成1mm³的小塊后，分別放入25cm²的培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中補充細胞培養(yǎng)液至完全覆蓋皮膚組織塊，并正置于24℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，最后每隔5天更換細胞培養(yǎng)液一次；

步驟三：傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細胞開始遷移增殖后，細胞數目增多，細胞生長成為單層后，采用0.25％胰酶消化法傳代懸起細胞，并以1：1—1：2進行傳代，以后8-10天傳代一次，傳至第10代時，細胞培養(yǎng)液中血清含量減為總體積的10％，此時，細胞系建立成功。

采用上述技術方案的發(fā)明，從牙鲆白化分子機制著手研究，構建的牙鲆正常和白化皮膚細胞系可連續(xù)傳代40代或以上，細胞的生長狀態(tài)良好，能穩(wěn)定增值，細胞系的主要細胞類型為成纖維樣細胞。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的步驟一中所取的DMEM/F12培養(yǎng)基和Hepes的重量比值為2：1。

作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選，所述的步驟一的pH值為7.4。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選，所述的步驟三以1：2進行傳代培養(yǎng)。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選，所述的步驟三每8天傳代一次。

對比現有技術本發(fā)明提出的技術方案具有以下有益效果：構建的細胞系可以連續(xù)傳代，牙鲆正常和白化皮膚細胞傳40代以上，從而能提供大量的牙鲆皮膚細胞系，該細胞系可以直接應用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究。

用上述牙鲆皮膚細胞系的構建方法構建的牙鲆正常皮膚細胞系(JFSK_wt)和白化皮膚細胞系(JFSK_alb)，其最適生長溫度均為24℃，生長曲線正常，染色體核型2n＝48t，可以進行連續(xù)傳代，也可以對其進行冷凍保存。以石斑魚神經壞死病毒轉染細胞系可以檢測到病毒粒子的存在，以pEGFP-N3和Cy3-siRNA進行轉染實驗，也觀察到較強的熒光信號，證實牙鲆皮膚細胞系可以直接應用于病毒感染試驗及外源基因功能研究。

本發(fā)明牙鲆皮膚細胞系的構建方法重復性強，染色體鑒定方法可信，配制的培養(yǎng)液營養(yǎng)成分全面，取材的牙鲆體重恰當，該構建方法可以適用于構建其他魚類的皮膚組織來源的魚類細胞系，應用價值極大。

附圖說明

本發(fā)明可以通過附圖給出的非限定性實施例進一步說明；

圖1為本發(fā)明培養(yǎng)的牙鲆皮膚細胞系在相差顯微鏡下的視圖：1A.JFSK_wt原代，1B.JFSK_wt第19代，1C.JFSK_alb第3代，1D.JFSK_alb第18代，標尺＝50μm；

圖2為本發(fā)明培養(yǎng)的牙鲆正常皮膚細胞系(JFSK_wt)和牙鲆白化皮膚細胞系(JFSK_alb)在不同溫度下的生長曲線：2A.牙鲆正常皮膚細胞系(JFSK_wt)，2B.牙鲆白化皮膚細胞系(JFSK_alb)；

圖3為本發(fā)明培養(yǎng)的牙鲆正常皮膚細胞系(JFSK_wt)和牙鲆白化皮膚細胞系(JFSK_alb)的牙鲆皮膚細胞系的染色體核型圖：3A.JFSK_wt的二倍體中期分裂相，3B.JFSK_wt的核型，3C.JFSK_alb的二倍體中期分裂相,3D.JFSK_alb的核型；

圖4為本發(fā)明培養(yǎng)的牙鲆皮膚細胞系感染神經壞死病毒的NNV圖：4A、4B分別為JFSK_wt、JFSK_alb細胞感染病毒后的細胞病變效應圖(CPE)，標尺＝50μm，4C、4D分別為JFSK_wt、JFSK_alb細胞感染病毒后的細胞電鏡切片圖，標尺＝100nm；

圖5為本發(fā)明JFSK_wt細胞和JFSK_alb細胞在轉染Cy3-siRNA后的圖片：5A、5C分別為JFSK_wt第26代細胞在轉染Cy3-siRNA后36小時的明場、紅色熒光激發(fā)光成像結果圖，5B、5D分別為JFSK_alb第23代細胞在轉染Cy3-siRNA后36小時的明場、紅色熒光激發(fā)光成像結果，標尺＝50μm；

圖6為本發(fā)明JFSK_wt細胞和JFSK_alb細胞在轉染pEGFP-N3后的圖片：6A、6C分別為JFSK_wt第9代細胞在轉染pEGFP-N3后48小時的明場、綠色熒光激發(fā)光成像結果圖，6B、6D分別為JFSK_alb第10代細胞在轉染pEGFP-N3后48小時的明場、綠色熒光激發(fā)光成像結果圖，標尺＝50μm。

具體實施方式

為了使本領域的技術人員可以更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖和實施例詳細敘述本發(fā)明牙鲆正常和白化皮膚細胞系的構建、鑒定和應用方法。

一、牙鲆正常皮膚細胞系和白化皮膚細胞系的構建方法

牙鲆正常和白化皮膚細胞系的構建方法，包括三個步驟：

步驟一：配置細胞培養(yǎng)液：分別稱取9.6克DMEM/F12培養(yǎng)基和4.76克Hepes，充分溶解混勻4小時后，用NaOH調節(jié)pH值至7.4，然后抽濾，將濾液分裝，并于4℃保存，使用時，取濾液再加入占DMEM/F12培養(yǎng)基總體積20％的胎牛血清，50mM的2-巰基乙醇，10ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子，100U/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸鏈霉素，并于4℃存放。

步驟二：原代培養(yǎng)：取DMEM/F12培養(yǎng)基，向其加入100U/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸鏈霉素作為沖洗液，然后分別取體重約200克正常牙鲆和白化牙鲆，分別用MS-222麻醉之后，用70％酒精浸泡清洗4分鐘，然后取正常牙鲆、白化牙鲆的有眼側皮膚分別置于不同的細胞培養(yǎng)皿中，使用沖洗液沖洗三次后，將皮膚組織剪成大約1mm³的小塊，分別放入25cm²的培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中補充適量細胞培養(yǎng)液至完全覆蓋皮膚組織塊，并正置于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后每隔5天更換細胞培養(yǎng)液一次。

步驟三：傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細胞開始遷移增殖后，細胞數目增多，細胞生長成為單層后，此時如圖1中的1A所示，采用0.25％胰酶消化法傳代懸起細胞，以1：2進行傳代，以后每8天傳代一次，傳至第10代時，細胞培養(yǎng)液中血清含量減為總體積的10％時，已傳代40代，細胞已能穩(wěn)定增值，可定為細胞系，分別命名為牙鲆正常皮膚細胞系(JFSK_wt)和牙鲆白化皮膚細胞系(JFSK_alb)。該細胞系主要細胞類型為成纖維樣細胞如圖1中的1B、1C、1D所示。

需要指出的是，步驟三以1：2進行傳代培養(yǎng)為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，實際細胞培養(yǎng)過程中，可以根據具體情況而定，只要滿足以1：1-1：2進行傳代培養(yǎng)即可。

另外，步驟三每8天傳代一次也為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，實際細胞培養(yǎng)過程中可視具體情況而定，只要滿足以8-10天傳代一次即可。

二、牙鲆皮膚細胞系的鑒定和應用方法

牙鲆皮膚細胞系的鑒定和應用方法包括：1.細胞的凍存與復蘇，2.細胞生長曲線繪制，3.染色體分析，4.病毒感染實驗，5.GFP報告基因和siRNA的細胞轉染。具體如下：

1.細胞的凍存與復蘇

(1)細胞的凍存：選取生長旺盛、處于指數生長期的細胞，即細胞密度為90％以上的一瓶細胞，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化，待細胞收縮變圓時，吸去消化液，用2ml凍存液懸浮細胞，凍存液即含有10％二甲基亞砜的細胞培養(yǎng)液，然后移至凍存管，于4℃放置30分鐘，再在-80℃冰箱內放置12小時，然后移至液氮中保存，并做好記錄。

(2)細胞的復蘇：自液氮中取出保存的凍存管，迅速置于40℃水浴中融化后，2200rpm離心5分鐘，棄上清液，然后加入2ml細胞培養(yǎng)液重懸細胞后，轉移至培養(yǎng)瓶中，放置于24℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后棄上清，再加入3ml細胞培養(yǎng)液。

2.細胞生長曲線繪制

為了分析牙鲆皮膚細胞系的生長情況，取18代JFSK_wt細胞和11代JFSK_alb細胞接種于24孔板，每板3孔接種細胞，每孔密度分別為3.3×10⁴和2.4×10⁴個細胞，將24孔板分別置于18℃，24℃，30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接種后的第1，2，3，4，5，6天，在三組24孔板中，每組各取3孔細胞，以0.25％胰蛋白酶消化，細胞計數板計數。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以每毫升細胞數量為縱坐標，繪制出生長曲線如圖2所示。從圖2中的2A可以看出，牙鲆正常皮膚細胞系于18℃下培養(yǎng)的細胞生長速率較緩，于30℃下培養(yǎng)的細胞在第四天至第五天的生長速率最快，于24℃下培養(yǎng)的細胞在第二天至第四條的生長速率最快，由此看出，24℃為牙鲆正常皮膚細胞系的最適生長溫度；同樣地，從圖2中的2A可以看出，牙鲆正常白化皮膚細胞系于18℃和30℃下培養(yǎng)的細胞生長速率較緩，于24℃下培養(yǎng)的細胞在第二天至第四條的生長速率最快，由此看出，24℃為牙鲆白化皮膚細胞系的最適生長溫度。

3.染色體分析

將第21代JFSK_wt細胞和24代JFSK_alb細胞以4×10⁶個/瓶的密度接種于25cm²的培養(yǎng)瓶中，于24℃培養(yǎng)36h后，加入終濃度為1ug/ml的秋水仙素，3h后，消化離心收集細胞，離心后的細胞沉淀用0.0375M KCl溶液處理30分鐘，離心后去上清，加入1ml的卡諾固定液(甲醇：乙酸＝3：1)，預固定5分鐘，離心后細胞沉淀再次用卡諾固定液固定20分鐘。最后再次離心，細胞重懸于0.5ml的卡諾固定液中，以冷滴法滴片，風干，用5％吉姆薩染色25分鐘，最后用Nikon顯微鏡觀察如圖3所示，由圖3可以看出，牙鲆JFSK_wt和JFSK_alb的染色體數目分別在29-74和17-79條之間，其中主要的染色體數目均為48條，染色體核型均為2n＝48t。

4.病毒感染實驗

以第24代JFSK_wt和第16代JFSK_alb細胞為對象，檢測石斑魚神經壞死病毒(NNV)對這兩種細胞的敏感程度。細胞接種24小時后，將濃度為10³TCID50/ml的病毒溶液加入細胞培養(yǎng)瓶中，1小時后，移去病毒溶液，更換新鮮細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，約5天后，觀察到細胞病變效應(CPE)后(如圖4中的4A、4B)，將細胞做電鏡切片觀察。

將感染NNV病毒的牙鲆皮膚細胞分別離心后，用2.5％戊二醛4℃固定4小時，0.1M PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。1％鋨酸4℃固定2小時，0.1M PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。乙醇系列梯度脫水，30％，50％，70％，90％，100％的乙醇每次10分鐘，其中100％兩次。Epon812環(huán)氧樹脂包埋，37℃、45℃、65℃溫箱固化，每級溫度24小時。UltracutE超薄切片機超薄切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色。用JEM-1200EX透射電鏡結果顯示，在JFSK_wt和JFSK_alb細胞中均能觀察到NNV病毒粒子(如圖4中的4C、4D)。

5.GFP報告基因和siRNA的細胞轉染

轉染前一天，將JFSK_wt細胞和JFSK_alb細胞接種于12孔板中，24℃培養(yǎng)。轉染時，細胞密度超過80％，以Invitrogen公司的Lipofectamine 2000轉染pEGFP-N3和Cy3-siRNA。具體步驟為：將2μl Lipofectamine 2000加入到包含48μl細胞培養(yǎng)液(不含血清)的1.5ml離心管中，向另一個離心管中加入4μl pEGFP-N3(400ng/ul)和46μl不含血清的細胞培養(yǎng)液或1μl 50μM Cy3-siRNA和49μl不含血清的細胞培養(yǎng)液，5分鐘后，將上述兩管溶液混合，室溫放置25分鐘。將100μl混合液加入到包含1ml不含血清的細胞培養(yǎng)液的12孔板之一孔中，24℃培養(yǎng)6小時，然后，將培養(yǎng)液替換為正常包含血清的細胞培養(yǎng)液。36-48小時后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U熒光顯微鏡觀察熒光表達。參見附圖5，36小時后轉染Cy3-siRNA的兩種細胞系中都觀察到紅色熒光的表達，表達效率約為90％。參見附圖6，48小時后，轉染pEGFP-N3的兩種細胞中都觀察到綠色熒光的表達，其中JFSK_alb的轉染效率約為60％，明顯高于JFSK_wt的轉染效率。

本發(fā)明建立的牙鲆正常和白化皮膚細胞系已連續(xù)傳代40代以上，細胞生長狀態(tài)良好，外源基因轉染效率較高，可以作為有效的細胞平臺應用于魚類病原學及功能基因組學。

以上對本發(fā)明提供的牙鲆正常和白化皮膚細胞系的構建方法進行了詳細介紹。具體實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。