本發(fā)明涉及一種高純度低聚乳果糖的制備方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚乳果糖是一種功能性低聚糖，具有促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，改善腸道免疫力等特殊生理功能，甜度為蔗糖的30％，甜味特性類似于蔗糖，甜味質(zhì)量是各種低聚糖中最佳的，因此可以應(yīng)用于食品工業(yè)中而不必?fù)?dān)心其對產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生影響。商業(yè)化生產(chǎn)的低聚乳果糖，由于含有蔗糖、乳糖等其他成分，因而甜度要略高一些。與其它低聚糖相比，低聚乳果糖對酸、熱具有較高的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性與蔗糖相似，在中性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下相對更穩(wěn)定，pH 7.0下80℃加熱2h和pH 3.0下80℃加熱2h，都幾乎不發(fā)生分解，在pH 4.5的條件下，其加熱溫度甚至可達(dá)到120℃。低聚乳果糖還具有高的保濕性，能使食品保持濕潤，可防止面包、點(diǎn)心等淀粉類食品老化，延長食品貨架期。
2005年調(diào)查表明，低聚乳果糖已成為日本第三大功能性低聚糖消費(fèi)品。近年來許多研究者發(fā)現(xiàn)低聚乳果糖具有許多特定的生理功能，有望成為繼低聚果糖、低聚半乳糖后又一種被全球認(rèn)可的功能性食品添加劑。
酶法合成是工業(yè)化生產(chǎn)低聚乳果糖的主要途徑，酶法合成低聚乳果糖的產(chǎn)率低一直是制約酶法合成發(fā)展的重要難題，因此如何提高酶法合成產(chǎn)率和低聚乳果糖的純度是亟待解決的問題。
如中國專利文獻(xiàn)CN104073456A(申請?zhí)?01410327028.6)公開了一株氯酚節(jié)桿菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2013387。以此節(jié)桿菌為出發(fā)菌株，以蔗糖、乳糖為碳源，與氮源及無機(jī)鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶。發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖、乳糖為主要碳源，以蛋白胨為主要氮源，發(fā)酵后經(jīng)檢測，在發(fā)酵液中果聚糖蔗糖酶酶活達(dá)2～200U/mL。將果聚糖蔗糖酶加到20％～60％的蔗糖、乳糖溶液中生產(chǎn)低聚乳果糖，轉(zhuǎn)化3～36h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到35％以上。
中國專利文獻(xiàn)CN104480164A(申請?zhí)?01410726466.X)公開了一種酶法生產(chǎn)乳果低聚糖，包括以下步驟：將氯酚節(jié)桿菌SK33.001接入種子培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)12h；種子液接種量為1％，發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵0.8～2h生產(chǎn)果聚糖蔗糖酶；向質(zhì)量濃度分別為27％的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及50mg/L Zn2+催化轉(zhuǎn)化得到含有低聚乳果糖的酶反應(yīng)液；脫色；濃縮，即得低聚乳果糖糖漿。
由于上述技術(shù)方案均采用氯酚節(jié)桿菌SK33.001作為酶法的酶來源，由于其酶的局限性導(dǎo)致產(chǎn)率和低聚乳果糖的純度較低，無法滿足實(shí)際需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高純度低聚乳果糖的制備方法。
本發(fā)明技術(shù)方案如下：
一種低聚乳果糖的制備方法，步驟如下：
(1)將節(jié)桿菌發(fā)酵液接種于蔗糖與乳糖的混合溶液，在50～60℃條件下，反應(yīng)10～14小時(shí)，然后向反應(yīng)液中流加蔗糖溶液，維持反應(yīng)液中蔗糖質(zhì)量濃度為30％～40％，繼續(xù)反應(yīng)12～24h，停止反應(yīng)，制得低聚乳果糖粗液；
所述節(jié)桿菌為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，該菌株已于2016年8月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)CGMCC No.12855；
(2)將步驟(1)制得的低聚乳果糖粗液經(jīng)脫色、過濾、離交、色譜分離、濃縮、干燥制得低聚乳果糖。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，蔗糖與乳糖的混合溶液的溶質(zhì)質(zhì)量濃度為20％～60％，蔗糖與乳糖的質(zhì)量比為(1.2～1.5):1，pH 4～6。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為35～45％；進(jìn)一步優(yōu)選的，蔗糖溶液的質(zhì)量濃度為40％。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，節(jié)桿菌發(fā)酵液制備方法如下：
I、將節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于種子培養(yǎng)基中，在28～35℃的條件下，增殖培養(yǎng)24～48h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖1～2％，酵母膏0.5～1.5％，磷酸二氫鉀0.1～0.2％，磷酸氫二銨0.3～0.6％，七水硫酸鎂0.01～0.05％，余量水，pH6.0～7.2；
II、將步驟I制得的種子液按體積比1～10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28～35℃發(fā)酵培養(yǎng)36～60h，制得節(jié)桿菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖2～4％，乳糖0.5～1％，酵母膏0.5～1.2％，蛋白胨0.4～0.8％，七水硫酸鎂0.05～0.1％，磷酸氫二銨0.1～0.4％，余量水，pH 6.0～7.2。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中節(jié)桿菌發(fā)酵液的接種量為混合溶液體積百分比的5％。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，脫色步驟如下：將步驟(1)制得的低聚乳果糖粗液，按質(zhì)量百分比0.25～1％的比例加入活性炭，80～85℃攪拌30～40min。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，過濾采用板框過濾，過濾壓力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，離交為采用連續(xù)離子交換系統(tǒng)處理料液，離交后料液透光率≥98％。處理后的料液清澈透明，無異味。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，色譜分離步驟為：
色譜運(yùn)行壓力0.20～0.30MPa，溫度60～70℃，水耗比1:1.3～1:1.6，每小時(shí)進(jìn)料1.5～2.0m3，收集低聚乳果糖。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，濃縮為濃縮至原體積的60～65％。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，干燥為噴霧干燥，步驟如下：
濃縮后的液體進(jìn)入到干燥塔中，進(jìn)風(fēng)溫度130～150℃，啟動(dòng)霧化器，液體經(jīng)噴霧干燥為粉末狀固體。
有益效果
1、本發(fā)明以從土壤中篩選獲得具有高β-呋喃果糖苷酶活性的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，并利用其發(fā)酵液生產(chǎn)低聚乳果糖，該菌種所產(chǎn)生的果糖轉(zhuǎn)移基酶的活性較傳統(tǒng)節(jié)桿菌所產(chǎn)酶活性提高50％以上，大大提高了蔗糖轉(zhuǎn)化成低聚乳果糖的能力，同時(shí)采用流加蔗糖的方法，使終產(chǎn)品中低聚乳果糖含量達(dá)到98％，顯著優(yōu)于現(xiàn)有制備獲得的產(chǎn)品；
2、本發(fā)明采用節(jié)桿菌發(fā)酵液直接生產(chǎn)，省去了提取酶的過程，使生產(chǎn)成本大大降低，較傳統(tǒng)生產(chǎn)方法降低成本達(dá)20％左右，使產(chǎn)品的競爭力大大增強(qiáng)；
3、本發(fā)明采用色譜分離與噴霧干燥方法生產(chǎn)固體高純度低聚乳果糖產(chǎn)品，較傳統(tǒng)結(jié)晶方法省時(shí)省力，可節(jié)約成本20％左右；
4、本發(fā)明產(chǎn)品高純度乳果糖作為低熱量甜味劑對酸、熱具有較高的穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于食品飲料、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，提高產(chǎn)品附加值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
實(shí)施例1
一株節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)保藏號(hào)CGMCC No.12855；
本發(fā)明所述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的原始菌株分離于山東德州百龍創(chuàng)園生產(chǎn)車間附近的土壤，并經(jīng)過誘變后獲得，具體分離過程如下：
(1)富集培養(yǎng)
選取山東德州百龍創(chuàng)園生產(chǎn)車間附近的土壤，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土壤約10g，用無菌水稀釋10倍，加入培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH為6.5；培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)36h。
(2)純種分離
采用劃線分離法，取一支盛有5ml無菌水的大試管，取步驟(1)中富集培養(yǎng)后的菌液2ml放入其中稀釋，充分振蕩分散，用接種環(huán)以無菌操作挑取稀釋液一環(huán)先在平板培養(yǎng)基一邊做第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60度角，將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后同一次劃線方法做第二次劃線，同法依次做第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，30℃培養(yǎng)36h后，挑取單個(gè)菌落接種于10個(gè)斜面培養(yǎng)基上，分別編號(hào)01-10。
將01-10斜面種子接種于搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)32℃培養(yǎng)36h，對01-10搖瓶發(fā)酵液β-呋喃果糖苷酶酶活進(jìn)行測定，04號(hào)搖瓶酶活最高，達(dá)到505U/ml。
平板培養(yǎng)基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，瓊脂2％，pH為pH6.5。
搖瓶培養(yǎng)基成分：蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH6.5。
(3)誘變篩選
對04號(hào)菌種進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變采用15W紫外線燈20cm照射，照射時(shí)間為150s，最終得到高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的高產(chǎn)菌株命名為BLCY-004，其酶活達(dá)到1100U/ml。
酶活定義如下：在pH 6.0，40℃以蔗糖作為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，每分鐘使還原能力增加相當(dāng)于2μmol的D-葡萄糖的量的酶量定于為1個(gè)活力單位(U)。
生態(tài)學(xué)形態(tài)
菌株呈乳白色，半透明狀，尺寸約2～4μm×1.8～3.5μm。革蘭氏染色呈陽性，短桿狀，單個(gè)或成對排列，培養(yǎng)周期中伴隨著桿狀、球狀形態(tài)的變化。
實(shí)施例2
一種低聚乳果糖的制備方法，步驟如下：
(1)配制質(zhì)量濃度為20％的蔗糖與乳糖的混合溶液，蔗糖與乳糖的添加比為1.2:1；調(diào)節(jié)混合溶液的pH至4，按混合液體積5％的比例接種節(jié)桿菌發(fā)酵液，在50℃條件下，反應(yīng)12小時(shí)，然后向反應(yīng)液中流加質(zhì)量濃度為40％的蔗糖溶液，維持反應(yīng)液中蔗糖質(zhì)量濃度為30％，繼續(xù)反應(yīng)12h后停止反應(yīng)，制得低聚乳果糖粗液；
(2)將步驟(1)制得的低聚乳果糖粗液按質(zhì)量百分比0.5％的比例加入活性炭，80℃攪拌40min；然后經(jīng)板框過濾，過濾壓力0.4Mpa，水流量6.0t/h；采用連續(xù)離子交換系統(tǒng)處理料液，離交后料液透光率≥98％；經(jīng)色譜分離，色譜運(yùn)行壓力0.30MPa，溫度60℃，水耗比1:1.6，每小時(shí)進(jìn)料2.0m3，收集低聚乳果糖；然后經(jīng)六效蒸發(fā)器濃縮，濃縮至原體積的60％；濃縮后的液體進(jìn)入到干燥塔中，進(jìn)風(fēng)溫度140℃，啟動(dòng)霧化器，液體經(jīng)噴霧干燥為粉末狀固體制得低聚乳果糖。
所述步驟(2)中的節(jié)桿菌發(fā)酵液按如下方法制備：
I、將節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃的條件下，增殖培養(yǎng)24h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，余量水，pH6.0；
II、將步驟I制得的種子液按體積比1％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃發(fā)酵培養(yǎng)36h，制得節(jié)桿菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，余量水，pH 6.0；
經(jīng)檢測，制得的低聚乳果糖純度達(dá)到98.2％，轉(zhuǎn)化率為55.2％，可應(yīng)用于健康食品、飲料、乳品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
實(shí)施例3
一種低聚乳果糖的制備方法，步驟如下：
(1)配制質(zhì)量濃度為40％的蔗糖與乳糖的混合溶液，蔗糖與乳糖的添加比為1.3:1；調(diào)節(jié)混合溶液的pH至5，按混合液體積5％的比例接種節(jié)桿菌發(fā)酵液，在55℃條件下，反應(yīng)12小時(shí)，然后向反應(yīng)液中流加質(zhì)量濃度為40％的蔗糖溶液，維持反應(yīng)液中蔗糖質(zhì)量濃度為35％，繼續(xù)反應(yīng)18h后停止反應(yīng)，制得低聚乳果糖粗液；
(2)將步驟(1)制得的低聚乳果糖粗液按質(zhì)量百分比0.25％的比例加入活性炭，80℃攪拌40min；然后經(jīng)板框過濾，過濾壓力0.2Mpa，水流量5.0t/h；采用連續(xù)離子交換系統(tǒng)處理料液，離交后料液透光率≥98％；然后經(jīng)六效蒸發(fā)器濃縮，濃縮至原體積的65％；經(jīng)色譜分離，色譜運(yùn)行壓力0.20MPa，溫度70℃，水耗比1:1.3，每小時(shí)進(jìn)料1.5m3，收集低聚乳果糖；濃縮后的液體進(jìn)入到干燥塔中，進(jìn)風(fēng)溫度140℃，啟動(dòng)霧化器，液體經(jīng)噴霧干燥為粉末狀固體制得低聚乳果糖。
所述步驟(2)中的節(jié)桿菌發(fā)酵液按如下方法制備：
I、將節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃的條件下，增殖培養(yǎng)24h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，余量水，pH6.0；
II、將步驟I制得的種子液按體積比1％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃發(fā)酵培養(yǎng)36h，制得節(jié)桿菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，余量水，pH 6.0；
經(jīng)檢測，制得的低聚乳果糖純度達(dá)到98.5％，轉(zhuǎn)化率為56.3％，可應(yīng)用于健康食品、飲料、乳品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
實(shí)施例4
一種低聚乳果糖的制備方法，步驟如下：
(1)配制質(zhì)量濃度為60％的蔗糖與乳糖的混合溶液，蔗糖與乳糖的添加比為1.5:1；調(diào)節(jié)混合溶液的pH至6，按混合液體積5％的比例接種節(jié)桿菌發(fā)酵液，在60℃條件下，反應(yīng)12小時(shí)，然后向反應(yīng)液中流加質(zhì)量濃度為40％的蔗糖溶液，維持反應(yīng)液中蔗糖質(zhì)量濃度為40％，繼續(xù)反應(yīng)24h后停止反應(yīng)，制得低聚乳果糖粗液；
(2)將步驟(1)制得的低聚乳果糖粗液按質(zhì)量百分比1％的比例加入活性炭，85℃攪拌30min；然后經(jīng)板框過濾，過濾壓力0.3Mpa，水流量5.5t/h；采用連續(xù)離子交換系統(tǒng)處理料液，離交后料液透光率≥98％；然后經(jīng)六效蒸發(fā)器濃縮，濃縮至原體積的63％；經(jīng)色譜分離，色譜運(yùn)行壓力0.25MPa，溫度65℃，水耗比1:1.4，每小時(shí)進(jìn)料1.6m3，收集低聚乳果糖；濃縮后的液體進(jìn)入到干燥塔中，進(jìn)風(fēng)溫度140℃，啟動(dòng)霧化器，液體經(jīng)噴霧干燥為粉末狀固體制得低聚乳果糖。
所述步驟(2)中的節(jié)桿菌發(fā)酵液按如下方法制備：
I、將節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于種子培養(yǎng)基中，在35℃的條件下，增殖培養(yǎng)48h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，余量水，pH6.0；
II、將步驟I制得的種子液按體積比10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃發(fā)酵培養(yǎng)60h，制得節(jié)桿菌發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，余量水，pH 6.0；
經(jīng)檢測，制得的低聚乳果糖純度達(dá)到98.3％，轉(zhuǎn)化率為56.5％，可應(yīng)用于健康食品、飲料、乳品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
對比例
如實(shí)施例2所述的低聚乳果糖的制備方法，不同之處在于，利用氯酚節(jié)桿菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001代替節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004。
經(jīng)檢測，制得的低聚乳果糖純度達(dá)到81.2％，轉(zhuǎn)化率為36.7％。