本發(fā)明涉及一種沙格列汀中間體(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸的生物制備方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沙格列汀是一種高效二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl Peptidase 4，DPP-4）抑制劑，通過選擇性抑制DPP-4，可以升高內(nèi)源性胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽水平，從而調(diào)節(jié)血糖。

沙格列汀的合成過程中，手性化合物中間體Ⅱ：

的合成是沙格列汀最關(guān)鍵的步驟之一。其中中間體Ⅱ的合成關(guān)鍵在于手性碳的引入，目前現(xiàn)有的合成方法主要有兩種：

第一種是化學(xué)拆分法（WO2011117393 ；US2005090539 ；J.Med.Chem,2005,48,5025-5037），但是此種合成方法路線較長，總體合成效率不高；鋰鋁氫等化學(xué)試劑的使用造成成本較高，而且會(huì)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的環(huán)境問題和后續(xù)處理問題。

第二種是酶催化氨化還原（WO2010032129 ；US2005090539 ；Advanced Synthesis ＆ Catalysis,2007,349,1369-1378 ；Bioorganic.Med.Chem,2011,19(3),1136-1154 ；US2010291642），其采用苯丙氨酸脫氫酶合成沙格列汀中間體。與純化學(xué)合成路線相比，酶催化生物轉(zhuǎn)化法可以在純水相進(jìn)行，減少使用對人及環(huán)境有危害的催化劑，降低了廢物的產(chǎn)生，環(huán)境友好性好；更重要地是，酶具有優(yōu)異的立體選擇性，中間產(chǎn)物不需要進(jìn)行拆分，因此酶催化的生物轉(zhuǎn)化可以有效提高產(chǎn)率和產(chǎn)品的光學(xué)純度，具有極好的產(chǎn)業(yè)化潛力。

氨基轉(zhuǎn)移酶氨屬于轉(zhuǎn)移酶類，通過催化一個(gè)氨基與酮基互換合成手性化合物。但是現(xiàn)有技術(shù)中尚未有人嘗試采用轉(zhuǎn)氨酶如何催化合成沙格列汀中間體，相關(guān)研究在現(xiàn)有公開文獻(xiàn)中尚未見到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是找到一種或者多種可以用于催化合成沙格列汀中間體的轉(zhuǎn)氨酶，并針對這些轉(zhuǎn)氨酶開發(fā)出適合于它們催化合成沙格列汀中間體的具體反應(yīng)條件和方法。

為了實(shí)現(xiàn)這些目的，本發(fā)明公開了一種沙格列汀中間體(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基-1-金剛烷基-D-甘氨酸的生物制備方法，是以中間體Ⅰ（2-（3-羥基-1-金剛烷）-2-氧代乙酸）為底物，在氨基轉(zhuǎn)移酶、輔酶、氨基供體和緩沖溶劑的存在下發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物。

優(yōu)選地，反應(yīng)中氨基轉(zhuǎn)移酶來源不包括Cv-ωTA Variant CNB05-01。

更為優(yōu)選地，反應(yīng)中氨基轉(zhuǎn)移酶來源為Enterobacter sp. LT3的BcATen、Escherichia coli K12的BcATes、E.coli的AAT。

同時(shí)，我們進(jìn)一步地公開，所述的氨基轉(zhuǎn)移酶的制備方法為：將含有轉(zhuǎn)氨酶的單菌落接種到含有氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中活化，將活化好的工程菌轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中并加入誘導(dǎo)劑IPTG培養(yǎng)工程菌，從培養(yǎng)液中提取氨基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明所公開的反應(yīng)中，所述的氨基供體優(yōu)選為以下所示化合物中的一種或者多種，

。

優(yōu)選地，氨基供體是以反復(fù)多次的方式加入反應(yīng)體系中。這里所說的反復(fù)多次的方式是指首先加入一定量的氨基供體，待反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)后，再次加入一定量的氨基供體，如此反復(fù)。

優(yōu)選地，每次加入氨基供體后反應(yīng)維持5分鐘左右即取出反應(yīng)樣品，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，從而判斷反應(yīng)平衡狀態(tài)。

作為一種優(yōu)選，所述的輔酶優(yōu)選為磷酸吡哆醛。

并且，我們進(jìn)一步優(yōu)選限定反應(yīng)體系在起始階段，氨基轉(zhuǎn)移酶、輔酶、氨基供體、以及中間體（３-羥基-１-金剛烷基）-２-羰基甲酸的質(zhì)量比為（0.1-1.0）：（0.01-0.1）：（1-10）：1。

同時(shí)，我們優(yōu)選在反應(yīng)中所用的緩沖溶劑優(yōu)選為水相緩沖液，其中特別地優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液、Tris－HCl緩沖液或三乙醇胺緩沖液。

進(jìn)一步地，我們還公開了優(yōu)選的反應(yīng)溫度為0-40℃。

最后，我們還優(yōu)選這一反應(yīng)在攪拌條件下反應(yīng)，攪拌轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速為100-220r/min。

本發(fā)明通過大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)，獲得了可以在水溶液中制備沙格列汀手性中間體的轉(zhuǎn)氨酶酶催化合成方法，此方法具有立體選擇性強(qiáng)、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明所公開方法制備沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)率可達(dá)90%-100%。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面我們結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。

應(yīng)該知曉的是，這些實(shí)施例是為了更好的說明和解釋本發(fā)明，但并不能用來限制本發(fā)明。

同時(shí)，需要說明的是，在以下實(shí)施例中所使用的試劑、儀器、設(shè)備等材料除非有特別的聲明或者說明，否則均為市面銷售產(chǎn)品。

以下實(shí)施例中沙格列汀手性中間體Ⅱ采用高壓液相色譜的檢測方法：其具體的檢測條件為：

色譜柱為C18 (4.6mm×250mm，55μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.06%三氟乙酸溶液(25:75)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL；檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度55 ℃，霧化氣體為空氣，載氣流速為2.0 L/min。

實(shí)施例1

在pH 6.0-10，0.2mol/L的PB緩沖液中，添加沙格列汀中間體Ⅰ的濃度為10mmol/L，氨基供體的濃度為20mmol/L，PLP為0.1-10mg。反應(yīng)溫度控制在轉(zhuǎn)氨酶催化的最適溫度0-40℃范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速控制在100-220r/ min，因酶催化反應(yīng)速率較快，反應(yīng)進(jìn)行5min后即取出反應(yīng)樣品，檢測產(chǎn)物沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度。然后向體系補(bǔ)加一定體積的氨基供體，使反應(yīng)正向進(jìn)行；待反應(yīng)平衡后，再次取樣，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充一定體積的氨基供體；如此反復(fù)添加氨基供體，使最終測得沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度接近10mmol/L，最終檢測產(chǎn)物沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ產(chǎn)率可達(dá) 90%-100%。

實(shí)施例2

以20mmol/L α-氨基戊二酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶Cv-ωTA Variant CNB05-01催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶Cv-ωTA Variant CNB05-01的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為0mmol/L。

實(shí)施例3

以20mmol/L α-氨基戊二酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATen催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶BcATen的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的α-氨基戊二酸；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的α-氨基戊二酸；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為10mmol/L。

實(shí)施例4

以20mmol/L α-氨基戊二酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATes催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的α-氨基戊二酸；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的α-氨基戊二酸；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為9.5mmol/L。

實(shí)施例5

以20mmol/L α-氨基戊二酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶AAT催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的α-氨基戊二酸；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的α-氨基戊二酸；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為9mmol/L。

實(shí)施例6

以20mmol/L苯乙胺，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATen催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶BcATen的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的苯乙胺；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的苯乙胺；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為9.5mmol/L。

實(shí)施例7

以20mmol/L β-氨基丁酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATen催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶BcATen的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的β-氨基丁酸；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的β-氨基丁酸；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為10mmol/L。

實(shí)施例8

以20mmol/L 3-氨基-3-苯基丙酸，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATen催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶BcATen的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的3-氨基-3-苯基丙酸；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的3-氨基-3-苯基丙酸；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為9.5mmol/L。

實(shí)施例9

以20mmol/L丙胺，與濃度10mmol/L的沙格列汀中間體Ⅰ在轉(zhuǎn)氨酶BcATen催化作用下進(jìn)行反應(yīng)。

反應(yīng)條件為：pH 7.0，0.2mol/L的PB緩沖液體系，轉(zhuǎn)氨酶BcATen的用量為1U/mL，PLP 0.1 mg，反應(yīng)總體積1.5 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min，待反應(yīng)5min達(dá)到平衡后，取樣 200μL，檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度；然后向體系補(bǔ)加100μL的丙胺；待反應(yīng)平衡后，再次取樣200μL，檢測產(chǎn)物濃度并補(bǔ)充100μL的丙胺；如此反復(fù)添加5次；最終檢測沙格列汀手性中間體Ⅱ的濃度，沙格列汀手性中間體Ⅱ的產(chǎn)物濃度為9mmol/L。