一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法與流程

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本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，涉及一種共固定化酶催化合成D-丙氨酸的方法。把meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體和FDH共固定化于載體上，共固定化酶為生物催化劑，以NAD（H）為輔酶，催化α-酮酸底物合成D-丙氨酸，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液直接濾除，共固定化酶回收可重復(fù)使用120批，在填充柱中可連續(xù)催化反應(yīng)55天，活性沒有明顯下降，得到的反應(yīng)液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。產(chǎn)物D-丙氨酸的光學(xué)純度 >98%。

背景技術(shù)：

-丙氨酸是白色晶體，有特殊的結(jié)晶形狀。有甜味，溶于水、強(qiáng)堿和強(qiáng)酸溶液，不溶于無水酒精，乙醚和丙酮。在2%的鹽酸（5 mol/L）中25℃比旋光度是-14.6，在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。D-丙氨酸是一種非天然氨基酸，是重要的手性藥物中間體，用于生產(chǎn)新型廣譜抗生素、D-丙氨醇、多肽合成過程的丙氨酸保護(hù)劑、食品添加劑、化妝品、維生素B6以及合成新型甜味劑阿力甜等[代書玲，徐虹，歐陽平凱，D-天冬氨酸的制備和應(yīng)用［J］.南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（3）:108-110.]。

-丙氨酸的制備方法主要有微生物發(fā)酵法[Terasawa Masato，Nara shoichi.Manufacture of D2aspartic acid with aspartase［P］.JP：04008297，1992201213.]，化學(xué)合成法[Soda Kenji，Kageyama sadao.Manufacture of D -aspartic acid with malic acid dahydrogenase，alanine dahydrogenase，alanine racemase and D-amino acid transaminase［P］.JP:01285193，1989211216.]和生物酶催化合成法。其中，發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、設(shè)備投資大、有副反應(yīng)、分離較復(fù)雜、污染大；不對稱化學(xué)合成法反應(yīng)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，工藝過程長，需要純手性試劑或貴金屬絡(luò)合物作催化劑，環(huán)境污染大。生物催化合成法是通過酶進(jìn)行催化或者拆分，用于合成D-氨基酸的酶如轉(zhuǎn)氨酶[Eul-Soo Park, Joo-Young Dong and Jong-Shik Shin, ω-Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of unnatural amino acids using isopropylamine as an amino donor, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 6929-6933]、meso-二氨基庚二酸脫氫酶（DAPDH）[Gao X., Chen X., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 8595-8600，專利申請?zhí)枺?01210334554.6]以及目前國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)D-丙氨酸普遍采用的氨基酸?；福壑苄闱?氨基酸代謝相關(guān)的酶［J］.發(fā)酵科技通訊，2006，35（1）:43-44.］等，酶催化方法存在酶的價(jià)格昂貴，同時(shí)游離酶對環(huán)境敏感、容易失活，且存在無法回收，反應(yīng)成本高，二次污染等問題。

固定化酶技術(shù)發(fā)展于 20 世紀(jì) 60 年代。與游離酶相比有很多優(yōu)點(diǎn)，如：產(chǎn)物易分離；可以重復(fù)多批次使用；酶的穩(wěn)定性提高；簡化了后期提純工藝等[羅貴民. 酶工程[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002，2]；共固定化酶是將兩種或兩種以上的酶固定于同一載體內(nèi)形成共固定化系統(tǒng)的一種技術(shù)[徐莉，侯紅萍. 酶的固定化方法的研究進(jìn)展[J]. 釀酒科技，2010(1)：86–90]。共固定化酶可以充分發(fā)揮不同酶的特點(diǎn)，將其催化特性結(jié)合起來，充分利用協(xié)同作用，提高其催化效率。同時(shí)可以減少反應(yīng)時(shí)間和步驟，連續(xù)生產(chǎn)，能夠更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種反應(yīng)條件溫和，酶活力回收較高，成本低廉、工藝簡單的利用共固定化酶制備D-丙氨酸的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法，具體包括以下步驟：（1）將一定比例的meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和甲酸脫氫酶酶液混合，加入環(huán)氧基樹脂或者活化后的氨基樹脂，室溫下攪拌15-30小時(shí)，取出載體，用緩沖液洗至無游離蛋白，將載體加入到一定濃度的封閉劑溶液中25°C攪拌6-10小時(shí)，取出載體后將其用緩沖液洗三遍。得到的共固定化酶4°C保存?zhèn)溆谩＃?）α-酮酸、α-酮酸鹽和氨基化合物作為底物與溶劑構(gòu)成的反應(yīng)體系中加入共固定化酶和少量輔酶進(jìn)行催化還原胺化反應(yīng)，反應(yīng)溫度20~60 °C，反應(yīng)pH值為6~11，反應(yīng)時(shí)間4~72小時(shí)，制得光學(xué)純度>98% D-氨基酸。（3）將反應(yīng)液直接濾除，共固定化酶回收重復(fù)使用，得到的反應(yīng)液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。

所述步驟（1）中meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體，可通過以下步驟獲得：

a．以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35E單位點(diǎn)突變；

b．以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35E/R36V兩位點(diǎn)組合突變；

c．以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36V兩位點(diǎn)組合突變；

d．以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36Q兩位點(diǎn)組合突變；

e．以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36Q/Y76V三位點(diǎn)組合突變；

f．將構(gòu)建的突變子工程菌進(jìn)行培養(yǎng)、并對目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

g．將步驟f中的單位點(diǎn)、雙位點(diǎn)、三位點(diǎn)組合突變體分別收集菌體后，用緩沖液進(jìn)行重懸，進(jìn)行高壓破碎，離心取破碎上清，通過Ni-NTA層析柱純化；

h．將步驟f中三位點(diǎn)組合突變體收集菌體后，用緩沖液進(jìn)行重懸，進(jìn)行高壓破碎，離心取破碎上清。將破碎上清于70℃水浴中熱處理30 min，再次離心取熱處理上清。

所述步驟（1）中載體為表面含有氨基或者環(huán)氧基官能團(tuán)的載體，如：ES-1，ES-101，ES-102，ES-103，ESR-1，ESR-2, ESR-3, ESQ-1（購自天津南開和成科技有限公司），優(yōu)選表面含有氨基的樹脂為固定化載體。

所述步驟（1）中共固定酶meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和甲酸脫氫酶兩種酶的酶量比例在1:1-1:5之間，優(yōu)選比例為1:3。所選封閉劑包括鹽酸乙二胺、二乙胺和α-甲基芐胺，乙醇胺等，封閉劑濃度在0.1mmol/g載體-3mmol/g載體，優(yōu)選封閉劑為乙醇胺，濃度為0.1mmol/g載體-1mmol/g載體。

所述步驟（2）中，α-酮酸、α-酮酸鹽和氨基化合物作為底物與溶劑構(gòu)成的反應(yīng)體系中加入共固定化酶和少量輔酶進(jìn)行催化還原胺化反應(yīng)，反應(yīng)溫度20~60 °C，優(yōu)選反應(yīng)溫度為30~50 °C。反應(yīng)pH值為6~11，優(yōu)選pH值為7~9，反應(yīng)時(shí)間4~72小時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為4-24小時(shí)。

所述步驟（3）中反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液通過酸性離子樹脂吸附分離得到光學(xué)純度>98% D-氨基酸。

反應(yīng)產(chǎn)物構(gòu)型檢測：

向反應(yīng)產(chǎn)物中加入高氯酸使蛋白變性后，對反應(yīng)產(chǎn)物氨基酸進(jìn)行衍生，利用衍生后的L、d-丙氨酸標(biāo)樣做對照，確定產(chǎn)物構(gòu)型以及ee值。

附圖說明：

附圖1 為本發(fā)明的工藝流程圖；

附圖2為丙氨酸消旋體HPLC譜圖；

附圖3為產(chǎn)品D-丙氨酸構(gòu)型HPLC譜圖；

附圖4為產(chǎn)品核磁譜圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明內(nèi)容，但是這些實(shí)施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。下列實(shí)例中所用材料除特別說明外，所用化學(xué)藥品、試劑均購自Sigma公司。DNA和蛋白質(zhì)Marker均購自Fermentas公司，蛋白純化Ni-NTA填料購自GE。Quick Change Mutagenesis Kit購自Agilent公司，突變引物按照試劑盒要求進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物合成、DNA序列測定均由華大基因公司（北京）進(jìn)行。pET₃₂質(zhì)粒載體，TOP10、BL21(DE3)高效感受態(tài)（Novagen）。液相色譜分析使用Agilent-1200色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱(4.6 × 150 mm)，固定化載體購自天津南開和成科技有限公司。

實(shí)施例1：meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體的獲得

所用StDapdh基因Genbank號為AP006840.1，先將該基因全合成并連接到pET₃₂載體上獲得質(zhì)粒：pET₃₂-StDapdh，并在大腸桿菌BL21（DE3）中對野生型基因進(jìn)行可溶表達(dá)，表達(dá)出的蛋白N-端帶有6×his tag，以利于后續(xù)Ni-NTA純化。根據(jù)需要突變的位點(diǎn)，參照Quick Change Mutagenesis Kit試劑盒使用說明，合成表1中所用PCR突變引物，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增、Dpn1切割及后續(xù)核酸回收均按試劑盒使用說明進(jìn)行。

表1：突變PCR引物

以pET32-StDapdh質(zhì)粒為模板，使用引物1和2在質(zhì)粒上引入R35E/R36V雙突變，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)，提取質(zhì)粒并測序確認(rèn)獲得雙突變質(zhì)粒pET₃₂-StDapdhR35E/R36V。以獲得的雙突變質(zhì)粒為模板，使用引物3和4在該突變子上繼續(xù)引入Y76V突變，獲得三突變質(zhì)粒：pET₃₂-StDapdhR35E/R36V/Y76V，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)高效感受態(tài)中，并提取質(zhì)粒測序確證。

實(shí)施例2：meso-二氨基庚二酸脫氫突變體酶的表達(dá)、熱擊處理制備

將含有三突變質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在2 L LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.8后，向其中加入終濃度0.5 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為20小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，于5000 rpm離心5分鐘收集菌體。取部分菌體樣品進(jìn)行純化及活力確定，利用緩沖液A（20 mM Tris-Cl pH 8.0）重懸并洗滌菌體，高壓勻漿破碎，14000 rpm離心30分鐘去除破碎沉淀。由于粗酶中的其他雜酶(L-氨基酸脫氫酶，羰基還原酶等)對產(chǎn)物的ee值、產(chǎn)物純度都有影響。StDAPDH突變子有較好的熱穩(wěn)定性，通過對粗酶進(jìn)行熱處理，在維持StDAPDH活力的情況下去除對反應(yīng)有影響的雜酶。在70℃水浴中對上清進(jìn)行熱處理，每隔10 min取一次樣100 μL，連續(xù)取樣40 min。每次取樣后均離心取上清，上清一部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳（結(jié)果見附圖1）。

實(shí)施例3：FDH酶液制備

將來源于假絲酵母（Candida bodinii）的甲酸脫氫酶基因克隆于pET21d（+）表達(dá)載體上，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行可溶性表達(dá)，種子液以1%的接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.8后，向其中加入終濃度0.5 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為20℃，誘導(dǎo)時(shí)間為20小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，于5000 rpm離心5分鐘收集菌體。高壓勻漿破碎后進(jìn)行硫酸銨沉淀，收集55%硫酸銨上清進(jìn)行下一步的疏水層析。疏水層析柱為Phenyl Sepharose 6 Fast Flow column（high sub）（GE Healthcare）。緩沖液A（50 mM Kpi pH 8.0，55%硫酸銨）用于平衡，緩沖液B（50 mM Kpi pH 8.0）用于洗脫，4ml/min流速， 0-100% B液洗脫。洗脫峰收集后用緩沖液C（50 mM Kpi pH 8.0，100 mM 氯化鈉）透析，超濾管濃縮后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4：固定化酶的制備

將1ml meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和3.3ml甲酸脫氫酶酶液加入到磷酸緩沖液(0.1M,pH 7.8)中，再加入3g 活化后的ESR-2氨基樹脂，在室溫下溫和的攪拌20小時(shí)，取出載體，用緩沖液洗至無游離蛋白，再在0.5mmol/L的乙醇胺溶液中攪拌4小時(shí)，然后取出載體，用緩沖液洗三遍。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5：催化反應(yīng)體系建立，及產(chǎn)物ee值的測定

將0.2 M底物丙酮酸，0.6 M甲酸銨溶于1 mL水中，用碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.5左右，加入0.5 mg 輔酶NAD⁺，以及共固定化酶100mg， 200 rpm轉(zhuǎn)速于37℃反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)液濾除，共固定化酶重復(fù)使用，反應(yīng)液加入10 μl高氯酸來結(jié)束反應(yīng)，取反應(yīng)液20μL，用水稀釋至200μL，加入400 μL FDAA衍生試劑，再加入80 μL的1 M的NaHCO₃， 40 ℃反應(yīng)1 h后加入40 μL 的2 M的HCl，0.45 μm的膜過濾HPLC分析。

實(shí)施例5：共固定化酶在填充柱中連續(xù)催化反應(yīng)

先取一根高徑比為30的有機(jī)玻璃柱作為填充柱，把實(shí)施例4中的共固定化酶填充到填充柱中。然后將0.1 M丙酮酸，0.3 M甲酸銨溶于水中，用碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.5左右，加入0.3g/L 輔酶NAD⁺，在溫度為35 ℃條件下，以流速為1 ml/min流經(jīng)填充柱，在此反應(yīng)條件下，D-丙氨酸產(chǎn)率為75%，共固定化酶轉(zhuǎn)化55天，活性沒有明顯下降。得到的反應(yīng)液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所

<120> 一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> Symbiobacterium thermophilum

<400> 1

atggacaaac tgcgtgttgc ggttgttggt tacggtaacg ttggtcgtta cgcgctggaa 60

gcggttcagg cggcgccgga catggaactg gttggtgttg ttgaacgtaa agttctggcg 120

gcgaccccgc cggaactgac cggtgttcgt gttgttaccg acatctctca gctggaaggt 180

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<211> 906

<212> DNA

<213> Symbiobacterium thermophilum

<400> 2

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