本發(fā)明屬于合成生物學(xué)和工業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種提高大腸桿菌異源合成聚酮類(lèi)化合物的方法和用途。
背景技術(shù)：
：天然產(chǎn)物在藥物開(kāi)發(fā)和發(fā)現(xiàn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近十幾年來(lái)，研究者使用異源合成天然產(chǎn)物表現(xiàn)出巨大的潛力。聚酮類(lèi)化合物(Polyketids)的異源生物合成是目前合成生物學(xué)領(lǐng)域中研究較為深入、進(jìn)展迅速的一個(gè)分支。Donadio于1991年提出了6-脫氧紅霉素內(nèi)酯B的合成模型，紅霉素的聚酮合酶(PKS)研究因此而成為I型PKS的典范。紅霉素生物合成分兩個(gè)部分：第一是紅霉素的母核6-脫氧紅霉內(nèi)酯B(6-deoxyerythronolide-B，6-dEB)的形成；第二是6-dEB側(cè)鏈糖基化合成紅霉素。6-dEB是紅霉素合成過(guò)程中可分離出來(lái)的第一個(gè)中間體，合成6-dEB起始原料為丙酸和甲基丙二酸。整個(gè)過(guò)程由聚酮合酶催化完成。工程化的思想促使科研工作者構(gòu)建一個(gè)工程菌進(jìn)行異源合成天然產(chǎn)物。由于大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)研究最為深入，因此大腸桿菌常作為工程菌的底盤(pán)細(xì)胞。2001年，Pfeifer等人利用大腸桿菌異源合成了紅霉素第一個(gè)前體6-dEB，開(kāi)啟了異源生物合成紅霉素的先河。以后的研究者通過(guò)大腸桿菌高效獲得紅霉素也做了諸多的嘗試，如為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，Murli等2003年用pccB和pccA基因整合到E.coli編碼甲基丙二酰輔酶A脫羧酶ygfG位點(diǎn)，同時(shí)用RSF1010的復(fù)制起始位點(diǎn)替換pET28a來(lái)源于pBR322的起始位點(diǎn)，將pBP144改造為pKOS207-129，獲得工程菌株K207-3/pKOS207-129/pBP130在搖瓶中可以獲得22.5mg/L的6-dEB。為了提高宿主本身的穩(wěn)定性，王勇等將紅霉素聚酮合酶基因eryAI，AII，AIII通過(guò)染色體重組Red/ET方法整合入大腸桿菌染色體上，獲得了染色體修飾的穩(wěn)定菌株，與多個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)相比，該菌株可穩(wěn)定的合成紅霉素中間體6-dEB。盡管最近十幾年中，以紅霉素為代表的聚酮類(lèi)化合物在大腸桿菌中的異源合成取得了一系列重大的進(jìn)展，并在大腸桿菌中成功的合成了紅霉素A。但仍存在著許多問(wèn)題，如與原產(chǎn)株紅霉糖多胞菌相比，紅霉素在大腸桿菌中的產(chǎn)量過(guò)低。蒙海林等在2011年利用insilico分析研究平臺(tái)對(duì)E.coli的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)目前大腸桿菌合成聚酮化合物的實(shí)際產(chǎn)量?jī)H為理論產(chǎn)量的1/10左右，這說(shuō)明異源的聚酮化合物合 成途徑受大腸桿菌全局網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。因此，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行全局網(wǎng)絡(luò)改造，有可能進(jìn)一步提高其異源合成聚酮化合物的能力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種提高大腸桿菌異源合成聚酮類(lèi)化合物的方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種促進(jìn)合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌生物合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的方法，所述方法包括：(1)在合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌中，弱化靶基因表達(dá)；其中，所述的靶基因選自：(a)核苷酸合成和其它代謝模塊基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循環(huán)和氧化磷酸化模塊基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代謝模塊基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前體代謝模塊基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代謝模塊基因靶點(diǎn)fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝模塊基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA；或(h)frdD+sucC組合、lsrC+frdD組合、lsrC+sucC組合、frdD+rpiA組合、talA+guaB組合或zwf+guaB組合；(2)培養(yǎng)步驟(1)制備的菌株，從而生物合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯。在一個(gè)優(yōu)選例中，在合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌中，弱化靶基因表達(dá)包括：引入抑制靶基因表達(dá)的干擾分子或敲除靶基因。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子針對(duì)(或自身具有)：sucC中SEQIDNO:37所示的序列或其互補(bǔ)序列、tdcD中SEQIDNO:2所示的序列或其互補(bǔ)序列、scpB中SEQIDNO:3所示的序列或其互補(bǔ)序列、scpA中SEQIDNO:4所示的序列或其互補(bǔ)序列、ybiW中SEQIDNO:5所示的序列或其互補(bǔ)序列、pflB中SEQIDNO:6所示的序列或其互補(bǔ)序列、tdcE中SEQIDNO:7所示的序列或其互補(bǔ)序列、pflD中SEQIDNO:8所示的序列或其互補(bǔ)序列、paaF中SEQIDNO:9所示的序列或其互補(bǔ)序列、fadJ中SEQIDNO:10所示的序列或其互補(bǔ)序列、fadB中SEQIDNO:11所示的序列或其互補(bǔ)序列、ackA中SEQIDNO:12所示的序列或其互補(bǔ)序列、pta中SEQIDNO:13所示的序列或其互補(bǔ)序列、leuD中SEQIDNO:14所示的序列或其互補(bǔ)序列、leuC中SEQIDNO:15所示的序列或其互補(bǔ)序列、yjiM中SEQIDNO:16所示的序列或其互補(bǔ)序列、purT中SEQIDNO:17所示的序列或其互補(bǔ)序列、dhaK1中SEQIDNO:18所示的序列或其互補(bǔ)序列、dhaK2中SEQIDNO:19所示的序列或其互補(bǔ)序列、dhaH中SEQIDNO:20所示的序列或其互補(bǔ)序列、ptsH中SEQIDNO:21所示的序列或其互補(bǔ)序列、ptsI中SEQIDNO:22所示的序列或其互補(bǔ)序列、fsaA中SEQIDNO:23所示的序列或其互補(bǔ)序列、ppk中SEQIDNO:24所示的序列或其互補(bǔ)序列、aceF中SEQIDNO:25所示的序列或其互補(bǔ)序列、cyoA中SEQIDNO:26所示的序列或其互補(bǔ)序列、frdD中SEQIDNO:30所示的序列或其互補(bǔ)序列、frdA中SEQIDNO:31所示的序列或其互補(bǔ)序列、pgi中SEQIDNO:32所示的序列或其互補(bǔ)序列、sdhA中SEQIDNO:33所示的序列或其互補(bǔ)序列、sdhB中SEQIDNO:34所示的序列或其互補(bǔ)序列、sdhC中SEQIDNO:35所示的序列或其互補(bǔ)序列、sdhD中SEQIDNO:36所示的序列或其互補(bǔ)序列、sucD中SEQIDNO:38所示的序列或其互補(bǔ)序列、tnaA中SEQIDNO:39所示的序列或其互補(bǔ)序列、glcF中SEQIDNO:40所示的序列或其互補(bǔ)序列、glcE中SEQIDNO:41所示的序列或其互補(bǔ)序列、yaeR中SEQIDNO:42所示的序列或其互補(bǔ)序列、lsrC中SEQIDNO:43所示的序列或其互補(bǔ)序列、hemN中SEQIDNO:44所示的序列或其互補(bǔ)序列、agaW中SEQIDNO:45所示的序列或其互補(bǔ)序列、gdhA中SEQIDNO:46所示的序列或其互補(bǔ)序列、cyoB中SEQIDNO:47所示的序列或其互補(bǔ)序列、rpiA中SEQIDNO:48所示的序列或其互補(bǔ)序列、rpiB中SEQIDNO:49所示的序列或其互補(bǔ)序列、lpdA中SEQIDNO:50所示的序列或其互補(bǔ)序列、serC中SEQIDNO:51所示的序列或其互補(bǔ)序列、serB中SEQIDNO:28所示的序列或其互補(bǔ)序列、serA中SEQIDNO:29所示的序列或其互補(bǔ)序列、zwf中SEQIDNO:174所示的序列或其互補(bǔ)序列、pgl中SEQIDNO:175所示的序列或其互補(bǔ)序列、gnd中SEQIDNO:176所示的序列或其互補(bǔ)序列、rpe中SEQIDNO:177所示的序列或其互補(bǔ)序列、talA中SEQIDNO:178所示的序列或其互補(bǔ)序列、talB中SEQIDNO:179所示的序列或其互補(bǔ)序列、tktA中SEQIDNO:180所示的序列或其互補(bǔ)序列、tktB中SEQIDNO:181所示的序列或其互補(bǔ)序列、ulaE中SEQIDNO:182所示的序列或其互補(bǔ)序列、yieK中SEQIDNO:183所示的序列或其互補(bǔ)序列、purH中SEQIDNO:184所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyrB中SEQIDNO:185所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyrI中SEQIDNO:186所示的序列或其互補(bǔ)序列、cysQ中SEQIDNO:187所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyrC中SEQIDNO:188所示的序列或其互補(bǔ)序列、gmk中SEQIDNO:189所示的序列或其互補(bǔ)序列、guaA中SEQIDNO:190所示的序列或其互補(bǔ)序列、guaB中SEQIDNO:191所示的序列或其互補(bǔ)序列、ndk中SEQIDNO:192所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyrF中SEQIDNO:193所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyre中SEQIDNO:194所示的序列或其互補(bǔ)序列、pyrH中SEQIDNO:195所示的序列或其互補(bǔ)序列、或hpt中SEQIDNO:196所示的序列或其互補(bǔ)序列。在另一優(yōu)選例中，所述方法的(1)中，所述的靶基因選自：(a)核苷酸合成和其它代謝模塊基因lsrC、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因rpiA、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循環(huán)和氧化磷酸化模塊基因frdD、frdA、sdhA、sucC或sucD；(d)糖代謝模塊基因ptsH、ptsI或glcE；(e)6dEB前體代謝模塊基因yjiM、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代謝模塊基因靶點(diǎn)fadB或dhaK2；(g)氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝模塊基因serC；或(h)frdD+sucC組合、lsrC+frdD組合、lsrC+sucC組合、talA+guaB組合或zwf+guaB組合。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子是sRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的sRNA包括以下結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子、靶基因抑制分子(如靶基因結(jié)合序列)、終止子。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子選自：Pr啟動(dòng)子(較佳地，具有SEQIDNO:52中第7-61位的序列)、PBAD啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、Trc啟動(dòng)子)。在另一優(yōu)選例中，所述的終止子選自：TE終止子(較佳地，具有SEQIDNO:52中第171-310位的序列)、T1/TE終止子、T7終止子、rrnB終止子、rrnBT1和T2終止子)。在另一優(yōu)選例中，所述抑制靶基因表達(dá)的干擾分子與終止子之間，還包括：micF序列(如具有SEQIDNO:52中第110-170位的序列)。在另一優(yōu)選例中，所述的靶基因抑制分子是短核酸序列，例如長(zhǎng)度為18-26bp；較佳地20-24bp；其能夠與靶基因的mRNA互補(bǔ)或結(jié)合，或其具有靶基因mRNA的一段序列，在轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)后可表達(dá)與靶基因的mRNA互補(bǔ)或結(jié)合的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的sRNA被包含在表達(dá)載體中。在另一優(yōu)選例中，所述的合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌是能合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的原核細(xì)菌。在另一優(yōu)選例中，所述的能合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的原核細(xì)菌是能合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的大腸桿菌；較佳地，所述的大腸桿菌中，敲除了丙酸代謝操縱子并在該敲除位點(diǎn)上整合了磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶基因sfp；或直接敲除丙酸代謝操縱子，將sfp整合到大腸桿 菌基因組中任意一個(gè)非必須基因或無(wú)功能DNA序列區(qū)域。在另一優(yōu)選例中，所述的大腸桿菌中轉(zhuǎn)化有表達(dá)編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS2的基因、編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS3的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶β-CT亞基的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶a-CT亞基的基因和編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS1的基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制靶基因表達(dá)的干擾分子，其是sRNA，所述的sRNA包括以下結(jié)構(gòu)(較佳地，所述抑制靶基因表達(dá)的干擾分子與終止子之間，還包括：micF序列)：?jiǎn)?dòng)子、靶基因抑制分子、終止子；在本發(fā)明的另一方面，提供所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子如sRNA的用途，用于轉(zhuǎn)化合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌，弱化相應(yīng)靶基因，促進(jìn)合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌生物合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌，所述的宿主菌中轉(zhuǎn)化有抑制靶基因表達(dá)的干擾分子，或所述宿主菌中敲除了靶基因；其中，所述的靶基因選自：(a)核苷酸合成和其它代謝模塊基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循環(huán)和氧化磷酸化模塊基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代謝模塊基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前體代謝模塊基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代謝模塊基因靶點(diǎn)fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝模塊基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA；或(h)frdD+sucC組合、lsrC+frdD組合、lsrC+sucC組合、frdD+rpiA組合、talA+guaB組合或zwf+guaB組合。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主菌中轉(zhuǎn)化有所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子如sRNA；和/或所述的合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌是能合成聚酮類(lèi)化合 物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的原核細(xì)菌；較佳地，所述的大腸桿菌中，敲除了丙酸代謝操縱子并在該敲除位點(diǎn)上整合了磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶基因sfp；較佳地，所述的大腸桿菌中轉(zhuǎn)化有表達(dá)編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS2的基因、編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS3的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶β-CT亞基的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶a-CT亞基的基因和編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS1的基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于促進(jìn)合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的宿主菌生物合成聚酮類(lèi)化合物6-脫氧紅霉內(nèi)酯的試劑盒，所述的試劑盒中包括：所述的宿主菌的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)菌株用于生產(chǎn))；或所述的試劑盒中包括：所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)抑制靶基因表達(dá)的干擾分子進(jìn)行應(yīng)用)；或所述的試劑盒中包括：分別包含所述的抑制靶基因表達(dá)的干擾分子的載體的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)載體進(jìn)行應(yīng)用)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。附圖說(shuō)明圖1、sRNA表達(dá)質(zhì)粒PJF650示意圖。圖2、E.coliWG構(gòu)建過(guò)程示意圖。圖3、質(zhì)粒pZG07構(gòu)建過(guò)程。圖4、質(zhì)粒pZG08構(gòu)建過(guò)程。圖5、6-dEB分離組分的HPLC分析。圖6、制備的6-dEB純品NMR氫譜圖。圖7、40mg/L的6-dEBHPLC-ELSD分析圖譜。圖8、sRNA組合調(diào)控對(duì)大腸桿菌異源合成6-dEB影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次揭示一種促進(jìn)合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌生物合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的方法，通過(guò)單獨(dú)弱化或組合弱化大腸桿菌中sucC(表達(dá)琥珀酸輔酶A合成酶)等基因的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)顯著提高大腸桿菌異源合成聚酮類(lèi)化合物的產(chǎn)量，最高產(chǎn)量提高率可達(dá)到60％以上。本發(fā)明的方法能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中聚酮類(lèi)化合物大量積累。如本文所用，所述的“抑制靶基因表達(dá)的干擾分子”是指可以特異性降低靶基因表達(dá)水平的試劑，包括各種本領(lǐng)域已知可以抑制靶基因表達(dá)的分子，例如但不限于反義核酸，鎖核酸，肽核酸，siRNA，shRNA，微小RNA等(統(tǒng)稱(chēng)為靶基因抑制分子)；或攜帶或表達(dá)反義核酸，鎖核酸，肽核酸，siRNA，shRNA，微小RNA等的構(gòu)建物。如本文所用，所述的“異源”是指來(lái)自不同來(lái)源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系，獲知來(lái)自不同來(lái)源的蛋白(或核酸)與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系。例如，如果核酸與宿主細(xì)胞的組合通常不是天然存在的，則核酸對(duì)于該宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是異源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來(lái)說(shuō)是“異源的”。如本文所用，所述的“合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌”是指本領(lǐng)域已知可以應(yīng)用于合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌或宿主細(xì)胞。所述的宿主菌包括但不限于：大腸桿菌，改進(jìn)的大腸桿菌(包括轉(zhuǎn)化入pccB和pccA的菌株，轉(zhuǎn)化入eryAI，AII和/或AIII的菌株等)。優(yōu)選的宿主菌是敲除了丙酸代謝操縱子并在該敲除位點(diǎn)上整合了磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶基因sfp的大腸桿菌，且其中轉(zhuǎn)化有表達(dá)編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS2的基因、編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS3的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶β-CT亞基的基因、編碼丙酰輔酶A羧化酶a-CT亞基的基因和編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS1的基因。為了優(yōu)化聚酮類(lèi)化合物6-dEB的生成，本發(fā)明人作了廣泛地研究，找到了適合于進(jìn)行改良的靶基因，下調(diào)所述靶基因的表達(dá)有利于促進(jìn)6-dEB的生成。本發(fā)揭示的各靶基因均是本領(lǐng)域已知的基因，本領(lǐng)域人員可以通過(guò)GenBank等平臺(tái)查詢(xún)到這些基因的序列信息，因此，本領(lǐng)域人員易于獲得這些基因。本發(fā)明還提供了一個(gè)基因集合，所述基因集合包括：(a)核苷酸合成和其它代謝模塊基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE或yieK；(b)磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH或hpt；(c)TCA循環(huán)和氧化磷酸化模塊基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA或cyoB；(d)糖代謝模塊基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA或agaW；(e)6dEB前體代謝模塊基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta或ybiW；(f)脂肪酸代謝模塊基因靶點(diǎn)fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2或dhaH；(g)氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝模塊基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA或tnaA。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所揭示的內(nèi)容，可以從該基因集合中選擇一個(gè)或多個(gè)基因，進(jìn)行如本發(fā)明所述的方法的操作，在所選的靶基因基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)下調(diào)其在宿主細(xì)胞中表達(dá) 的物質(zhì)，從而用于促進(jìn)6-dEB的生成。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的抑制靶基因干擾的干擾分子是sRNA或攜帶所述sRNA的構(gòu)建物(含表達(dá)載體)。較佳地，所述的sRNA包括以下結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子、靶基因抑制分子(如靶基因結(jié)合序列)和終止子；較佳地，所述靶基因抑制分子與終止子之間，還包括：micF序列。啟動(dòng)子和終止子的設(shè)計(jì)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，任何適用的啟動(dòng)子和終止子均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的啟動(dòng)子是Pr啟動(dòng)子，所述的終止子是TE終止子。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮對(duì)啟動(dòng)子和終止子作出變化，這仍然包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，所述的sRNA位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的sRNA。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。應(yīng)理解，只要能夠?qū)崿F(xiàn)sRNA的插入且轉(zhuǎn)化細(xì)胞后能夠下調(diào)靶基因的表達(dá)，任何表達(dá)載體均可選用的。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌，所述的宿主菌中轉(zhuǎn)化有抑制靶基因表達(dá)的干擾分子。所述的宿主菌可高效地生產(chǎn)聚酮類(lèi)化合物6-dEB。本發(fā)明還提供了用于促進(jìn)合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌生物合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的試劑盒，所述的試劑盒中包括：轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的所有用于合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)菌株用于生產(chǎn))；較佳地，所述的試劑盒中包括：轉(zhuǎn)化有本發(fā)明更優(yōu)選的用于合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB的宿主菌(轉(zhuǎn)化有下調(diào)所述的靶基因或靶基因組合的基因表達(dá)的干擾分子的宿主菌)的總和?；蛘?，所述的試劑盒中包括：本發(fā)明所述的sRNA的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)sRNA進(jìn)行應(yīng)用)；較佳地，所述的試劑盒中包括：本發(fā)明更優(yōu)選的sRNA(下調(diào)所述的靶基因或靶基因組合的基因表達(dá)的sRNA)的總和。所述的試劑盒中包括：包含有本發(fā)明所述的sRNA的載體的總和(本領(lǐng)域人員可以從中選擇其中的一個(gè)或多個(gè)載體進(jìn)行應(yīng)用)；較佳地，所述的試劑盒中包括：包含有本發(fā)明更優(yōu)選的sRNA(下調(diào)所述的靶基因或靶基因組合的基因表達(dá)的sRNA)的載 體的總和。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明的所使用的菌株、培養(yǎng)基及相關(guān)試劑如下：菌株E.coliDH10B作為克隆宿主，菌株E.coliWG(pZG07/pZG08)作為聚酮類(lèi)化合物6-dEB合成的宿主(參見(jiàn)盧志國(guó)，華東理工大學(xué)博士學(xué)位論文，2011年)。分子克隆相關(guān)的酶、DNA片段與質(zhì)粒抽提純化試劑盒分別由NEB公司、TaKaRa公司及Axygen公司提供。各培養(yǎng)基組分、抗生素及其他相關(guān)試劑購(gòu)自O(shè)xiod、國(guó)藥集團(tuán)與上海生物工程有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。本發(fā)明中涉及的6-dEB發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：NaCl，10；蛋白胨，10；酵母提取物，5；甘油，15；100mMHEPES，pH調(diào)節(jié)為7.6。本發(fā)明中涉及的誘導(dǎo)劑：IPTG：24μg/ml；前體：丙酸鈉20mM；本發(fā)明中涉及的誘導(dǎo)條件：22℃，250rpm，100ml搖瓶裝液10ml培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)5d。本發(fā)明中涉及的抗生素濃度分別為氨芐青霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L，氯霉素34mg/L。實(shí)施例1、sRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明是通過(guò)sRNA干擾技術(shù)進(jìn)行調(diào)控靶點(diǎn)基因的表達(dá)，即表達(dá)sRNA與靶基因的mRNA結(jié)合，從而阻遏靶基因的mRNA與核糖體的結(jié)合，繼而抑制靶基因的表達(dá)。本發(fā)明是通過(guò)對(duì)所選基因靶點(diǎn)進(jìn)行弱化，鑒定出有利于提高合成聚酮類(lèi)化合物的靶點(diǎn)基因。采用化學(xué)合成的deoB-sRNA基因序列片段(由上海捷端生物工程有限公司合成)，包括Pr啟動(dòng)子、deoB靶基因結(jié)合位點(diǎn)(DNA序列長(zhǎng)度為24bp，caccataataaatgcacgtttcat(SEQIDNO:1)；與磷酸戊糖變位酶deoB基因從ATG起始序列開(kāi)始后的24bp完全互補(bǔ)，deoB基因Genbank號(hào)：NC_012971.2)、micF序列(Genbank號(hào)：NC_000913.3)和TE終止子，并在兩端引入NdeI和HindIII酶切位點(diǎn)。此sRNA基因序列片段DNA序列如下(SEQIDNO:52)：catatgggatcctaacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgccaccataataaatgcacgtttcattttctgttgggccattgcattgccactgattttccaacatataaaaagacaagcccgaacagtcgtccgggctttttttctcgagct cgagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgtttttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttataactagtagatctaagcttsRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以pACYCDuet-1質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen)為PCR模板，通過(guò)引物pACYC-F和pACYC-R(引物兩端引入NdeI和HindIII酶切位點(diǎn))克隆得到只包含氯霉素抗性和p15A復(fù)制子的載體片段，應(yīng)用清潔回收試劑盒(購(gòu)自Axygen)回收后采用NdeI和HindIII雙酶切此載體片段；同時(shí)采用NdeI和HindIII雙酶切上述化學(xué)合成的deoB-sRNA序列片段。用清潔回收試劑盒直接回收雙酶切后的載體片段和deoB-sRNA片段，然后通過(guò)T4連接酶將這兩個(gè)回收片段連接，得到模板質(zhì)粒pJF650(圖1)，用于弱化大腸桿菌中deoB基因的表達(dá)。以模板質(zhì)粒pJF650為模板，采用表1中的引物和表2中的PCR條件，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增直接獲得能夠弱化大腸桿菌中(1)TCA循環(huán)和氧化磷酸化模塊基因frdD、frdA、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、sucC、sucD、cyoA、cyoB；(2)糖代謝模塊基因aceF、pgi、lpdA、ppk、ptsH、ptsI、glcF、glcE、fsaA、agaW；(3)6dEB前體代謝模塊基因yjiM、scpA、scpB、tdcD、tdcE、pflB、pflD、PaaF、ackA、pta、ybiW；(4)磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因yaeR、rpiA、rpiB、purH、pyrB、pyrI、cysQ、pyrC、gmk、guaA、guaB、ndk、pyrF、pyrE、pyrH、hpt；(5)脂肪酸代謝模塊基因靶點(diǎn)fadJ、fadB、dhaK1、dhaK2、dhaH；(6)氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝模塊基因leuC、leuD、serC、serB、serA、gdhA、tnaA；(7)核苷酸合成和其它代謝模塊基因purT、lsrC、hemN、zwf、pgl、gnd、rpe、talA、talB、tktA、tktB、ulaE、yieK等不同靶點(diǎn)基因表達(dá)的sRNA質(zhì)粒文庫(kù)pSJ01(靶點(diǎn)基因tdcD)、pSJ02(靶點(diǎn)基因scpB)、pSJ03(靶點(diǎn)基因scpA)、pSJ04(靶點(diǎn)基因ybiW)、pSJ05(靶點(diǎn)基因pflB)、pSJ06(靶點(diǎn)基因tdcE)、pSJ07(靶點(diǎn)基因pflD)、pSJ08(靶點(diǎn)基因paaF)、pSJ09(靶點(diǎn)基因fadJ)、pSJ10(靶點(diǎn)基因fadB)、pSJ11(靶點(diǎn)基因ackA)、pSJ12(靶點(diǎn)基因pta)、pSJ13(靶點(diǎn)基因leuD)、pSJ14(靶點(diǎn)基因leuC)、pSJ15(靶點(diǎn)基因yjiM)、pSJ16(靶點(diǎn)基因purT)、pSJ17(靶點(diǎn)基因dhaK1)、pSJ18(靶點(diǎn)基因dhaK2)、pSJ19(靶點(diǎn)基因dhaH)、pSJ20(靶點(diǎn)基因ptsH)、pSJ21(靶點(diǎn)基因ptsI)、pSJ22(靶點(diǎn)基因fsaA)、pSJ24(靶點(diǎn)基因ppk)、pSJ26(靶點(diǎn)基因aceF)、pSJ29(靶點(diǎn)基因cyoA)、pSJ30(靶點(diǎn)基因frdD)、pSJ33(靶點(diǎn)基因frdA)、pSJ34(靶點(diǎn)基因pgi)、pSJ35(靶點(diǎn)基因sdhA)、pSJ36(靶點(diǎn)基因sdhB)、pSJ37(靶點(diǎn)基因sdhC)、pSJ38(靶點(diǎn)基因sdhD)、pSJ39(靶點(diǎn)基因sucC)、pSJ40(靶點(diǎn)基因sucD)、pSJ41(靶點(diǎn)基因tnaA)、pSJ43(靶點(diǎn)基因glcF)、pSJ44(靶點(diǎn)基因glcE)、pSJ50(靶點(diǎn)基因yaeR)、pSJ53(靶點(diǎn)基因lsrC)、pSJ54(靶點(diǎn)基因hemN)、pSJ66(靶點(diǎn)基因agaW)、pJF663(靶點(diǎn)基因zwf)、pJF666(靶點(diǎn)基因pgl)、pJF670(靶點(diǎn)基因gnd)、pSJ128(靶點(diǎn)基因rpe)、pSJ129(靶點(diǎn)基因talA)、pSJ130(靶點(diǎn)基因talB)、pSJ131(靶點(diǎn)基因tktA)、pSJ132(靶點(diǎn)基因tktB)、pSJ133(靶點(diǎn)基因ulaE)、 pSJ141(靶點(diǎn)基因yieK)、pSJ147(靶點(diǎn)基因purH)、pSJ148(靶點(diǎn)基因pyrB)、pSJ149(靶點(diǎn)基pyrI)、pSJ150(靶點(diǎn)基因cysQ)、pSJ151(靶點(diǎn)基因pyrC)、pSJ152(靶點(diǎn)基因gmk)、pSJ153(靶點(diǎn)基因guaA)、pSJ154(靶點(diǎn)基因guaB)、pSJ155(靶點(diǎn)基因ndk)、pSJ156(靶點(diǎn)基因pyrF)、pSJ157(靶點(diǎn)基因pyrE)、pSJ158(靶點(diǎn)基因pyrH)、pSJ159(靶點(diǎn)基因hpt)、pJF656(靶點(diǎn)基因gdhA)、pJF664(靶點(diǎn)基因cyoB)、pJF667(靶點(diǎn)基因rpiA)、pJF668(靶點(diǎn)基因rpiB)、pJF671(靶點(diǎn)基因lpdA)、pJF672(靶點(diǎn)基因serC)、pJF673(靶點(diǎn)基因serB)和pJF674(靶點(diǎn)基因serA)(表3)。以構(gòu)建弱化sucC(表達(dá)琥珀酸輔酶A合成酶)靶基因的sRNA質(zhì)粒為例，采用表1中的sucC-sRNA-F和sucC-sRNA-R引物及表2中的PCR條件，以模板質(zhì)粒pJF650為模板，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR直接將pJF650質(zhì)粒骨架中24bp的deoB靶基因結(jié)合位點(diǎn)突變成sucC靶基因結(jié)合位點(diǎn)(與sucC基因從ATG起始序列開(kāi)始后的24bpDNA序列完全互補(bǔ))，得到能夠弱化sucC基因表達(dá)的sRNA質(zhì)粒pSJ39。表1、質(zhì)粒構(gòu)建的引物表2、PCR條件表3、sRNA技術(shù)調(diào)控靶點(diǎn)功能實(shí)施例2、E.coliWG菌株的構(gòu)建對(duì)E.coli敲除其丙酸代謝操縱子并在該位點(diǎn)上整合來(lái)自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)表面素合成途徑基因簇中的磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶基因sfp，構(gòu)建適于聚酮化合物生物合成的E.coliWG菌株，其具體步驟如下：首先，以B.subtilis的基因組作為模板，采用引物sfp-F和sfp-R(表4)通過(guò)PCR擴(kuò)增675bp的sfp基因(編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，Genbank號(hào)：NC_000964)，然后用NdeI和BamHI分別酶切PCR產(chǎn)物和pET21c質(zhì)粒(購(gòu)自Novagen公司)后，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET21c-sfp；然后，以質(zhì)粒pUC19-sacB/kan作為模板，用引物SacB/Kan-F和SacB/Kan-R(表4)擴(kuò)增帶有同源臂的篩選標(biāo)記基因的Kan-SacB片段(約2.8Kb)，然后利用λRed/ET同源重組方法(Datsenkietal.PNAS，2000，97：6640-6645)將Kan-SacB整合到E.coliBL21(DE3)染色體的丙酸代謝操縱子中，替換丙酸代謝操縱子中prpR，prpB，prpC和prpD的DNA片段；利用WG-F和WG-R作為引物，擴(kuò)增位于重組菌染色體上的SacB/Kan基因進(jìn)行驗(yàn)證；然后，利用sfpR-F和sfpR-R從pET21c-sfp中擴(kuò)增帶有T7啟動(dòng)子的sfp基因；再次采用λRed/ET同源重組方法將重組菌中SacB-Kan片段替換為T(mén)7-sfp-T7片段，最終得到本發(fā)明所需的適用于聚酮化合物生物合成的E.coliWG菌株，其具體改構(gòu)過(guò)程的示意圖如圖2所示。表4、本實(shí)例所用的引物及其所對(duì)應(yīng)的堿基序列實(shí)施例3、質(zhì)粒pZG07的構(gòu)建以紅霉糖多孢菌的基因組DNA為模板，利用引物eryAII-F、eryAII-R和eryAIII-F、eryAIII-R(表5)分別PCR擴(kuò)增eryAII(編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS2，來(lái)源于Genbank號(hào)：NC_009142中)和eryAIII(編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS3，來(lái)源于Genbank號(hào)：NC_009142)基因，經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物分別用NdeI/HindIII雙酶切，然后用T4DNA連接酶將雙酶切的PCR產(chǎn)物分別與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pET21c連接，分別獲得質(zhì)粒pZG05(含有eryAII)和pZG06(含有eryAIII)；然后用XbaI/EcoRI酶切pZG06，回收含eryAIII基因的DNA片段后，用T4DNA連接酶將其與經(jīng)SpeI/EcoRI酶切的質(zhì)粒pZG05連接，構(gòu)建質(zhì)粒pZG07，所述的聚酮合成基因簇質(zhì)粒pZG07的構(gòu)建過(guò)程示意圖如圖3所示。表5、本實(shí)例所用的引物及其所對(duì)應(yīng)的堿基序列實(shí)施例4、質(zhì)粒pZG08的構(gòu)建以天藍(lán)色鏈霉菌的基因組DNA為模板，利用引物pccB-F，pccB-R和accA2-F，accA2-R(表6)分別擴(kuò)增pccB基因(編碼丙酰輔酶A羧化酶β-CT亞基，來(lái)源于Genbank號(hào)：NC_003888.3)和accA基因(編碼丙酰輔酶A羧化酶a-CT亞基，來(lái)源于Genbank號(hào)：NC_003888.3)，經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物分別用NcoI/EcoRI雙酶切，然后用T4DNA連接酶將雙酶切的PCR產(chǎn)物連接到經(jīng)NcoI/EcoRI雙酶切處理的pET28a質(zhì)粒上，構(gòu) 建得到質(zhì)粒pZG01和pZG02；然后用XbaI/EcoRI雙酶切處理pZG02，回收含基因accA2DNA片段，用T4DNA連接酶將其與經(jīng)SpeI/EcoRI雙酶切處理的pZG01質(zhì)粒連接，得到質(zhì)粒pZG03。以紅霉糖多孢菌基因組DNA為模板，利用引物eryAI-F和eryAI-RPCR擴(kuò)增eryAI基因(編碼紅霉素鏈霉菌聚酮合成酶DEBS1，Genbank號(hào)：NC_009142)，經(jīng)純化后用NdeI/EcoRI雙酶切處理，然后用T4DNA連接酶將其連接到經(jīng)NdeI/EcoRI雙酶切處理的質(zhì)粒pET28a上，構(gòu)建得到質(zhì)粒pZG04；利用BglII對(duì)pZG04進(jìn)行線性化并回收線性化片段，隨后用核酸外切酶I對(duì)線性化片段末端進(jìn)行消化，使BglII酶切后的粘性末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒撕笤俅位厥赵摼€性化片段，最后將該片段用HindIII消化后回收eryAI基因片段；對(duì)pZG03首先用EcoRI將其線性化并回收，隨后用核酸外切酶I將EcoRI的粘性末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒瞬⒒厥眨詈髮⒕€性化的pZG03用HindIII消化并回收。將上述回收后的pZG03和eryAI基因片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒pZG08，所述的質(zhì)粒pZG08的構(gòu)建過(guò)程示意圖如圖4所示。表6、本實(shí)例所用的引物及其所對(duì)應(yīng)的堿基序列實(shí)施例5、聚酮化合物6-dEB工程菌的構(gòu)建及其5L罐發(fā)酵培養(yǎng)將質(zhì)粒pZG07，pZG08共同轉(zhuǎn)化到上述所得的聚酮化合物異源合成宿主菌E.coliWG后，得到能有效合成聚酮化合物的工程菌E.coliWG(pZG07/pZG08)(用于生產(chǎn)紅霉素前體6-dEB)。挑取單菌落于2ml加有100mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，得一級(jí)種子。然后將上述所得的一級(jí)種子以1％接種量接種到含有50ml的加有100mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，220rpm，37℃培養(yǎng)至OD600約為1，得二級(jí)種子。然后將所得的二級(jí)種子以1％接種量接種到含有4L的加有100mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基的5L罐中，同時(shí)加入終濃度為0.1mM的IPTG，20mM的丙酸鈉于22℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，發(fā)酵結(jié)束。實(shí)施例6、6-dEB制備與HPLC-ELSD分析檢測(cè)實(shí)施例5中發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到粗浸膏。粗浸膏在反相C-18柱中利用甲醇水體系進(jìn)行洗脫，甲醇比例分別是30％、50％、70％和100％。對(duì)分離組分利用Ultimate3000分析型HPLC分析。分析結(jié)果顯示產(chǎn)物6-dEB主要存在于甲醇比例70％的組分中，HPLC分析見(jiàn)圖5。利用反相C-18柱分離上述含6-dEB的粗組分，并用HPLC-ELSD分析制備，得到6-dEB純品。HPLC-ELSD檢測(cè)制備條件如下：70％甲醇洗脫下的組分，利用Ultimate3000制備型HPLC進(jìn)行分離制備，色譜柱型號(hào)為：TSK-100V，5μm，19*150mm，流速15ml/min，流動(dòng)相50％乙腈/水體系等度洗脫。ELSD檢測(cè)器條件：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度：95℃；氣體流速：1.6l/min；增益：16。保留時(shí)間tR：10.3min。對(duì)6-dEB純品利用核磁分析驗(yàn)證，氫譜圖見(jiàn)圖6，從圖可知，制備得到的純品的H譜化學(xué)位移與文獻(xiàn)報(bào)道一致(XinGao,SangKookWoo,MichaelJ.Krische,TotalSynthesisof6-DeoxyerythronolideBviaC-CBond-FormingTransferHydrogenation,J.Am.Chem.Soc.2013,135,4223-4226)，確定此化合物為6-dEB。將制備的標(biāo)準(zhǔn)品配制成40mg/L的甲醇溶液，利用Ultimate3000分析型HPLC分析檢測(cè)，條件：色譜柱TSK-100V，5μm，4.6*150mm；流速1ml/min；流動(dòng)相乙腈/水，50％的乙腈梯度洗脫。ELSD為檢測(cè)器，條件：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度：95℃；氣體流速：1.6l/min；增益：16。從圖7可知，制備得到6-dEB純品有非常高的純度，純度達(dá)到98％以上。實(shí)施例7、sRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與發(fā)酵將實(shí)施例1中的表達(dá)的各sRNA質(zhì)粒(以pACYCDuet-1(購(gòu)自Novagen公司)作為空白對(duì)照)分別轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞E.coliWG(pZG07/pZG08)(用于生產(chǎn)紅霉素前體6-dEB)中，分別挑取單菌落至含羧芐青霉素(100mg/L)，卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的2mlLB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm/min過(guò)夜培養(yǎng)12h，作為搖床發(fā)酵培養(yǎng)種子。按1％接種量將上述種子接種于含10ml6-dEB發(fā)酵培養(yǎng)基(含羧卞青霉素,卡那霉素和氯霉素抗生素)的100ml搖瓶中，同時(shí)加入最終濃度為20mM的丙酸鈉前體和100mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)初始誘導(dǎo)，每個(gè)樣品平行三次。置于22℃，250rpm/min的搖床上發(fā)酵5d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液倒入10ml離心管中，-20℃保存，用于后續(xù)的檢測(cè)與分析。實(shí)施例8、實(shí)施例7中發(fā)酵液的6-dEB分析檢測(cè)將實(shí)施例7中發(fā)酵液利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)進(jìn)行分析檢測(cè)。條件：色譜柱TSK-100V，5μm，4.6*150mm；流速1ml/min；流動(dòng)相乙腈/水，50％的乙腈等度洗脫。ELSD為檢測(cè)器，條件：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度：95℃；氣體流速：1.6l/min；增益：16。不同基因弱化對(duì)6-dEB合成的影響結(jié)果見(jiàn)表7(以對(duì)照組E.coliWG(pZG07/pZG08/pACYCDunet-1)的6-dEB產(chǎn)量為100％)。由表7可知：利用sRNA對(duì)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)基因弱化都是有利于合成目標(biāo)產(chǎn)物6-dEB。例如，菌株E.coliWG(pZG07/pZG08/pSJ39)，其調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)閟ucC(合成酶：琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基，succinyl-CoAsynthetaseβsubunit)。相對(duì)于對(duì)照組E.coliWG(pZG07/pZG08/pACYCDunet-1)，弱化sucC可使宿主合成6-dEB產(chǎn)量提高率達(dá)到63.2％。提高產(chǎn)量最高的是E.coliWG(pZG07/pZG08/pSJ130)，其調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)閠alB(轉(zhuǎn)醛醇酶，transaldolase)，弱化talB可使宿主合成6-dEB產(chǎn)量提高率達(dá)到1008.81％。采用sRNA方法調(diào)控大腸桿菌底盤(pán)細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)弱化這些基因能顯著提高聚酮化合物的異源合成。通過(guò)弱化提高聚酮化合物產(chǎn)量超過(guò)20％以上的靶點(diǎn)有：ybiW、fadB、ackA、pta、yjiM、dhaK2、ptsH、ptsI、frdD、frdA、sdhA、sucC、sucD、glcE、lsrC、rpiA、serC、talA、talB、zwf、pyrI、cysQ、gmk、guaB、pyrH、hpt。表7、sRNA干擾對(duì)異源宿主E.coli合成6-dEB的影響實(shí)施例9、sRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)組合弱化進(jìn)一步提高聚酮類(lèi)化合物6-dEB產(chǎn)量通過(guò)實(shí)施例8中的數(shù)據(jù)可知：選取弱化后提高聚酮化合物產(chǎn)量超過(guò)20％以上的靶點(diǎn)ybiW、fadB、ackA、pta、yjiM、dhaK2、ptsH、ptsI、frdD、frdA、sdhA、sucC、sucD、glcE、lsrC、rpiA、serC，將以上這些弱化質(zhì)粒的氯霉素抗性替換為阿普拉霉素抗性，用于后續(xù)組合共轉(zhuǎn)的抗性篩選。替換抗性質(zhì)粒構(gòu)建是基于POE-PCR技術(shù)方法(Youetal.SimplecloningviadirecttransformationofPCRproduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilisApplEnvironMicrobiol，78(5):1593-1595)，以替換對(duì)照質(zhì)粒pACYCDuent-1的抗性為例，首先，采用表8中Aparamycin-F和Aparamycin-R引物及PCR條件(見(jiàn)表9)，以pKC1139(鏈霉菌通用質(zhì)粒)為模板，通過(guò)PCR直接將pKC1139質(zhì)粒中阿普拉霉素抗性基因擴(kuò)增出來(lái)；采用表8中sRNA-Aparamycin-F和sRNA-Aparamycin-R引物及PCR條件，以pACYCDuent-1為模板，通過(guò)PCR將pACYCDuent-1質(zhì)粒除氯霉素抗性基因以外的序列擴(kuò)增出來(lái)。接著采用表9中PCR條件(注：不用加引物，模板為第一步擴(kuò)增出來(lái)的阿普拉霉素抗性基因和不含氯霉素抗性基因的pACYCDuent-1，各1μl)，進(jìn)行PCR，將此PCR產(chǎn)物用PCR清潔回收試劑盒回收后，直接轉(zhuǎn)化到DH10B中，涂布于含50mg/L阿普拉霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落于2ml含50mg/L阿普拉霉素的LB培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pSJ77。表8、引物信息和PCR條件表9、PCR條件其余的表達(dá)sRNA質(zhì)粒替換抗性同上，采用相同引物和PCR條件將質(zhì)粒上的氯霉素抗性替換為阿普拉霉素抗性，各sRNA質(zhì)粒信息如表10。表10、sRNA質(zhì)粒信息將上述構(gòu)建表達(dá)sRNA質(zhì)粒(以pSJ77作為空白對(duì)照)和相對(duì)產(chǎn)量提高20％的實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)sRNA質(zhì)粒兩兩組合，共轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞E.coliWG(pZG07/pZG08)(用于生產(chǎn)紅霉素前體6-dEB)，利用實(shí)施例7的發(fā)酵方法和實(shí)施例8中的6-dEB分析檢測(cè)。sRNA組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組E.coliWG(pZG07/pZG08/pSJ39/pSJ77)的6-dEB產(chǎn)量為100％，通過(guò)組合弱化關(guān)鍵靶點(diǎn)基因來(lái)進(jìn)一步提高聚酮類(lèi)化合物6-dEB的產(chǎn)量。組合sRNA干擾對(duì)異源宿主E.coli合成6-dEB的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表11。表11、組合sRNA干擾對(duì)異源宿主E.coli合成6-dEB的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管多數(shù)組合弱化不能有效提高聚酮類(lèi)化合物的合成，但組合弱化frdD和sucC可使6-dEB產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高，比單獨(dú)弱化sucC的產(chǎn)量再提高24％以上，同時(shí)弱化lsrC和frdD可使6-dEB產(chǎn)量進(jìn)一步提高17％以上。實(shí)施例10、弱化兩靶點(diǎn)的sRNA質(zhì)粒進(jìn)一步提高聚酮類(lèi)化合物6-dEB產(chǎn)量根據(jù)實(shí)施例8中的數(shù)據(jù)可知：提高聚酮化合物產(chǎn)量超過(guò)550％的弱化靶點(diǎn)有：核苷酸合成和其它代謝模塊基因talA、talB、zwf和磷酸戊糖和乙醛酸途徑模塊基因pyrI、cysQ、gmk、guaB、pyrH、hpt，考察同時(shí)弱化這兩個(gè)模塊的靶點(diǎn)對(duì)合成聚酮類(lèi)化合物6-dEB產(chǎn)量的影響。弱化兩靶點(diǎn)的sRNA質(zhì)粒均采用酶切串聯(lián)的方法進(jìn)行構(gòu)建。以構(gòu)建pSJ333為例：以pSJ130為模板，以sRNA-F/R為引物(表12)擴(kuò)增靶向talB的sRNA骨架，PCR條件以實(shí)施例9中表9相同。清潔回收PCR產(chǎn)物后，用BamHI和HindIII酶切；同時(shí)用BglII和HindIII酶切pSJ129為載體，清潔回收。將上述PCR酶切產(chǎn)物和pSJ129 雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，得到質(zhì)粒pSJ333。其余質(zhì)粒利用相同的方式獲得，最終得到質(zhì)粒pSJ404-pSJ421，質(zhì)粒信息見(jiàn)表13。表12引物信息Primer名稱(chēng)序列(5’→3’)SRNA-FCGGGATCCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTASRNA-RCCCAAGCTTAGATCTACTAGTTATAAACGCAGAAAGG表13組合sRNA質(zhì)粒信息名稱(chēng)sRNA技術(shù)調(diào)控(弱化)靶點(diǎn)抗性pSJ333talA+talB氯霉素pSJ334cysQ+guaB氯霉素pSJ404talA+pyrI氯霉素pSJ405talA+cysQ氯霉素pSJ406talA+gmk氯霉素pSJ407talA+guaB氯霉素pSJ408talA+pyrH氯霉素pSJ409talA+hpt氯霉素pSJ410talB+pyrI氯霉素pSJ411talB+cysQ氯霉素pSJ412talB+gmk氯霉素pSJ413talB+guaB氯霉素pSJ414talB+pyrH氯霉素pSJ415talB+hpt氯霉素pSJ416zwf+pyrI氯霉素pSJ417zwf+cysQ氯霉素pSJ418zwf+gmk氯霉素pSJ419zwf+guaB氯霉素pSJ420zwf+pyrH氯霉素pSJ421zwf+hpt氯霉素將上述構(gòu)建表達(dá)組合sRNA質(zhì)粒(以pACYCDuent-1作為空白對(duì)照)轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞 E.coliWG(pZG07/pZG08)(用于生產(chǎn)紅霉素前體6-dEB)，利用實(shí)施例7的發(fā)酵方法和實(shí)施例8中的6-dEB分析檢測(cè)。sRNA組合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組E.coliWG(pZG07/pZG08/pSJ39/pSJ77)的6-dEB產(chǎn)量為100％，通過(guò)組合弱化關(guān)鍵靶點(diǎn)基因來(lái)進(jìn)一步提高聚酮類(lèi)化合物6-dEB的產(chǎn)量。組合sRNA干擾對(duì)異源宿主E.coli合成6-dEB的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表14和圖8。實(shí)驗(yàn)表明，盡管所有組合弱化都能有效提高聚酮類(lèi)化合物的合成，但只有組合弱化talA+guaB和zwf+guaB可使6-dEB產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高，比單獨(dú)弱化talB的產(chǎn)量再提高32％以上，比對(duì)照組的產(chǎn)量再提高1300％以上，使6-dEB搖瓶產(chǎn)量可達(dá)到210mg/L以上。表14、組合sRNA干擾對(duì)異源宿主E.coli合成6-dEB的影響質(zhì)粒名稱(chēng)sRNA質(zhì)粒弱化的靶點(diǎn)6-dEB產(chǎn)量(mg/L)6-dEB相對(duì)產(chǎn)量提高率(％)pACYCDuent-1control14.300.00pSJ404talA+pyrI135.10844.76pSJ405talA+cysQ128.87801.19pSJ406talA+gmk117.09718.81pSJ407talA+guaB209.381364.20pSJ408talA+pyrH153.30972.03pSJ409talA+hpt118.84731.05pSJ410talB+pyrI145.38916.64pSJ411talB+cysQ120.11739.93pSJ412talB+gmk138.00865.03pSJ413talB+guaB60.05319.93pSJ414talB+pyrH149.79947.48pSJ415talB+hpt100.32601.54pSJ416zwf+pyrI152.75968.18pSJ417zwf+cysQ130.45812.24pSJ418zwf+gmk119.39734.90pSJ419zwf+guaB210.421371.47pSJ420zwf+pyrH75.35426.92在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單 獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3