一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及乳粉中低聚果糖的定量檢測，提出一種是乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其包括步驟：（1）制備標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，得不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)譜圖；（2）將步驟1獲得的標(biāo)準(zhǔn)譜圖按低聚果糖品種分別制作濃度與色譜峰面積關(guān)系曲線圖；（3）乳粉樣品的預(yù)處理及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；（4）樣品中的各低聚果糖的含量的確定，將步驟3中獲得的樣品譜圖的保留時間確定低聚果糖品種并將其色譜峰面積與步驟2中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，用插入法確定低聚果糖含量。采用本發(fā)明具有前處理過程簡單，檢測速度快，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)。
【專利說明】一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乳粉中低聚果糖的定量檢測，尤其是乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]低聚果糖(fructo-oligosacchrides, F0S)又名鹿果低聚糖、寡果糖,是低聚糖的一種。它是由蔗糖和I~4個果糖基通過β_1，2糖苷鍵與蔗糖中的D-果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖(GF2)，蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)和蔗果六糖(GF5)及其混合物的總稱。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)，甜度為蔗糖的0.3^0.6倍。近年研究發(fā)現(xiàn)，低聚果糖具有良好的生理功能，如調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌、促進(jìn)鈣吸收、抗齲齒、調(diào)血脂等。低聚果糖在中國已經(jīng)被國家食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)為保健食品，添加在乳制品、乳酸菌飲料、固體飲料、糖果、餅干、面包、果凍、冷飲等多種食品中。
[0003]將低聚果糖添加到乳粉中是提升乳粉功能的有效方法之一。尤其是嬰幼兒乳粉，低聚果糖可以促進(jìn)嬰幼兒腸蠕動，促進(jìn)腸道中有益菌生長，加速腸內(nèi)廢物和有害菌排出，防止腹瀉，減少便秘等?，F(xiàn)在國內(nèi)市場上銷售的嬰幼兒乳粉大多標(biāo)注添加低聚果糖，而添加“益生元”(低聚果糖)的廣告也成為各大生產(chǎn)企業(yè)的主要宣傳內(nèi)容。顯然，低聚果糖的含量應(yīng)該作為乳粉中重要的質(zhì)量指標(biāo)，然而目前國內(nèi)并沒有完善成熟的乳粉中低聚果糖的檢測標(biāo)準(zhǔn)，這使得相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)管缺失，不利于保障乳制品的質(zhì)量安全。因此，開發(fā)乳粉中低聚果糖的檢測方法，并使其具備準(zhǔn)確、高靈敏度的特點(diǎn)顯得意義重大。
[0004]目前國內(nèi)已發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23528-2009《低聚果糖》，標(biāo)準(zhǔn)中涉及了低聚果糖的檢測方法，檢測乳粉中的低聚果糖也有一些文獻(xiàn)報(bào)道。這些方法主要利用高效液相色譜配示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器達(dá)到檢測的目的，檢出限一般在I mg/kg的數(shù)量級。然而，示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器`本身不能對低聚果糖進(jìn)行定性，容易因?yàn)殡s質(zhì)干擾造成誤差，可能導(dǎo)致結(jié)果誤判。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法使用二級串聯(lián)的質(zhì)譜作為檢測器，低聚果糖的檢出限可以達(dá)到0.01 mg/kg的數(shù)量級，檢測靈敏度可顯著提高。此外，二級質(zhì)譜通過同時掃描待測化合物母離子分子離子峰和子離子分子離子峰的方式，達(dá)到針對不同低聚果糖的定性檢測，檢測準(zhǔn)確性也顯著增強(qiáng)。利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對乳粉中低聚果糖的檢測將有效地克服現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其克服現(xiàn)有技術(shù)不足，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、靈敏。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征包括以下步驟:
(I)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測
稱取各種低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品并將其配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；再將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水逐級稀釋，分別配成至少5種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測并得到標(biāo)準(zhǔn)譜圖，標(biāo)準(zhǔn)譜圖中保留時間確定低聚果糖品種，色譜峰面積與對應(yīng)的低聚果糖濃度成函數(shù)關(guān)系。
[0007](2)將步驟I獲得的標(biāo)準(zhǔn)譜圖按低聚果糖品種分別制作濃度與色譜峰面積關(guān)系曲線圖。
[0008](3)乳粉樣品進(jìn)行預(yù)處理及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測
稱取一定量的乳粉樣品，依次加入蒸餾水和乙醇，渦旋振蕩后，超聲溶解，離心，取上清液稀釋后過濾膜過濾，取濾液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，得樣品譜圖。
[0009](4)樣品中的各低聚果糖的含量的確定
將步驟3獲得的樣品譜圖的保留時間確定低聚果糖品種并將其色譜峰面積與步驟2對應(yīng)的低聚果糖品種的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，用插入法確定樣品中的各低聚果糖的含量。
[0010]優(yōu)化方案是:步驟I中的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從0.5 mg/L至20 mg/L分為6級，級間間隔由小至大大致倍增，每濃度級中各低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品含量相同。
[0011]在步驟I和2中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)條件如下:
色譜條件:
a)色譜柱:XBridge TM Amide, 3.5 μ m, 4.6 X 150mm ;
b)進(jìn)樣量:5~20μ L ；
c)柱溫:30^50°C ；
d)流速:0.3~0.6 ml ,/mi η ；
e)流動相和洗脫時間:
流動相A =30/70乙腈/水溶液含0.10%氨水；
流動相B:80/20乙腈/水溶液含0.10%氨水；
洗脫時間0~30 min,流動相A從100%到60%,流動相B從0%到40% ；
洗脫時間30~32 min,流動相A保持60%，流動相B保持40% ；
洗脫時間32~34 min,流動相A從60%到0%，流動相B從40%到100% ；
洗脫時間34~35 min,流動相A保持0%，流動相B保持100%。
[0012]質(zhì)譜條件:
a)電離模式:負(fù)離子(ES1-);
b)氣簾氣壓力344.5kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓4500V，離子源溫度550°C，霧化氣壓力344.5 kPa，輔助加熱氣壓力344.5 kPa，接口加熱器為開；
c)掃描模式:多反應(yīng)檢測(MRM)模式。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明具有如下突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步:
高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)靈敏度高，選擇性和特異性好，不僅可對乳粉中含有的各種低聚果糖進(jìn)行定性確認(rèn)，克服樣品基質(zhì)干擾，而且能夠有效排除假陽性，進(jìn)行乳粉中各種低聚果糖準(zhǔn)確的定量分析。本發(fā)明的方法前處理操作簡單、準(zhǔn)確度好、精度高、線性良好，可用于開展乳粉中低聚果糖的測定，為乳粉中低聚果糖的質(zhì)量監(jiān)測提供了有效的技術(shù)支撐。
【專利附圖】

【附圖說明】[0014]圖1為嬰幼兒配方乳粉的高效液相色譜質(zhì)譜圖:1-蔗果三糖，2-蔗果四糖，3-蔗果五糖，4-蔗果六糖。
[0015]圖2為各濃度為5 mg/L的低聚果糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖:1-蔗果三糖，2-蔗果四糖，3-蔗果五糖，4-蔗果六糖。
[0016]圖3為蔗果三糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0017]圖4為蔗果四糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0018]圖5為蔗果五糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019]圖6為蔗果六糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本
【發(fā)明內(nèi)容】
所做的等同替換或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021]一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，具體實(shí)施步驟如下(以一種嬰幼兒乳粉為例)。
[0022](I)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測
等量分別精確稱取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖各IOmg共置于IOOmL容量瓶中，用蒸餾水超聲溶解定容至刻度作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；將此混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水逐級稀釋，分別配成低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、I mg/L和
0.5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為5mg/L的IL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖各5g，其余類推。
[0023]將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測并得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜，SP分別得到低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、l mg/L和0.5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間與響應(yīng)值之間對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，保留時間確定低聚果糖品種，由響應(yīng)值確定的色譜峰面積與對應(yīng)的低聚果糖濃度成函數(shù)關(guān)系，其中濃度為5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖如圖2所示，其它未示。
[0024](2)將步驟I獲得的標(biāo)準(zhǔn)譜圖按低聚果糖品種分別制作濃度與色譜峰面積關(guān)系曲線圖，圖3為蔗果三糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為蔗果四糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為蔗果五糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6為蔗果六糖的濃度與色譜峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖3~圖6所示。
[0025]各種低聚果糖的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性情況和方法檢出限如表1所示:
表1各種低聚糖的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
【權(quán)利要求】
1.一種乳粉中低聚果糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征包括以下步驟: (1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測 稱取各種低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品并將其配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水逐級稀釋，分別配成至少5種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測并得到標(biāo)準(zhǔn)譜圖，標(biāo)準(zhǔn)譜圖中保留時間確定低聚果糖品種，色譜峰面積與對應(yīng)的低聚果糖濃度成函數(shù)關(guān)系； (2)將步驟I獲得的標(biāo)準(zhǔn)譜圖按低聚果糖品種分別制作濃度與色譜峰面積關(guān)系曲線圖； (3 )乳粉樣品的預(yù)處理及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測 稱取一定量的乳粉樣品，依次加入蒸餾水和乙醇，渦旋振蕩后，超聲溶解，離心，取上清液稀釋后過濾膜過濾，取濾液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，得樣品譜圖； (4)樣品中的各低聚果糖的含量的確定 將步驟3中獲得的樣品譜圖的保留時間確定低聚果糖品種并將其色譜峰面積與步驟2對應(yīng)的低聚果糖品種的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，用插入法確定樣品中的各低聚果糖的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉中低聚果糖的檢測方法，其特征在于:步驟I中不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從0.5 mg/L至20 mg/L分為6級，級間間隔由小至大大致倍增，每濃度級中各低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品含量相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乳粉中低聚果糖的檢測方法，其特征在于，在步驟I和2中高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢`測條件是: 色譜條件:
a)色譜柱:XBridgeTM Amide, 3.5 μ m, 4.6 X 150mm ; b)進(jìn)樣量:5~20μ L ； c)柱溫:30^50°C ；
d)流速:0.3~0.6 ml ,/mi η ； e)流動相和洗脫時間: 流動相A =30/70乙腈/水溶液含0.10%氨水； 流動相B:80/20乙腈/水溶液含0.10%氨水； 洗脫時間0~30 min,流動相A從100%到60%,流動相B從0%到40% ； 洗脫時間30~32 min,流動相A保持60%，流動相B保持40% ； 洗脫時間32~34min，流動相A從60%到0%，流動相B從40%到100% ； 洗脫時間34~35min，流動相A保持0%，流動相B保持100% ； 質(zhì)譜條件: a)電離模式:負(fù)離子(ES1-); b)氣簾氣壓力344.5kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓4500V，離子源溫度550°C，霧化氣壓力344.5 kPa，輔助加熱氣壓力344.5 kPa，接口加熱器為開； c)掃描模式:多反應(yīng)檢測(MRM)模式。
【文檔編號】G01N30/88GK103823006SQ201410076222
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】高裕鋒, 甄振鵬, 郭劍雄, 李海喬, 余構(gòu)彬 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所