本發(fā)明涉及一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法及其探針引物組合與試劑盒，屬于病毒核酸檢測技術領域。

背景技術：

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)二者均為高度接觸性腸道疾病，主要發(fā)生在冬季和春季等寒冷季節(jié)，感染后，主要引起豬的嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水，各年齡段的豬均易感染。分別由兩種RNA病毒：豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)和傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起。該兩種病毒均可以破壞小腸上皮細胞而引起腸絨毛萎縮，對哺乳仔豬的致死率分別為30％-80％、80％-100％。由于二者引起的臨床癥狀、病理變化和流行病學極為相似，且往往混合感染，單憑臨床癥狀和組織病理學難以鑒別診斷。近幾年二者已成為當前豬場常見的病毒性腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

目前常規(guī)的病毒診斷方法有病毒分離、熒光抗體檢測、血清學診斷方法和免疫組織化學以及PCR方法等，病毒分離困難，PCR方法因其具有快速、特異、準確等優(yōu)點，現(xiàn)己經(jīng)廣泛應用于畜禽傳染病的快速診斷。以上這些診斷方法在特異性上尚存在一定的缺陷，在敏感性方面對早期感染往往不能做出準確的判定；并且單一的RT-PCR方法用于多種病毒感染的臨床鑒別診斷，不能一次達到目的，且因為需要對不同檢測病毒分別進行擴增，不僅樣品需求量較大，且耗時較長。此外疾病的嚴重程度與病毒的含量相關，傳統(tǒng)的檢測方法很難準確測定樣品中的病毒含量，這使得實時熒光定量RT-PCR方法不僅在定量研究中具有重要意義，而且在檢測病毒存在及其在疾病發(fā)展過程中病毒對機體持續(xù)性作用方面也起重要作用。因此，開發(fā)出一種同時特異檢測兩種豬病毒感染的雙重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，有助于提升病毒檢測水平，在疾病診斷和防治及食品安全等方面具有重要的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR探針引物組合，包括以下引物對和探針：

PEDV上游引物：CGTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTA

PEDV下游引物：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

PEDV探針：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

TGEV上游引物：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGAT

TGEV下游引物：ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAAT

TGEV探針：CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC。

作為優(yōu)選，所述PEDV探針和TGEV探針序列的3’端結合相同的熒光淬滅基團；所述PEDV探針和TGEV探針序列的5’端結合不同的熒光報告基團。

作為優(yōu)選，所述熒光淬滅基團為BHQ1；所述PEDV探針的熒光報告基團為HEX；所述TGEV探針的熒光報告基團為FAM。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提取；

2)反轉錄合成cDNA；

3)RT-PCR擴增：利用上述探針引物組合，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，收集熒光信號；

4)結果判定:若擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽性。

作為優(yōu)選，步驟3)中，RT-PCR擴增的反應體系如下：2μL 10×PCR buffer、2μL 2.5mΜdNTP、1U Ace Taq DNA聚合酶、0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O。

作為優(yōu)選，步驟3)中，RT-PCR擴增的反應程序如下：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測試劑盒，包括上述的探針引物組合。

作為優(yōu)選，上述試劑盒還包括RT-PCR緩沖液、DNA聚合酶、酶混合物、陽性對照品、陰性對照品；所述陰性對照為滅菌后焦碳酸二乙酯處理水。

作為優(yōu)選，所述RT-PCR緩沖液為氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸的混合物；所述酶混合物包括RNA酶抑制劑，M-MLV逆轉錄酶和Ace Taq DNA聚合酶。

相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明運用實時熒光定量RT-PCR技術，采用PEDV和TGEV兩種病毒的特異性引物和探針，提供了一種PEDV和TGEV雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。該發(fā)明是通過一個RT-PCR反應可以從樣本中同時檢測出PEDV和TGEV的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重熒光定量PCR方法更簡便、省時和快捷，并且能夠對待檢測的病毒進行實時準確定量。本發(fā)明提供的試劑盒可判定在疾病爆發(fā)時哪種病毒在起主要作用，從而為實現(xiàn)臨床早期診斷和及時制定治療方案、減少死亡率及后遺癥成為可能。

附圖說明

圖1為實施例2步驟1)的標準曲線圖，其中，曲線A為PEDV病毒，曲線B為TGEV病毒；

圖2為實施例2步驟2)的特異性試驗結果圖；

圖3為實施例2步驟3)的敏感性試驗結果圖；

圖4為實施例2步驟3)的普通RT-PCR敏感性試驗結果圖。

具體實施方式

下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：

以下具體實施方式中，如未特殊說明，所采用的試劑或儀器均可通過市售的途徑獲得。采用的DNA聚合酶為DNA聚合酶為Vazyme公司生產(chǎn)的Ace Taq DNA Polymerase(Code NO P401-d2)。

本發(fā)明提供一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR探針引物組合，包括以下引物對和探針：

PEDV上游引物SEQ ID No.1：CGTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTA

PEDV下游引物SEQ ID No:2：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

PEDV探針SEQ ID No.3：CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT

TGEV上游引物SEQ ID No.4：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGAT

TGEV下游引物SEQ ID No.5：ACATTCAGCCAGTTGTGGGTAAT

TGEV探針SEQ ID No.6：CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC。

以下具體實施方式中，PEDV和TGEV的上下游引物和探針委托上海Invitrogen公司合成。以下具體實施例中，使用的PEDV探針為HEX-CAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGT-BHQ1，使用的TGEV探針為FAM-CTTGGCACTGCTCCCATTGGCAAC-BHQ1。

本發(fā)明同時提供了一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提?。?/p>

2)反轉錄合成cDNA；

3)RT-PCR擴增：利用上述的探針引物組合，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增，收集熒光信號；

4)結果判定:若擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽性。

本發(fā)明提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測試劑盒，包括上述的探針引物組合。

本發(fā)明中，PEDV上游引物和PEDV下游引物的Tm值范圍為59.2-61.3℃；PEDV探針的Tm值為71℃；TGEV上游引物和TGEV下游引物為58-62.1℃、TGEV探針的Tm值為70.6℃。

實施例1：制備質粒標準品

1)病毒總RNA提取

將含有PEDV和TGEV病毒的組織樣品各100mg置于1.5mL離心管中，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)提取，得到病毒總RNA；

2)反轉錄合成cDNA

在無RNase的0.2mL PCR管中依次加入步驟1)制備的病毒總RNA 10μL，OligodT-Adaptor primer(10pmol/L)2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mixture(10mM)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，M-MLV(200U/μL)1μL，不含RNase的ddH₂O補足至20μL。37℃60min，72℃10min。待反轉錄反應結束后，所得反應液即為cDNA模板；

3)qPCR擴增

qPCR反應體系(總反應體積20μL)：取2μL步驟2)獲得的cDNA為模板進行TaqMan實時熒光定量PCR反應，其中10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O；反應參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號。

4)獲得質粒標準品

將步驟3)獲得的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，通過大腸桿菌DH-5α感受態(tài)轉化，挑取其中白色單菌落進行鑒定，重組質粒序列委托上海Invitrogen公司進行序列測定。利用Plasmid Miniprep Kit提取測序正確的重組質粒DNA，PEDV陽性質粒標準品的序列如SEQ ID No.7所示；TGEV陽性質粒標準品序列如SEQ ID No.8所示，利用核酸蛋白檢測儀(thermo)定量重組質粒PEDV為1.8×10¹¹Copies/μL，TGEV為8.1×10¹¹Copies/μL。

實施例2：檢測方法的建立及驗證

1)制作標準曲線

取實施例1獲得的PEDV和TGEV陽性質粒標準品，以無菌去離子水將質粒按照1.0×10¹Copies/μL-1.0×10⁶Copies/μL 10倍梯度稀釋制備質粒標準溶液，進行實時熒光定量PCR反應，反應體系：2μL標準溶液作為模板，10×buffer 2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ex Taq DNA聚合酶1U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O。反應參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號。擴增完成后，以Ct值為縱坐標，log10X(X為標準品系列濃度)為橫坐標，Ct值與log10X呈線性關系，制作標準曲線，結果如圖1所示，呈良好的線性關系。

2)特異性試驗

配制12份相同的實時熒光定量PCR反應體系反應液，分別單獨加入2μL提取的PCV2、PRV核酸DNA或已反轉錄的PRRSV、CSFV、PEDV以及TGEV的cDNA為模板，即，反應體系為10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O。反應參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號。

結果如圖2所示，圖2中，上曲線從左到右依次為TGEV、PEDV，下曲線為PRV、CSFV、PRRSV、PCV2及陰性對照。該方法能很好地同時通過雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR擴增出對應兩種病毒擴增產(chǎn)物，并通過擴增曲線及熒光集團的不同，將兩種產(chǎn)物明顯區(qū)分開來。

由此，我們可得以下結論：PEDV和TGEV兩種病毒可同時通過一次雙重實時熒光定量RT-PCR反應，擴增出相應目的產(chǎn)物，并能在擴增曲線上，通過Ct和所標記熒光基團的不同，將兩種病毒有效區(qū)分開來，可以很直觀通過擴增曲線來判定試驗結果，證明所檢測兩種病毒正是PEDV和TGEV。

3)敏感性試驗

以本實施例步驟1)的10倍系列稀釋的PEDV和TGEV陽性質粒標準品(1.0×10¹～1.0×10⁶Copies/μL)作為模板，每個稀釋度設立3個重復，分別進行實時熒光定量PCR、普通RT-PCR檢測敏感度，比較敏感性。

敏感性實驗結果顯示，本發(fā)明可檢測出10Copies/μL的病毒量見圖3，曲線a至f分別對應PEDV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；曲線1至6分別對應TGEV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；由此可見本發(fā)明檢測病毒的敏感性高于常規(guī)PCR約100倍。

普通RT-PCR只能檢測到1000Copies/μL的病毒量見圖4，泳道1至7分別對應PEDV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹；泳道8至14分別對應TGEV的1×10⁶,1×10⁵,1×10⁴,1×10³,1×10²和1×10¹各自的拷貝；普通RT-PCR檢測只能檢測到1×10³Copies/μL的病毒量。

4)穩(wěn)定性試驗

取本實施例步驟1)的10倍系列稀釋的PEDV和TGEV質粒標準品溶液，取DEPC-H₂O作為陰性對照品，分別進行批內、批間重復試驗。批內重復試驗是將3份樣品在同一次實時熒光定量試驗中重復3次；批間重復試驗是在3次不同時間的試驗中(間隔1月)進行實時熒光定量PCR試驗。穩(wěn)定性結果如下表所示顯示，本發(fā)明2種病毒批內的變異系數(shù)分別為0.05％、0.58％、0.16％、0.09％、0.41％、0.32％；批間的變異系數(shù)分別為1.8％、2.7％、3.3％、2.4％、3.2％、3.7％，由此可見本發(fā)明檢測過程中具有良好的穩(wěn)定性。

表1穩(wěn)定性試驗結果

實施例3：試樣檢測

一種PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)病毒總RNA提?。簩⒑蠵EDV、TGEV病毒的細胞上清各200μL置于1.5mL離心管中，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)從細胞株提取病毒總RNA；

2)反轉錄合成cDNA：

在無RNase的0.2mL PCR管中依次加入步驟1)制備的病毒總RNA 10μL，OligodT-Adaptor primer(10pmol/L)2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mixture(10mM)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，M-MLV(200U/μL)1μL，不含RNase的ddH₂O補足至20μL。37℃60min，72℃10min。待反轉錄反應結束后，所得反應液即為cDNA模板；

3)PEDV和TGEV兩種病毒雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR擴增：

qPCR反應體系(總反應體積20μL)：取2μL步驟2)得到的cDNA為模板進行TaqMan實時熒光定量PCR反應，其中10×PCR buffer2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O；反應參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號。

4)結果判定：若擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的Ct值≤38，則為陽性。

實施例4：臨床檢驗

1)樣本采集

樣本共計52份，其中在廣東地區(qū)采集血清22份，感染不同代次的細胞19份，組織病料11份。

2)總RNA小量抽提

用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Axyprep Body Fluid Vial DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)從細胞株提取病毒總RNA；

3)反轉錄合成cDNA：

同實施例3步驟2)；

4)RT-PCR檢測和雙重TaqMan實時熒光定量RT-PCR

qPCR反應體系(總反應體積20μL)：取2μL已反轉錄的cDNA為模板進行TaqMan實時熒光定量PCR反應，其中10×PCR buffer 2μL，2.5mΜdNTP 2μL，Ace Taq DNA聚合酶1.5U，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.2μM PEDV探針、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物和0.25μM TGEV探針、補足至20μL的ddH₂O；反應參數(shù)為：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)，從60℃開始收集熒光信號，記載Ct值。

5)定量分析

根據(jù)實施例2步驟1)的標準曲線及待測樣品Ct值，計算待測標本病毒Copies/μL。通過結果分析得出所采集樣本中PEDV和TGRV兩種病毒的總cDNA大都在10¹～10⁹Copies/μL之間(超過以及等于10⁶拷貝/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測)，而在普通PCR檢測呈陰性通過本發(fā)明檢測結果為陽性的樣本，其對應拷貝數(shù)值在10³Copies/μL左右。

對比例：普通RT-PCR檢測

對比例中，樣本采集、總RNA小量抽提以及反轉錄合成cDNA步驟均于實施例4相同，后采用普通RT-PCR進行檢測，其中RT-PCR反應體系(總反應體積25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl22μL，2.5mM dNTP 2.5μL，Ace Taq DNA聚合酶2U，以cDNA2μL為模板，0.3μM PEDV上游引物、0.3μM PEDV下游引物、0.3μM TGEV上游引物、0.3μM TGEV下游引物，加ddH₂O至反應體系總體積為25μL，分別進行普通RT-PCR擴增。反應在Bio-Rad S1000PCR擴增儀進行反應參數(shù)為：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35個循環(huán)，72℃10min。

5)結果檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

實施例4與對比例相比，對于同一批待測樣品，實施例4檢測出21份PEDV陽性，9份TGEV陽性，其中PEDV和TGEV混合感染3份；對比例檢測出19份PEDV陽性，8份TGEV陽性，其中PEDV和TGEV混合感染3份。

由上述結果可知，采用本發(fā)明提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測方法的實施例4，其檢測效果明顯好于采用普通RT-PCR方法的對比例，可以減少假陰性的發(fā)生，同時一次可以檢測出混合感染，減少二次RT-PCR驗證及不需要RT-PCR擴增后續(xù)處理，大大節(jié)約時間，提高工作效率。

本發(fā)明的提供的PEDV和TGEV雙重RT-PCR檢測試劑盒，包括a)熒光定量RT-PCR反應液、b)陽性對照品、c)陰性對照品和d)定量RT-PCR標準品；

其中，所述a)熒光定量RT-PCR反應液包含RT-PCR緩沖液、DNA聚合酶、PEDV上游引物SEQ ID No.1、PEDV下游引物SEQ ID No:2、PEDV探針SEQ ID No.3、TGEV上游引物SEQ ID No.4、TGEV下游引物SEQ ID No.5、TGEV探針SEQ ID No.6；

所述RT-PCR緩沖液為氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物；

所述b)陽性對照品為含有PEDV和TGEV兩種病毒的陽性質?；旌衔铮?/p>

所述c)陰性對照品為滅菌后焦碳酸二乙酯處理水；

所述d)定量RT-PCR標準品為PEDV陽性質粒標準品和TGEV陽性質粒標準品。

所述PEDV陽性質粒標準品序列為SEQ ID No.7：GTGGAATTTCATTAGGTTTGCTTAAGTAGCCATCGCAAGTGCTGTGCTGTCCTCTAGTTCCTGGTTGGCGTTCCGTCGCCTTCTACATACTAGACAAACAGCCTTCCTCCG；

所述TGEV陽性質粒標準品序列為SEQ ID No.8：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGATTTTATGGAGCTAGAAGCAGTTCAGCCAATTTTGGTGACACTGACCTCGTTGCCAATGGGAGCAGTGCCAAGCATTACCCACAACTGGCTGAATGT。

上述試劑盒應避光保存于-20℃，盡量減少反復凍融。

對于本領域的技術人員來說，可根據(jù)以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。