本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲取方法，特別是涉及一種從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干細(xì)胞中的一類(lèi)，來(lái)源于發(fā)育早期中胚層，具有較高的分化潛能，廣泛存在于人體的骨髓、脂肪、臍血等結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有自我更新，高度增殖及多向分化潛能，在體內(nèi)外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)和凍存后仍有分化潛能，逐漸成為組織工程和基因治療領(lǐng)域中極具實(shí)用價(jià)值的細(xì)胞來(lái)源，為臨床治療越來(lái)越受到人們的重視。

目前對(duì)成體干細(xì)胞的研究多集中于骨髓來(lái)源的MSCs，但由于獲取大量骨髓細(xì)胞十分困難，且由于骨髓源性的MSCs免疫原性較強(qiáng)，隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。故尋找一種替代骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞迫在眉睫。

臍帶(umbilical cord)是哺乳類(lèi)的連接胎兒和胎盤(pán)的管狀結(jié)構(gòu)，由兩條動(dòng)脈和一條靜脈構(gòu)成。外包被羊膜，內(nèi)含華通氏膠(Whartons jelly)，是一種黏液性的結(jié)締組織，對(duì)臍血管起支撐和保護(hù)的作用，富含透明質(zhì)酸，由特異的成纖維樣細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。臍帶組織中的MSCs主要分布在華通氏膠和臍帶血管周?chē)哪殠ЫM織中分離出的MSCs，其在形態(tài)學(xué)和免疫表型上均類(lèi)似于骨髓來(lái)源的MSCs。此外，臍帶來(lái)源的MSCs具有取材方便、對(duì)捐獻(xiàn)者無(wú)損害、細(xì)胞增殖力強(qiáng)、免疫原性低、不涉及法律倫理等優(yōu)勢(shì)。

目前分離MSCs的方法主要是組織塊貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法主要是利用MSCs的黏附貼壁能力，在貼壁培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)MSCs細(xì)胞分離和純化，但組織塊貼壁法需要剪碎臍帶組織，機(jī)械外力對(duì)組織細(xì)胞有所損傷；臍帶是富含膠原和葡萄糖胺的組織，故多用膠原酶等消化臍帶組織以獲得MSCs，酶消化法能夠獲得更完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和更多的MSCs，但大多數(shù)的酶消化法耗費(fèi)時(shí)間較多，酶的濃度和消化時(shí)間對(duì)MSCs的分離和培養(yǎng)十分重要。因此，如何穩(wěn)定、高效地從臍帶中獲得MSCs是其能否成為理想MSCs來(lái)源的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法步驟包括：

(1)臍帶MSCs細(xì)胞的分離：向洗凈剪碎預(yù)處理后的臍帶組織塊內(nèi)加入胰蛋白酶，在37℃水浴搖床上預(yù)消化后棄去消化液，用DPBS反復(fù)沖洗后，加入膠原酶I消化液置于37℃水浴搖床上消化，用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后收集到的濾液加入數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)離心分離得到一次沉淀物原代MSCs細(xì)胞；上述用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后收集到的剩余組織塊重復(fù)上述消化至離心分離的步驟得到二次沉淀物原代MSCs細(xì)胞；

(2)原代培養(yǎng)：將上述兩次沉淀物合并后重懸于完全培養(yǎng)液中，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；細(xì)胞接種24小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，以后每隔數(shù)日更換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；

(3)臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：待上述原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80％以上匯合時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞多次，吸棄洗滌液，加入胰蛋白酶消化液，靜置消化至貼壁細(xì)胞脫落，加入數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)離心分離所得的細(xì)胞沉淀加入aMEM培養(yǎng)液重懸并清洗細(xì)胞，重懸清洗多次所得細(xì)胞沉淀重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液，并以數(shù)倍比例進(jìn)行分瓶傳代擴(kuò)增培養(yǎng)得到臍帶MSCs細(xì)胞。擴(kuò)增過(guò)程所涉及到的培養(yǎng)液均為無(wú)血清培養(yǎng)液。此方法不僅能高效獲取，而且獲得的干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞活性及分化潛能。

作為優(yōu)化，洗凈剪碎預(yù)處理后的臍帶組織塊是健康足月的新生兒臍帶，取其靠近嬰兒端置于含雙抗的生理鹽水保存液中，置于冰盒內(nèi)盡快運(yùn)輸；在生物安全柜內(nèi)取出臍帶，置于培養(yǎng)皿中，將其剪成長(zhǎng)的小段，用含雙抗的DPBS反復(fù)沖洗，直至無(wú)明顯血塊；將臍帶縱向剖開(kāi)，剔除血管；用含雙抗的DPBS將組織塊漂洗干凈，并用眼科剪剪成碎塊。

作為優(yōu)化，靠近嬰兒端是靠近嬰兒端約20cm左右，培養(yǎng)皿是10cm培養(yǎng)皿，長(zhǎng)的小段是2-3cm長(zhǎng)的小段，碎塊是1-2mm3碎塊，。

作為優(yōu)化，含雙抗的生理鹽水是含1％雙抗的生理鹽水，冰盒是4℃冰盒，含雙抗的DPBS是含1％雙抗的DPBS。

作為優(yōu)化，含1％雙抗的DPBS是含100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。

作為優(yōu)化，臍帶MSCs細(xì)胞的分離步驟中：向洗凈剪碎預(yù)處理后的臍帶組織塊內(nèi)加入胰蛋白酶是將剪碎的組織塊收集至六孔板內(nèi)，加入0.25％胰蛋白酶；反復(fù)沖洗是反復(fù)沖洗三次，并移至六孔板另外一孔內(nèi)；置于37℃水浴搖床上消化是置于37℃水浴搖床上消化1小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘，以保證組織塊與消化液充分接觸；離心分離1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，吸棄上清液，收集得到細(xì)胞沉淀。

作為優(yōu)化，臍帶MSCs細(xì)胞的分離步驟中：預(yù)消化時(shí)間是10分鐘，膠原酶I消化液是0.1％膠原酶I消化液，細(xì)胞篩網(wǎng)是70um細(xì)胞篩網(wǎng)，數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)基3倍濾液體積的完全培養(yǎng)基。

作為優(yōu)化，每隔數(shù)日更換一次培養(yǎng)液是每3天更換一次培養(yǎng)液；置于37℃水浴搖床上消化是置于37℃水浴搖床上消化1小時(shí)，其中搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘。

作為優(yōu)化，臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)步驟中：加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞多次是加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞兩到三次，靜置消化時(shí)間是2-3分鐘，離心分離是1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；重懸清洗次數(shù)是兩次。

作為優(yōu)化，臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)步驟中：胰蛋白酶消化液是0.25％胰蛋白酶消化液3ml，數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)液是3倍消化液體積的完全培養(yǎng)液；aMEM培養(yǎng)液是8-10ml的aMEM培養(yǎng)液，以數(shù)倍比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)是以1∶3-1∶5的比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。此比例是細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增比例。

具體步驟有：

(1)臍帶組織的預(yù)處理：健康足月的新生兒臍帶，取其靠近嬰兒端約20cm左右，置于含1％雙抗的生理鹽水保存液中，于4℃冰盒內(nèi)盡快運(yùn)輸。在生物安全柜內(nèi)取出臍帶，置于10cm培養(yǎng)皿中，將其剪成2-3cm長(zhǎng)的小段，用含1％雙抗的DPBS反復(fù)沖洗，直至無(wú)明顯血塊。將臍帶縱向剖開(kāi)，剔除血管。用含1％雙抗的DPBS將組織塊漂洗干凈，并用眼科剪將組織塊剪碎至1-2mm³。

(2)臍帶MSCs細(xì)胞的分離：將剪碎的組織塊收集至六孔板內(nèi)，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴搖床上消化預(yù)消化10分鐘。棄去消化液，用DPBS將組織塊反復(fù)沖洗三次，并移至另外一孔內(nèi)，加0.1％膠原酶I消化液，置于37℃水浴搖床上消化1小時(shí)，其中搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘，以保證組織塊與消化液充分接觸。將消化液用70um細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，加入3倍濾液體積的完全培養(yǎng)基終止消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，吸棄上清液，得到的沉淀物即為原代MSCs細(xì)胞。將剩余組織塊重復(fù)上述操作，加0.1％膠原酶I消化液，繼續(xù)消化1小時(shí)，收集得到的細(xì)胞沉淀。

(3)臍帶來(lái)源MSCs細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將兩次消化所得的細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)液中，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。細(xì)胞接種24小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，以后每3天更換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

(4)臍帶來(lái)源MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80％以上匯合時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液。加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞兩到三次，吸棄洗滌液。加入0.25％胰蛋白酶消化液3ml，靜置消化2-3分鐘至貼壁細(xì)胞脫落。加入3倍消化液體積的完全培養(yǎng)液終止消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。將所得細(xì)胞沉淀加入8-10ml的aMEM培養(yǎng)液，重懸并清洗細(xì)胞。重復(fù)兩次后，將所得細(xì)胞沉淀重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液，并以1∶3-1∶5的比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。此后的細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增過(guò)程所涉及到的培養(yǎng)液，均為無(wú)血清培養(yǎng)液。

其中：所述雙抗(PS)購(gòu)自Gibco公司。所用完全培養(yǎng)液為aMEM、胎牛血清(FBS)、雙抗(PS)的混合液，其中aMEM∶FBS∶PS的體積比為89∶10∶1。所用無(wú)血清培養(yǎng)液來(lái)自Gibco公司。

采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法具有極大程度縮短了原代細(xì)胞的獲取時(shí)間，更加方便快捷；很大程度上避免了動(dòng)物源成分對(duì)人體造成的不良反應(yīng)，更安全可靠；通過(guò)對(duì)臍帶MSCs生物學(xué)特性如生長(zhǎng)狀態(tài)、表面標(biāo)志物、多向分化潛能等方面的系統(tǒng)研究，證實(shí)了經(jīng)體外多次擴(kuò)增培養(yǎng)以后，細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的干細(xì)胞特性，可滿足臨床和實(shí)驗(yàn)研究的需要。其不但能快速高效獲取，而且獲得的干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞活性及分化潛能。

附圖說(shuō)明

圖1-2是現(xiàn)有組織塊貼壁培養(yǎng)方法獲取的細(xì)胞傳代培養(yǎng)三天后40倍和100倍的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)照片；

圖3-4是本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲取的細(xì)胞傳代培養(yǎng)三天后40倍和100倍的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)照片；

圖5-8是本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面陽(yáng)性標(biāo)志物表達(dá)的峰形圖；

圖9是本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面陰性標(biāo)志物表達(dá)的峰形圖；

圖10是本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)12天，對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅0染色的照片；

圖11是本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)18天，對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行茜素紅染色的照片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法步驟包括：(1)臍帶MSCs細(xì)胞的分離：向洗凈剪碎預(yù)處理后的臍帶組織塊內(nèi)加入胰蛋白酶，在37℃水浴搖床上預(yù)消化后棄去消化液，用DPBS反復(fù)沖洗后，加入膠原酶I消化液置于37℃水浴搖床上消化1小時(shí)，用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后收集到的濾液加入數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)離心分離得到一次沉淀物原代MSCs細(xì)胞；上述用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后收集到的剩余組織塊重復(fù)上述消化至離心分離的步驟得到二次沉淀物原代MSCs細(xì)胞；

(2)原代培養(yǎng)：將上述兩次沉淀物合并后重懸于完全培養(yǎng)液中，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；細(xì)胞接種24小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，以后每隔數(shù)日更換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；

(3)臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：待上述原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80％以上匯合時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞多次，吸棄洗滌液，加入胰蛋白酶消化液，靜置消化至貼壁細(xì)胞脫落，加入數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)離心分離所得的細(xì)胞沉淀加入aMEM培養(yǎng)液重懸并清洗細(xì)胞，重懸清洗多次所得細(xì)胞沉淀重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液，并以數(shù)倍比例進(jìn)行分瓶傳代擴(kuò)增培養(yǎng)得到臍帶MSCs細(xì)胞。增代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增過(guò)程所涉及到的培養(yǎng)液均為無(wú)血清培養(yǎng)液。

具體是：洗凈剪碎處理后的臍帶組織塊是健康足月的新生兒臍帶，取其靠近嬰兒端置于含雙抗的生理鹽水保存液中，置于冰盒內(nèi)盡快運(yùn)輸；在生物安全柜內(nèi)取出臍帶，置于培養(yǎng)皿中，將其剪成長(zhǎng)的小段，用含雙抗的DPBS反復(fù)沖洗，直至無(wú)明顯血塊；將臍帶縱向剖開(kāi)，剔除血管；用含雙抗的DPBS將組織塊漂洗干凈，并用眼科剪剪成碎塊。

更具體是：靠近嬰兒端是靠近嬰兒端約20cm左右，培養(yǎng)皿是10cm培養(yǎng)皿，長(zhǎng)的小段是2-3cm長(zhǎng)的小段，碎塊是1-2mm³碎塊。

更具體是：含雙抗的生理鹽水是含1％雙抗的生理鹽水，冰盒是4℃冰盒，含雙抗的DPBS是含1％雙抗的DPBS。

優(yōu)選：含1％雙抗的DPBS是含I00U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。

具體是：臍帶MSCs細(xì)胞的分離步驟中：向洗凈剪碎預(yù)處理后的臍帶組織塊內(nèi)加入胰蛋白酶是將剪碎的組織塊收集至六孔板內(nèi)，加入0.25％胰蛋白酶；反復(fù)沖洗是反復(fù)沖洗三次，并移至六孔板另外一孔內(nèi)；置于37℃水浴搖床上消化是置于37℃搖床上消化1小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘，以保證組織塊與消化液充分接觸；離心分離1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，吸棄上清液，收集得到細(xì)胞沉淀。

具體是：臍帶MSCs細(xì)胞的分離步驟中：預(yù)消化時(shí)間是10分鐘，膠原酶I消化液是0.1％膠原酶I消化液，細(xì)胞篩網(wǎng)是70um細(xì)胞篩網(wǎng)，數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)基3倍濾液體積的完全培養(yǎng)基。

具體是：每隔數(shù)日更換一次培養(yǎng)液是每3天更換一次培養(yǎng)液；置于37℃水浴搖床上消化是置于37℃搖床上消化1小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘。

具體是：臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)步驟中：加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞多次是加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞兩到三次，靜置消化時(shí)間是2-3分鐘，離心分離是1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；重懸清洗次數(shù)是兩次。

具體是：臍帶MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)步驟中：胰蛋白酶消化液是0.25％胰蛋白酶消化液3ml，數(shù)倍體積的完全培養(yǎng)液是3倍消化液體積的完全培養(yǎng)液；aMEM培養(yǎng)液是8-10ml的aMEM培養(yǎng)液，以數(shù)倍比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)是以1∶3-1∶5的比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

實(shí)施例一，本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法步驟是：(1)臍帶組織的預(yù)處理：健康足月的新生兒臍帶，取其靠近嬰兒端約20cm左右，置于含1％雙抗的生理鹽水保存液中，于4℃冰盒內(nèi)盡快運(yùn)輸。在生物安全柜內(nèi)取出臍帶，置于10cm培養(yǎng)皿中，將其剪成2-3cm長(zhǎng)的小段，用含1％雙抗的DPBS反復(fù)沖洗，直至無(wú)明顯血塊。將臍帶縱向剖開(kāi)，剔除血管。用含1％雙抗的DPBS將組織塊漂洗干凈，并用眼科剪將組織塊剪碎至1-2mm3。(2)臍帶MSCs細(xì)胞的分離：將剪碎的組織塊收集至六孔板內(nèi)，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴搖床上預(yù)消化10分鐘。棄去消化液，用DPBS將組織塊反復(fù)沖洗三次，并移至另外一孔內(nèi)，加0.1％膠原酶I消化液，置于37℃水浴搖床上消化1小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速是100轉(zhuǎn)/分鐘，以保證組織塊與消化液充分接觸。將消化液用70um細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，加入3倍濾液體積的完全培養(yǎng)基終止消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，吸棄上清液，得到的沉淀物即為原代MSCs細(xì)胞。將剩余組織塊重復(fù)上述操作，加0.1％膠原酶I消化液，繼續(xù)消化1小時(shí)，收集得到的細(xì)胞沉淀。(3)臍帶來(lái)源MSCs細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將兩次消化所得的細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)液中，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。細(xì)胞接種24小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)液，以后每3天更換一次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。(4)臍帶來(lái)源MSCs細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80％以上匯合時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液。加入DPBS浸洗貼壁細(xì)胞兩次，吸棄洗滌液。加入0.25％胰蛋白酶消化液3ml，靜置消化2分鐘至貼壁細(xì)胞脫落。加入3倍消化液體積的完全培養(yǎng)液終止消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。將所得細(xì)胞沉淀加入8ml的aMEM培養(yǎng)液，重懸并清洗細(xì)胞。重復(fù)兩次后，將所得細(xì)胞沉淀重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液，并以1∶3的比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。此后的細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增過(guò)程所涉及到的培養(yǎng)液，均為無(wú)血清培養(yǎng)液。

其中：所述雙抗(PS)購(gòu)自Gibco公司。所用完全培養(yǎng)液為aMEM、胎牛血清(FBS)、雙抗(PS)的混合液，其中aMEM∶FBS∶PS的體積比為89∶10∶1。所用無(wú)血清培養(yǎng)液來(lái)自Gibco公司。

上述實(shí)施例一方法獲得的人臍帶MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)于同樣長(zhǎng)度、同一來(lái)源的臍帶組織，我們對(duì)比了組織塊貼壁培養(yǎng)法與本發(fā)明酶多步消化法提取的MSCs。通過(guò)觀察細(xì)胞貼壁時(shí)間、收獲的細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明酶多步消化法獲取的細(xì)胞次日即可貼壁，約5-7天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，參見(jiàn)圖3-4。而現(xiàn)有組織塊貼壁法7天時(shí)初見(jiàn)有少量細(xì)胞爬出，約14天左右方可進(jìn)行傳代，參見(jiàn)圖1-2。同樣長(zhǎng)度的臍帶組織，采用酶多步消化法獲取的細(xì)胞在傳代時(shí)獲取的細(xì)胞總數(shù)目稍多，傳代后為均一長(zhǎng)梭形以平行排列為主或以漩渦狀生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，在原代細(xì)胞提取時(shí)采用酶多步消化法可以節(jié)約很長(zhǎng)時(shí)間，且細(xì)胞提取的成功率較高。圖1-2為現(xiàn)有組織塊貼壁法(A：×40倍，B：×100倍)從臍帶中獲取的MSCs細(xì)胞培養(yǎng)至第三代的形態(tài)。圖3-4為本發(fā)明酶多步消化法(C：×40倍，D：×100倍)從臍帶中獲取的MSCs細(xì)胞培養(yǎng)至第三代的形態(tài)。

上述實(shí)施例一方法獲得的人臍帶MSCs的生物學(xué)特性檢測(cè)：在MSCs細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的過(guò)程中，我們采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，很好地維持了干細(xì)胞的特性。我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了P7代的MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物。結(jié)果表明，細(xì)胞表面表達(dá)的CD44、CD73、CD90、和CD105陽(yáng)性比率均在97％之上，參見(jiàn)附圖5-8，表面標(biāo)志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR陽(yáng)性比率低于2％，參見(jiàn)附圖9。

上述實(shí)施例一方法獲得的人臍帶MSCs的誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)：對(duì)P7代細(xì)胞進(jìn)行了多向分化能力的檢測(cè)。結(jié)果表明，在常規(guī)誘導(dǎo)條件下，人臍帶MSCs可以分化成為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞，也證實(shí)了我們的細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性及多向分化潛能。

P7代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)12天后，顯微鏡下可見(jiàn)有大量脂滴形成，且油紅0染色呈陽(yáng)性，證明我們的細(xì)胞具有向成脂肪方向分化的潛能。

P7代細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)18天后，細(xì)胞基質(zhì)礦化物逐漸出現(xiàn)，顯微鏡下可見(jiàn)明顯鈣化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后呈深紅色，證明我們的細(xì)胞具有向成骨方向分化的潛能。

附圖10為成脂誘導(dǎo)12天，油紅0染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量紅色顆粒(×100倍)；附圖11為成骨誘導(dǎo)18天，茜素紅染色可見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)(×100倍)。

采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明從臍帶組織中高效獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法極大程度上縮短了原代細(xì)胞的獲取時(shí)間，更加方便快捷；很大程度上避免了動(dòng)物源成分對(duì)人體造成的不良反應(yīng)，更安全可靠；通過(guò)對(duì)臍帶MSCs生物學(xué)特性如生長(zhǎng)狀態(tài)、表面標(biāo)志物、多向分化潛能等方面的系統(tǒng)研究，證實(shí)了經(jīng)體外多次擴(kuò)增培養(yǎng)以后，細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的干細(xì)胞特性，可滿足臨床和實(shí)驗(yàn)研究的需要。