本發(fā)明屬于間充質(zhì)干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

因感染、創(chuàng)傷、腫瘤及骨壞死等因素造成的骨缺損臨床常見，傳統(tǒng)方法采用自體骨和異體骨移植的方法進(jìn)行治療，但弊端甚多，如自體骨移植勢必引起供骨區(qū)的損傷，而異體骨經(jīng)滅菌處理缺乏自成骨能力且引起不同程度的排斥反應(yīng)。同時，因退行性病變、外傷及炎癥等疾病引起的軟骨缺損，可產(chǎn)生疼痛等明顯癥狀，嚴(yán)重時會引起相關(guān)功能喪失并嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，傳統(tǒng)方法包括取非負(fù)重區(qū)軟骨移植和軟骨細(xì)胞移植等，但自體軟骨移植同樣會造成機(jī)體供區(qū)損傷，且若進(jìn)行軟骨細(xì)胞移植需要培養(yǎng)大量軟骨細(xì)胞，而軟骨組織中獲得的軟骨細(xì)胞數(shù)量少且培養(yǎng)難度大，故難以獲得大量細(xì)胞，同時異體軟骨細(xì)胞移植同樣需要培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，且異體軟骨細(xì)胞移植還會引發(fā)排斥反應(yīng)，導(dǎo)致修復(fù)失敗。

目前，組織工程學(xué)的方法為組織缺損修復(fù)開辟了新的途徑。組織工程主要包含兩個組成部分，一是種子細(xì)胞，另一個則是支架材料。目前采用的種子細(xì)胞多為間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新、高速增殖、具多向分化潛能的一類細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)組織來源的不同分為多種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、乳牙牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等。臍帶組織以其采集方便，組織量大、無倫理學(xué)問題等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為科研和醫(yī)學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)。

有學(xué)者將間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在體外進(jìn)行成骨或成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化后進(jìn)行移植，以彌補(bǔ)成骨和成軟骨細(xì)胞數(shù)量不足的問題。但目前的誘導(dǎo)方法需在培養(yǎng)基內(nèi)添加外源物質(zhì)，如β-甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素等，對間充質(zhì)干細(xì)胞均有一定毒副作用，且異體間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨和成軟骨分化誘導(dǎo)后會出現(xiàn)免疫原性上調(diào)，即喪失間充質(zhì)干細(xì)胞低免疫原性的特性，在進(jìn)行移植時會誘使受體免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)，對移植細(xì)胞進(jìn)行免疫攻擊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

本發(fā)明增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和/或成軟骨分化特性的培養(yǎng)基，它以dmem/df12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加有胎牛血清，并且還添加有腫瘤壞死因子α或白介素1β。

優(yōu)選地，所述胎牛血清與dmem/df12培養(yǎng)基的體積比為(8～15:92～85)，優(yōu)選為10:90。

優(yōu)選地，所述腫瘤壞死因子α為人源腫瘤壞死因子α，優(yōu)選為重組人源腫瘤壞死因子α；所述白介素1β為人源白介素1β，優(yōu)選為重組人源白介素1β。

優(yōu)選地，所述腫瘤壞死因子α或白介素1β的終濃度為15～25ng/ml，優(yōu)選為20ng/ml。

本發(fā)明提供了前述培養(yǎng)基在增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和/或成軟骨分化特性的用途。

其中，它是增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)微環(huán)境中成骨和/或成軟骨的分化特性。

其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和/或成軟骨分化特性的方法，步驟如下：取間充質(zhì)干細(xì)胞，置于前述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可。

優(yōu)選地，步驟如下：按每毫升2.5×10⁴～5×10⁴個間充質(zhì)干細(xì)胞的密度重懸于權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)72～120h。

進(jìn)一步優(yōu)選地，按每毫升3.33×10⁴個間充質(zhì)干細(xì)胞的密度重懸于要求1～4任意一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h。

采用本發(fā)明培養(yǎng)基和方法處理臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，不會引起臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老或者凋亡，且在未移植前不會使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨或軟骨細(xì)胞，故移植后不會引起受體免疫排斥反應(yīng)，有且僅有在誘導(dǎo)微環(huán)境下才會發(fā)生分化，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨和成軟骨特性。該培養(yǎng)基配制簡單，培養(yǎng)方法簡便，可廣泛用于骨和軟骨組織缺損修復(fù)，前景廣闊。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

圖2為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和對照獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨特性鑒定

圖3為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和對照獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨特性鑒定

圖4為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和對照臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)72小時形態(tài)特征

圖5為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和對照臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)72小時衰老檢測結(jié)果

圖6為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和對照臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)72小時凋亡檢測結(jié)果

具體實(shí)施方式

主要儀器及試劑：

主要儀器及耗材：生物安全柜、倒置相差顯微鏡、co2細(xì)胞培養(yǎng)箱、電動移液器、醫(yī)用有齒鑷、醫(yī)用眼科剪、細(xì)胞篩、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、六孔板、移液管

主要試劑：dmem培養(yǎng)基，購自gibco公司；ham'sf-12k培養(yǎng)基，購自gibco公司；重組人源腫瘤壞死因子α，購自peprotech公司；重組人源白介素1β，購自peprotech公司；trypleselect，購自gibco公司；磷酸緩沖液，購自ge公司。

實(shí)施例1本發(fā)明增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)方法

(1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

臍帶取自足月剖腹產(chǎn)的健康產(chǎn)婦，無菌采集后放于磷酸緩沖溶液中4℃保存，24小時內(nèi)處理；

在無菌操作臺內(nèi)取出臍帶，反復(fù)用磷酸鹽緩沖液清洗，直至清洗后的液體透明；

將清洗后的臍帶剪成2厘米小段，拔除動脈及靜脈血管并剪除臍帶外圍的羊膜組織，將剩余組織剪成1立方毫米左右小塊，混合2毫升含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基并均勻地鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)，20小時后補(bǔ)液8毫升；

10～14天后，待細(xì)胞匯合率達(dá)25％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓后加入十倍體積磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋并吹打洗滌，收集細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過濾后離心接種；

待傳代細(xì)胞匯合度達(dá)85％進(jìn)行新一輪傳代。

(2)增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)方法

待前述方法獲得的p2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞匯合度達(dá)85％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化；

將6×10⁵個細(xì)胞重懸于18毫升含10％胎牛血清的dmem/df12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加有含有工作濃度為20ng/ml重組人源腫瘤壞死因子α；

將細(xì)胞懸液平均接種至六孔板中的六孔中，每孔3毫升，培養(yǎng)72小時。

實(shí)施例2本發(fā)明增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)

(1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

同實(shí)施例1。

(2)增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)方法

待前述方法獲得的p2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞匯合度達(dá)85％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化；

將6×10⁵個細(xì)胞重懸于18毫升含10％胎牛血清的dmem/df12培養(yǎng)基中，其中含有工作濃度為20ng/ml重組人源白介素1β；

將細(xì)胞懸液平均接種至六孔板中的六孔中，每孔3毫升，培養(yǎng)72小時。

實(shí)施例3本發(fā)明增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)

(1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

同實(shí)施例1。

(2)增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)方法

待前述方法獲得的p2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞匯合度達(dá)85％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化；

將6×10⁵個細(xì)胞重懸于24毫升含8％胎牛血清的dmem/df12培養(yǎng)基中，其中含有工作濃度為15ng/ml重組人源白介素1β；

將細(xì)胞懸液平均接種至十二孔板中的八孔中，每孔3毫升，培養(yǎng)90小時。

實(shí)施例4本發(fā)明增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)

(1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

同實(shí)施例1。

(2)增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成軟骨分化特性的培養(yǎng)方法

待前述方法獲得的p2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞匯合度達(dá)85％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化；

將6×10⁵個細(xì)胞重懸于12毫升含15％胎牛血清的dmem/df12培養(yǎng)基中，其中含有工作濃度為25ng/ml重組人源腫瘤壞死因子α；

將細(xì)胞懸液平均接種至六孔板中的四孔中，每孔3毫升，培養(yǎng)120小時。

以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來說明本發(fā)明的有益效果：

實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明方法處理后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的性質(zhì)

1、實(shí)驗(yàn)材料

本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4處理后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

對照(一般培養(yǎng)獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞)，培養(yǎng)方法如下：其臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)同實(shí)施例1，獲得的p2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞匯合度達(dá)85％，用胰酶替代物trypleselect進(jìn)行消化；將6×10⁵個細(xì)胞重懸于18毫升含10％胎牛血清的dmem/df12培養(yǎng)基中；將細(xì)胞懸液平均接種至六孔板中的六孔中，每孔3毫升，培養(yǎng)72小時。

2、檢測方法

(1)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物鑒定

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3或者實(shí)施例4和對照六孔板中培養(yǎng)72小時的細(xì)胞用trypleselect消化收集后，于室溫500g離心5～10分鐘，收集細(xì)胞沉淀；

用含2％胎牛血清的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為3×10⁶個/毫升。

取1毫升單細(xì)胞懸液加入離心管中，分別按加入熒光標(biāo)記流式抗體：cd45，cd90，cd105及hla-dr于4℃避光孵育30分鐘。

含2％胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，500g離心5分鐘。

棄上清控干，加300微升磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，篩網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀檢測。

(2)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成軟骨分化鑒定

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4或?qū)φ罩辛装迕靠咨锨逦鼦墸⒂昧姿猁}緩沖液洗滌兩次；

將洗滌后的實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4或者對照中六孔板前三孔加入gibco公司成骨誘導(dǎo)液，后三孔加入gibco公司成軟骨誘導(dǎo)液，每3～4天換液一次；

21天后，吸除成骨誘導(dǎo)液上清，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后用4％多聚甲醛固定10分鐘，茜素紅染色5分鐘后用蒸餾水沖洗，鏡下觀察并拍照。

21天后，吸除成軟骨誘導(dǎo)液上清，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后用4％多聚甲醛固定10分鐘，經(jīng)0.1％鹽酸預(yù)處理5分鐘后磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，阿爾新藍(lán)溶液染色30分鐘后用蒸餾水沖洗，鏡下觀察并拍照。

(3)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老及凋亡檢測

衰老檢測：

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4或?qū)φ樟装逯信囵B(yǎng)72小時的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15分鐘；

吸除細(xì)胞固定液，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘；

吸除磷酸鹽緩沖液，每孔加入1毫升β-半乳糖苷酶染色工作液染色過夜；

顯微鏡下觀察并拍照。

凋亡檢測：

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4或?qū)φ樟装逯信囵B(yǎng)72小時的細(xì)胞用trypleselect消化收集后，于室溫500g離心5～10分鐘，收集細(xì)胞沉淀；

用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(4℃)重懸細(xì)胞一次，500g離心5～10分鐘，洗滌細(xì)胞

加入300微升的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞；

加入5微升的annexinv-fitc混勻后，避光，室溫孵育15分鐘，再加入5微升的碘化丙啶染色5分鐘用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)表面標(biāo)記物

原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在7-10天即可看到從組織塊邊緣爬出，所分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)為典型間充質(zhì)干細(xì)胞所呈的長梭形，培養(yǎng)出的細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物cd90和cd105，不表達(dá)cd45和hla-dr，如圖1所示。

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞72小時，較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞典型表面標(biāo)記物并未發(fā)生改變，如表1所示：

表1表面標(biāo)記物

(2)成骨和成軟骨分化鑒定

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在成骨誘導(dǎo)微環(huán)境中較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，成骨均明顯增強(qiáng)，如圖2所示；

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在成軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境中較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，成軟骨能力均明顯增強(qiáng)，如圖3所示；

(3)形態(tài)、衰老及凋亡檢測

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞72小時，較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)并未明顯改變，如圖4所示；

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞72小時，較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，并未引起臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老增加，如圖5所示；

本發(fā)明所提供的由dmem/f12添加重組人源腫瘤壞死因子α或重組人源白介素1β配制而成的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞72小時，較一般的dmem/f12培養(yǎng)基，并未引起臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡率上升，如圖6所示。

綜上，采用本發(fā)明方法體外處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞，移植入體內(nèi)后的成骨以及成軟骨能力明顯提高，而形態(tài)以及表面標(biāo)記物均未發(fā)生變化，免疫原性低，并且細(xì)胞本身的凋亡率和衰老率也沒有變化，作為種子細(xì)胞的應(yīng)用前景優(yōu)良。