本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，特別是涉及一種懸浮細胞株及其馴化方法。

背景技術：

動物細胞培養(yǎng)，特別是大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術已經(jīng)廣泛應用于包括單克隆抗體、疫苗、重組蛋白及基因工程藥物等生物制品的生產。大量的生物藥由于結構復雜，翻譯后修飾度高，真核表達系統(tǒng)特別是動物細胞表達系統(tǒng)由于糖基化水平高，翻譯后修飾程度最接近人類，已經(jīng)成為工業(yè)化生產生物藥的主要表達系統(tǒng)。由于大部分的動物細胞都具有貼壁培養(yǎng)特性，而工業(yè)化大規(guī)模生產過程中，廣泛使用的生物反應器級聯(lián)放大工藝要求細胞具有懸浮培養(yǎng)特性，以便于放大工藝的實現(xiàn)。因此，細胞的懸浮馴化變得不可或缺。

常規(guī)的細胞培養(yǎng)過程一般使用加血清的基礎培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)。血清的主要作用在于給細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養(yǎng)物質，但由于血清中所含的成分復雜，不同產地、批次之間存在質量差異，給動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝造成了諸多不利影響。同時，通過細胞培養(yǎng)獲得產物的過程，血清的存在是純化的主要障礙，甚至使產物難以成為醫(yī)藥產品。而無血清培養(yǎng)基就是在基礎培養(yǎng)基的基礎上，引入成分完全明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。

目前，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)工藝的發(fā)展趨勢是將動物細胞在無血清培養(yǎng)基中純懸浮培養(yǎng)。采用化學成分明確的無血清培養(yǎng)基有利于產品的質量控制和穩(wěn)定性，同時有利于下游的產物分離純化工作。懸浮培養(yǎng)的方式使生物反應器級聯(lián)放大變得更具有操作性。因此，對貼壁細胞進行無血清純懸浮馴化是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的基礎。但是，目前大部分細胞系仍然無法完全適應無血清懸浮培養(yǎng)。目前已懸浮馴化成功的細胞系主要有cho細胞、hek293細胞、bhk21細胞和vero細胞等，但整個馴化過程耗時較長，通常需要半年以上。

傳統(tǒng)上針對細胞懸浮馴化多采用先斷血清后懸浮馴化的方法，該方法是先將細胞在方瓶中逐漸完成至適應完全無血清培養(yǎng)的馴化過程后，再將已適應完全無血清培養(yǎng)基的細胞轉移到搖瓶中進行完全無血清培養(yǎng)基的懸浮馴化過程。但是，往往在方瓶中將血清含量由5％降至0％時，逐漸出現(xiàn)細胞生長速率變慢的現(xiàn)象，導致此馴化過程進展緩慢，馴化周期一般在6個月以上。血清每降一個梯度細胞往往需要適應5代以上的時間；特別是當血清含量降至1％至0％時，細胞貼壁性能下降，代謝緩慢，極易出現(xiàn)細胞成團死亡的情況導致馴化失敗。

技術實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種馴化周期較短的懸浮細胞株及其馴化方法。

實現(xiàn)上述目的的具體技術方案如下：

一種懸浮細胞株的馴化方法，包括如下步驟：

(1)復蘇細胞，將貼壁型細胞接種于含9.5％-10.5％血清的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)1-3次；

(2)將步驟(1)獲得的對數(shù)生長期的細胞接種于含有無血清培養(yǎng)基和含10％血清的完全培養(yǎng)基的第一混合液的方瓶中培養(yǎng)，所述第一混合液中的血清含量為4.5％-5.5％，傳代1-3次；

(3)將步驟(2)獲得的細胞轉移至含有所述無血清培養(yǎng)基和所述含10％血清的完全培養(yǎng)基的第二混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，所述第二混合液中的血清含量為3.0％-3.6％，傳代1-3次；

(4)將步驟(3)獲得的細胞轉移至含有所述無血清培養(yǎng)基和所述含10％血清的完全培養(yǎng)基的第三混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，所述第三混合液中的血清含量為1.8-2.2％，傳代1-3次；

(5)將步驟(4)獲得的細胞轉移至含有所述無血清培養(yǎng)基和所述含10％血清的完全培養(yǎng)基的第四混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，所述第四混合液中的血清含量為0.8-1.2％，傳代1-3次；

(6)將步驟(5)獲得的細胞轉移至所述無血清培養(yǎng)基的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，傳代1-3次，即得所述懸浮細胞株。

在其中一些實施例中，在步驟(1)中，所述貼壁型細胞為cho細胞。

在其中一個實施例中，在步驟(2)中，所述第一混合液中血清含量為4.9％-5.1％；

在步驟(3)中，所述第二混合液中血清含量為3.3％-3.5％；

在步驟(4)中，所述第三混合液中血清含量為1.9％-2.1％；

在步驟(5)中，所述第四混合液中血清含量為0.9％-1.1％

在其中一個實施例中，所述完全培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基為ex-cellcdcho無血清培養(yǎng)基。

在其中一個實施例中，在步驟(1)中，所述貼壁型細胞為hek293細胞、bhk21細胞或vero細胞。

在其中一個實施例中，所述完全培養(yǎng)基為dmem基礎培養(yǎng)基。

在其中一些實施例中，在步驟(1)中，所述貼壁型細胞的接種密度為1-5×10⁵個/ml，接種體積為5±0.5ml，每兩天傳代1次。

在其中一個實施例中，在步驟(2)中，所述對數(shù)生長期的細胞消化處理后，其接種密度為1-5×10⁵個/ml，接種體積為5±0.5ml，每兩天傳代1次。

在其中一個實施例中，在步驟(3)至(6)中，均采用半量換液的方法進行傳代培養(yǎng)，其中，傳代培養(yǎng)的細胞的接種密度為3-10×10⁵個/ml，培養(yǎng)體積為20±1.0ml，轉速為110-140rpm，每兩天傳代1次。

上述懸浮細胞株的馴化方法馴化獲得的懸浮細胞株。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的懸浮細胞株的馴化方法，首先將貼壁型細胞9.5％-10.5％血清的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)1-3次進行復蘇，再將其接種于含4.5％-5.5％血清的培養(yǎng)基的方瓶中傳代培養(yǎng)1-3次能夠使其適應血清含量較低的培養(yǎng)環(huán)境及部分無血清培養(yǎng)基環(huán)境，再將其從方瓶中轉移接種到血清含量依次為3.0％-3.6％、1.8％-2.2％和0.8％-1.2％的培養(yǎng)基的搖瓶中進行懸浮培養(yǎng)后，再轉移至無血清培養(yǎng)基的搖瓶中傳代培養(yǎng)1-4次，在搖瓶中的整個馴化培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)基中溶解氧的改善及營養(yǎng)物質的流動性好可使細胞保持較強的代謝，迅速適應無血清培養(yǎng)基及懸浮培養(yǎng)環(huán)境，并使馴化獲得的細胞不易聚團、死亡量小，使整個馴化過程順暢。相對于傳統(tǒng)馴化方法，本發(fā)明的懸浮細胞株的馴化方法在降血清含量的同時進行懸浮馴化培養(yǎng)，每個血清梯度對應的細胞傳代次數(shù)保持在1-3次即可，整體上控制貼壁型細胞的馴化周期在一個月內完成，顯著縮短馴化周期，節(jié)省馴化成本，可用于后續(xù)的工業(yè)化大規(guī)模生產。

本發(fā)明的懸浮細胞株的馴化方法獲得的懸浮細胞株的分散性好、活率高。

附圖說明

圖1為實施例1的馴化前的貼壁型cho-k1細胞株的顯微圖片；

圖2為實施例1的馴化后的無血清懸浮型cho-k1細胞株的顯微圖片；

圖3為實施例1的cho-k1細胞株的馴化前后的細胞生長曲線圖。

具體實施方式

以下結合具體實施方式對本發(fā)明做進一步地闡述。

一實施方式的懸浮細胞株的馴化方法，包括如下步驟：

(1)復蘇細胞，將貼壁型細胞接種于含9.5％-10.5％血清的完全培養(yǎng)基的t25方瓶中，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，傳代培養(yǎng)1-3次，以恢復凍存期間的細胞損傷以達到最佳生長狀態(tài)。其中，優(yōu)選地，貼壁型細胞的接種密度為1-5×10⁵個/ml，接種體積為5±0.5ml，每兩天傳代1次，使細胞密度達1.2×10⁶個/ml以上。

在本實施例方式中，具體地，貼壁型細胞可以為cho、hek293、bhk21及vero等工業(yè)化常用的細胞。

(2)將步驟(1)獲得的對數(shù)生長期的細胞消化處理后，接種含有無血清培養(yǎng)基和含10％血清的完全培養(yǎng)基的第一混合液的t25方瓶中，第一混合液中的血清含量為4.5％-5.5％，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，傳代培養(yǎng)1-3次。在該步驟中，優(yōu)選地，接種密度為1-5×10⁵個/ml，接種體積為5±0.5ml，每兩天傳代1次，使細胞密度達1.2×10⁶個/ml以上。

該步驟可以使待馴化的貼壁型細胞適應血清含量較低的無血清培養(yǎng)環(huán)境，以利于后續(xù)的搖瓶馴化培養(yǎng)過程。

(3)將步驟(2)獲得的細胞轉移至含有無血清培養(yǎng)基和含10％血清的完全培養(yǎng)基的第二混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，第二混合液中的血清含量為3.0％-3.6％，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，采用半量換液的方法傳代1-3次。

(4)將步驟(3)獲得的細胞轉移至含有無血清培養(yǎng)基和含10％血清的完全培養(yǎng)基的第三混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，第三混合液中的血清含量為1.8％-2.2％，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，采用半量換液的方法傳代1-3次。

(5)將步驟(4)獲得的細胞轉移至含有無血清培養(yǎng)基和含10％血清的完全培養(yǎng)基的第四混合液的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，第四混合液中的血清含量為0.8-1.2％，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，采用半量換液的方法傳代1-3次。

(6)將步驟(5)獲得的細胞轉移至無血清培養(yǎng)基的搖瓶中懸浮馴化培養(yǎng)，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，采用半量換液的方法傳代1-3次，即得懸浮細胞株。

在本實施方式中，優(yōu)選地，在步驟(3)至(6)中，傳代培養(yǎng)的細胞的接種密度為3-10×10⁵個/ml，培養(yǎng)體積為20±1.0ml，轉速為110-140rpm，每兩天傳代1次。

相對傳統(tǒng)馴化方法，本實施方式的懸浮細胞株的馴化方法在降血清含量適應無血清培養(yǎng)基環(huán)境的同時進行懸浮馴化培養(yǎng)，在懸浮培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中溶解氧含量較大且營養(yǎng)物質的流動性好，可使細胞保持較強的代謝，每個血清梯度對應的細胞傳代1-3次即可，整體上控制貼壁型細胞的馴化周期在一個月內完成，顯著縮短馴化周期，節(jié)省馴化成本，可用于后續(xù)的工業(yè)化大規(guī)模生產。

下面進一步結合具體實施例對本發(fā)明的懸浮細胞株的馴化方法做進一步說明。

實施例1

本實施例提供一種cho-k1細胞(購自atcc，初始的cho-k1細胞在含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng))的懸浮細胞株的馴化方法，包括如下步驟：

(1)復蘇細胞：將cho-k1細胞以3×10⁵個/ml(共5ml)的密度接種于含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的t25方瓶中，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，傳代2次，以恢復凍存期間的細胞損傷，使細胞達到最佳生長狀態(tài)，每2天傳代1次，細胞密度在1.2×10⁶個/ml以上。

(2)將步驟(1)中獲得的對數(shù)生長期的細胞，采用胰酶消化分散成單個細胞，終止消化后，以3×10⁵個/ml(共5ml)的密度接種至體積比為1:1的無血清培養(yǎng)基(購自sigma公司生產的ex-cellcdcho無血清培養(yǎng)基)和含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的方瓶中，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，繼續(xù)傳代2次，每2天傳代1次，細胞密度在1.2×10⁶個/ml以上。

(3)將步驟(2)獲得的對數(shù)生長期的細胞轉移到體積比2:1的無血清培養(yǎng)基和含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的搖瓶(125ml搖瓶，培養(yǎng)體積20ml)中進行懸浮培養(yǎng)，細胞接種密度為6×10⁵個/ml，于溫度37±0.5℃、濕度100％及5％co2的條件下，125±5rpm，采用半量換液的方法傳代3次，每2天傳1代，進行懸浮馴化。當細胞出現(xiàn)極少量聚團時，每次傳代時采用20g低速離心去除成團細胞。當細胞分散良好，活率高于90％時，凍存部分細胞。

(4)將步驟(3)獲得的細胞轉移到體積比4:1的無血清培養(yǎng)基和含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的搖瓶(125ml搖瓶，培養(yǎng)體積20ml)中進行懸浮培養(yǎng)，細胞接種密度為6×10⁵個/ml，于溫度37℃、濕度100％及5％co2的條件下，125±5rpm，采用半量換液的方法傳代2次，每2天傳1代，當細胞出現(xiàn)極少量聚團，每次傳代時采用20g低速離心去除成團細胞。

(5)將步驟(4)獲得的細胞轉移到體積比9:1的無血清培養(yǎng)基和含10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基的搖瓶(125ml搖瓶，培養(yǎng)體積20ml)中進行懸浮培養(yǎng)，細胞接種密度為6×10⁵個/ml，125±5rpm，于溫度37℃、濕度100％及5％co2的條件下，采用半量換液的方法傳代2次，每2天傳1代，當細胞出現(xiàn)極少量聚團，每次傳代時采用20g低速離心去除成團細胞。

(6)將步驟(5)獲得的細胞轉移到無血清培養(yǎng)基的搖瓶(125ml搖瓶，培養(yǎng)體積20ml)中進行懸浮培養(yǎng)，細胞接種密度為6×10⁵個/ml，于溫度37℃、濕度100％及5％co2的條件下，125±5rpm，采用半量換液的方法傳代3次，每2天傳1代，當細胞出現(xiàn)極少量聚團，每次傳代時采用20g低速離心去除成團細胞，即得無血清懸浮型cho-k1細胞株。該無血清懸浮型cho-k1細胞株可用于后續(xù)的工業(yè)化大規(guī)模生產。

由圖1和圖2可知，本實施例的cho-k1細胞在馴化之前細胞貼壁生長，呈梭形。采用本實施例的馴化方法獲得的無血清懸浮型cho-k1細胞呈球形，分散性好，細胞透亮，且活率高于90％。進一步結合圖3，本實施例獲得的無血清懸浮型cho-k1細胞株的生長速率比貼壁型cho-k1細胞略高，適用于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。

此外，本申請采用了與實施例1相同的馴化方法還對貼壁型的hek293細胞株、bhk細胞株和vero細胞株進行馴化，其中除采用的無血清培養(yǎng)基為市售的相應細胞的商品化無血清培養(yǎng)基及采用的含完全培養(yǎng)基為含10％fbs的dmem培養(yǎng)基外，其余馴化條件均與實施例1相同，同樣在1個月內馴化獲得了無血清懸浮型hek293細胞株、無血清懸浮型bhk21細胞株和無血清懸浮型vero細胞株，且獲得的對應的懸浮細胞株的細胞分散性良好且活率高于90％，細胞生長速率高，適用于后續(xù)的工業(yè)化大規(guī)模生產。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。